专利名称：治疗血友病b的基因药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及治疗血友病B的基因药物及其制备方法。
血友病B又称乙型血友病，是一种凝血Ⅸ因子(PⅨ)缺陷引起的X连锁隐性遗传的出血性疾病，在男性中发病率为1/30000。
FⅨ是内源性凝血级联反应过程中必需的蛋白因子，当FⅨ与调控蛋白FⅧ形成复合物后，使内源性凝血级联反应速度成千倍增加，至使凝血过程仅在几分钟内即可完成。因此，当人体内缺乏FⅨ时，便表现为自发性或微外伤后出血不止，严重者可因关节出血而导致关节变形和残废或因内脏或颅内出血而死亡。编码FⅨ蛋白的基因于1982年被克隆，它位于Xq27.1带，共8个外显子，编码区全长1.383kb，编码415个氨基酸。(Choo KH,Gould KG,ReesDJ,et al.Nature 1982；299:178-180；Kurachi K,Davie EW.ProcNatl Acad Sci USA 1982；79:6461-6464.)成人的FⅨ蛋白分子量为56KD，在正常血浆中含量为5μg/ml(Kaufman RJ.Human GeneTherapy 1999；10:2091-2107.)。血友病B的临床治疗仅限于蛋白替代治疗即靠输血，或补充FⅨ浓缩制剂。但由于FⅨ在人体内半衰期仅24小时，患者需要反复输血或血液制品来维持生命，不仅要承受沉重的经济负担，而且还面临艾滋病病毒、乙肝病毒和疯牛朊病毒感染的威胁。
如何将正常FⅨ基因导入患者体内以替代缺陷的FⅨ基因是血友病B基因治疗中遇到的最关键的问题。目前用于FⅨ基因治疗研究的载体主要为病毒性载体，如逆转录病毒载体，腺病毒载体及腺相关病毒载体。逆转录病毒载体虽能稳定地整合到靶细胞的基因组中，但其只能感染分裂细胞，且存在插入诱变等安全隐患；腺病毒载体体内外感染效率高，而且能感染非分裂细胞，但其受到免疫原性的影响使导入的基因不能长期表达；腺相关病毒载体能有效感染体内各种细胞，也能使导入的基因长期表达，但它仍未能解决插入诱变的安全性问题。因此近十年来，尽管在血友病B的基因治疗方面采取了许多改进措施，但至今仍未得到安全的、稳定的、一次性治疗的基因药物，关键问题就在于还没找到一种安全性好、无免疫原性、能高效转化靶细胞并在靶细胞中长期稳定表达治疗基因的载体。
本发明的目的是提供一种安全、能使治疗基因在靶细胞中稳定表达的治疗血友病B的基因药物。
本发明的另一目的是提供一种制备上述基因药物的方法。
本发明提供的治疗血友病B的基因药物，含有以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列所构建的基因载体-FⅨ重组体，含基因载体-FⅨ重组体的菌株已于2000年9月29日(2000.9.29)向中国典型培养物保藏中心提出保藏(中国.武汉武汉大学校内，邮政编码430072)，其保藏号是CCTCCM200031。保藏人对保藏物指定的分类命名为Escherichia coli JM109/JH-4/pNS-FⅨ。
本申请人发现2个携带额外双随体小染色体(BM)而表型正常的家系，该小染色体分别在2个家系的2代人和3代人之间稳定遗传，且对人体无任何危害。因此本发明人提出了分离该小染色体原件、组装人源基因载体的方案。国内外至今已报导这类家系17个，但没有人提出利用该小染色体作为基因载体的类似设想。在研究中申请人用FISH技术查明，该小染色体来源于人的D、G组染色体短臂即13、14、15、21、22号染色体短臂，由于D、G组染色体短臂为核仁组织区，富含核糖体DNA(rDNA)，该区域不但在人群中存在着长度不同的各种多态(即含rDNA的量有多有少)，而且在细胞分裂间期该区域基因转录十分活跃，因此，本发明人推测如果能从BM克隆出具有特异性的DNA片段，并以其作为治疗基因的引导序列，将治疗基因定点导入人体D、G组染色体短臂核仁组织区，应该有较高的、稳定的和无害的表达。后续的实施例对此作出了有力的证明。
本发明人首先利用显微切割的方法，构建了小染色体特异性的pUC19文库并从中筛选得到单拷贝片段，该片段经荧光原位杂交(FISH)证实来源于小染色体和D、G组染色体短臂，进一步以此单拷贝片段为探针筛选人PAC基因组DNA文库，获得了约120kb的小染色体特异性DNA片段(BMSF)，并经FISH证实来源于小染色体和D、G组染色体短臂(
图1)。测序分析BMSF的序列特性，未发现与重要生理功能相关的基因，因此证明，以此为靶位点是安全的。本发明进一步利用120kb或从中选择更小的具有特异性的DNA片段，构建基因载体。
因此本申请人认为基因引导序列选自人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列是符合发明目的的。由此构建的基因载体具有特异性，能将治疗基因定点导入到人D、G组染色体短臂上，并高效稳定表达。
在所制备的药物中，还可含有有利于治疗基因导入宿主细胞的辅助成份，如脂质体、对宿主细胞有特异性的蛋白质。
本发明实施例中具体给出了序列表1表示的载体-FⅨ重组体，其中3.8kb引导序列来源于BMSF，利用TK作为负筛选基因，将正筛选基因Neo基因插入治疗基因引导序列中的1500位，使其分为1.5kb和2.3kb两臂，FⅨ治疗基因的插入位点为5910位。治疗基因的插入有正反向之分，本发明实施例中为反向插入。
在获得治疗基因引导序列的基础上，按现有技术可构建各种形式的载体。构建载体和将治疗基因装入载体的方法是通常的方法。
本发明实施例中具体给出了从人D、G组染色体短臂上克隆得到的具有特异性的3.8kb DNA序列作为治疗基因引导序列，并构建载体的过程。
得到上述携带治疗基因的载体后，可进一步将其导入人离体细胞中，同样可作为治疗血友病B的基因药物。
这样，将含上述转化后的人离体细胞或含有承载有治疗基因的载体的基因药物通过皮下包埋、电穿孔或静脉注射等方式导入患者体内或将载体-FⅨ重组体用脂质体包裹直接注入患者体内，使治疗基因能在患者体内长期稳定表达，以纠正缺陷基因导致的临床症状。
由于本发明提供的治疗血友病B的基因药物中，以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列，来构建基因载体。毫无疑问，由其构建的基因载体能将其上承载的治疗基因定点导入宿主细胞中特定靶位，并且由于该特定靶位的DNA片段不具有重要的生理功能相关的基因，因此治疗基因的导入是安全的。
综上所述，本发明提供的治疗血友病B的基因药物中由于采用了人源基因引导序列来构建承载治疗基因的载体，因而(1)治疗基因表达稳定性好由于承载治疗基因的载体能将治疗基因定点插入到人体细胞的D组和G组染色体短臂上，所以使治疗基因随染色体而稳定遗传；(2)安全性好由于在治疗基因导入的靶位点不含有与重要生理功能相关的基因，证明该靶位点安全，同时FISH证实载体能将治疗基因定点插入细胞中安全的靶位点(图3)，排除了随机插入突变，也不存在野生型病毒的危害。所以治疗基因在靶位点的表达是安全的。虽然本发明没有提供基因治疗的临床证明，但申请人及国内外研究者发现的实例从另一角度证明了其安全性(实施例4)；(3)表达效率高第一，由于本发明承载治疗基因的载体含有来源于D、G组染色体短臂的引导序列，因此对应地在人体细胞中存在10个靶位点，插入效率比其它载体至少高5-10倍；第二，由于引导序列来自于基因转录活跃的D、G组染色体短臂，引导进入靶位点的治疗基因能得到高效表达；(4)无免疫原性由于该载体为人源性的，因此用于人体不会产生免疫原性。
图1是120kb BMSF的FISH定位图；图2是本发明提供的一种基因载体-FⅨ重组体的结构图(基因载体序列全长13928bp)；其中pGEM -7(11033-13928)载体复制元件及原核筛选系统；TK(1-2840)真核细胞负筛选基因，该基因使用TK启动子和TK polyA信号；Neo(4342-5910)真核细胞正筛选基因，该基因使用sv40启动子和sv40 polyA信号；FⅨ(5911-8677)FⅨ治疗基因，该基因使用CMV启动子和BGHpolyA信号；GLS(2841-4341,8678-11032)治疗基因引导序列；Cloning site(5910)治疗基因插入位点。
图3是外源性FⅨ治疗基因在阳性细胞克隆中的FISH定位，证明该载体能将FⅨ定点导入D、G组染色体短臂；图4是FⅨ阳性细胞Western结果，F3～F23为6个不同阳性细胞株，“一”示阴性对照。
本发明提供的实施例只是实现本发明的一种方式，不能视为对本发明的限制。
实施例1本发明提供的基因引导序列的制备1．基因引导序列PAC克隆的获得1.1显微切割、PCR、微克隆构建BM特异性pUC19文库(DengH-X,Yoshiura K,Dirks RW,et al.Hum Genet 1992,89:13.)1.2BM特异性单拷贝DNA的获得及鉴定(1)菌落点阵膜的制备在两张尼龙膜上划好14×14个方格，标记为A、B，分别置于2个有固体LB的平皿中，从文库皿中随机挑取白色克隆分别点到两张膜坐标相同的方格内，共挑14×12个，第13行点100ng单拷贝DNA做阳性对照，第14行点100ng gDNA做为阴性对照，两个皿分别置37℃培养10～12小时，其中B膜置4℃保存，将A膜从皿中取出，分别在用以下溶液浸湿的滤纸上处理，10％SDS,5分钟，0.5N NaOH/1.5M NaCl,3分钟，1.5M NaCl/0.5MTris·HCl,3分钟，2×SSC/0.2M Tris·HCl,10分钟，80℃真空干燥2小时，37℃保存待用。
(2)gDNA探针的制备取50～75ng gDNA加无菌水至11ml,100℃煮沸变性10分钟，以下列体系做随机引物标记反应2mM dNTP(dATP-) 3μlprimer mixture 2μlKlenow酶 1μlα-32p-dATP 3μl点离混匀，37℃浮浴30分钟。加8μl stopmixture，过G-50柱纯化探针，取1/100测液闪值。
(3)杂交菌落点阵膜置于2×SSC中浸泡10分钟，轻轻拭去膜表面的菌落碎片，65℃,5ml杂交液预杂交，30分钟以上。根据液闪值，按1.2×106cpm/ml杂交液的量取探针液于100℃煮沸变性10分钟，加入5ml新鲜杂交液，与菌落点阵膜65℃杂交12小时以上。按以下条件洗膜2×SSC/0.1％SDS，室温10分钟，2×SSC/0.1％SDS,65℃10分钟，0.1×SSC/0.1％SDS,65℃10分钟，-70℃放射自显影，杂交信号无或弱的初步认为是单拷贝。
(4)测序，Southern杂交鉴定在B膜上相应位置挑取无杂交信号的克隆，小量扩增，抽提质粒DNA测序，与GenBank数据库比较，无相似性的为单拷贝。最后EcoRⅠ酶切分离插入子DNA，并以随机引物法，用α-32p-dATP标记并与EcoRⅠ消化的gDNA转移尼龙膜杂交，方法同上，1条或2条杂交带的为单拷贝。
1.3BM及D、G组染色体短臂特异性PAC克隆的获得及鉴定(1)筛选人PAC gDNA文库获得阳性克隆编号利用α-32p-dATP随机引物法标记260bp的单拷贝探针P8-7→G-50柱(中等粒度)纯化→4℃待用→PAC膜7张用2×SSC浸泡10分钟→55℃预杂交3小时→探针100℃变性10分钟→以4.6×105cpm/ml的量加入50ml购买的杂交液中，与PAC膜于65℃杂交1小时→洗膜2×SSC，室温10分钟一次，2×SSC/0.1％SDS 65℃10分钟洗2次→上X光片，-70℃放射自显影12小时→冲洗X光片→按说明书方法读取阳性克隆编号。
(2)从5个不同的板上随机挑选阳性克隆编号，购买PAC克隆。
1.4 PAC DNA与中期相细胞FISH杂交，证实来源于D、G组染色体短臂，如图1所示。
上述实验方法参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克等，第2版，1989冷泉港实验室出版。(J.Sambrook et al.Molecular Cloning.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)2．基因引导序列DNA的获得主要材料β-agarose(Bio-Labs)NotⅠ Agarose①NotⅠ酶切PAC169质粒；②通过PFGE分离约120Kb大小的插入子DNA；脉冲电泳条件电极缓冲液0.5×TBE、High stregth AnalyticalGrade Agarose:(Bio-Rad,Low Melting point Agarose LMP)1％、SwitchTime:2秒→15秒电泳时间18小时，电压6V/cm，角度120。温度14℃③电泳结束后，用EB染色(0.2μg/ml)30分钟，根据Marker指示，用无菌小刀片切下约3.8kb(120kb)的条带。
④切下的胶块用β-agarase处理，乙醇沉淀。
实施例2本发明提供的基因载体-FⅨ重组体，即治疗血友病B的基因药物的制备1．基因载体的构建及治疗基因的导入1.1载体的构建1.1.1用NsiⅠ和StuⅠ(平端酶)酶切PAC DNA，普通琼脂糖凝胶回收3.8kbDNA片段，电洗脱纯化；1.1.2用HindⅢ酶切pGEM-TK载体DNA，Klenow酶补平，产生一平头末端；1.1.3 pGEM-TK/HindⅢ补平产物进一步用NsiⅠ酶切；1.1.4 3.8kb/NsiⅠ+StuⅠ纯化产物与pGEM-TK/HK+NsiⅠ酶切产物于16℃连接17小时；
1.1.5连接产物转化JM109感受态细菌，氨苄皿37℃培养18小时；1.1.6随机挑取单克隆，用NsiⅠ及NheⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
1.1.7用XbaⅠ和NheⅠ双酶切pCDN-GPR质粒获得Neo/XbaⅠ+NheⅠ1.1.8将Neo/XbaⅠ+NheⅠ与pGEM-TK-3.8kb/NheⅠ连接，构建成pNS2基因载体。
1.2 FⅨ的导入1.2.1将FⅨ(CDS)克隆至pcDNA 3.1(-)；1.2.2设计引物TPCF和TPCR扩增FⅨ基因及表达元件(CMV启动子和BGH poly A信号)，使其两端装上AvrⅡ酶切位点；引物序列为TpcF:ATgCATCCTAggggAggTCgCTgAgTAgTgAvrⅡTpcR:TgCATgCCTAggTACCCCCTAgAgCCCAgAvrⅡ1.2.3用AvrⅡ酶切FⅨ基因及表达元件(CMV启动子和BGHpolyA信号)并与NheⅠ酶切的pNS2载体连接。
1.2.4连接产物转化JM109大肠杆菌，获得含载体-FⅨ重组体的菌株(保藏号为CCTCC M200031)。
上述实验方法详见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克等，第2版，1989冷泉港实验室出版。(J.Sambrook et al.Molecular Cloning.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)2.基因载体DNA的抽提2.1材料2.1.1QIAGE Plasmid Maxi Kit2.1.2培养基液体LBTrypton 5gYeast extract 2.5gNacl 2.5gddH2O 定量至500ml高压蒸汽灭菌
2.1.3氨苄青霉素(Amp)100mg/ml(1000×)2.2方法1)挑取阳性单克隆至3ml LB(Amp+)37℃,250rpm培养1小时2)取100μl上述初级培养物置100ml LB(Amp+)中，37℃，250rpm培养16小时3)于4℃,6000g离心15分钟收获细菌4)10mlBuffer Pl重悬菌体5)加入10ml Buffer P2，轻柔地倒转6次混匀，室温5分钟。
6)加入10ml冰上预冷Buffer P3，轻柔倒转6次混匀，冰上20分钟。
7)4℃,20000g离心30分钟。
8)迅速将上清转移至另一40ml高速离心管，4℃,20000xg再次离心15分钟9)10mlBufferQBT平衡QIGENtip 50010)将上清转移至QIGAE tip 500过柱11)2×30ml Buffer QC 先柱12)15ml BufferQF洗脱，收集洗脱液13)洗脱液加(0.7倍体积)10.7ml异丙醇，混匀14)15000g,4℃，离心30分钟15)去上清，DNA沉淀加入5ml 70％乙醇洗涤，15000g,4℃离心10分钟16)去70％乙醇，空气中干燥10分钟适量TE溶解DNA沉淀实施例3利用实施例2得到的基因载体-FⅨ重组体，将FⅨ治疗基因导入宿主细胞，并在宿主细胞中表达，导入的HT1080细胞株已于2000年8月18日向中国典型培养物保藏中心提出保藏(中国.武汉武汉大学校内，邮政编码430072)，其保藏号是CCTCC C200005。该保藏物的名称是人纤维肉瘤细胞系，为人的转基因细胞。保藏人对保藏物指定的分类命名为人纤维肉瘤细胞系/JH-1/FⅨ。
1．材料1.1细胞HT1080培养基高糖DMEM+10％FBS(HT1080)EMEM+10％FBS1.2电穿孔仪Bio-Rad公司2．方法1)细胞于75cm2培养瓶内传代后长至70％～80％满底2)收获细胞，用HeBs缓冲液洗2次，计数细胞3)15000rpm,4℃离心10分钟4)适量HeBS重悬，使细胞浓度为106～107/ml5)取0.4ml电击杯，每杯加细胞悬液0.8ml，载体DNA 10μg左右6)用电穿孔仪进行电击，电击条件设定为电压260V，电容550μF，电击时间一般为11～13毫秒。
7)电击细胞转入75cm2培养瓶中，加14ml含双抗的培养基，37℃,5％CO2中培养，24～48小时。
8)培养基内加入终浓度300μl的G418进行筛选，2～3天换液一次，换液时重新加G3418，同时用正常细胞做对照9)约7～10天后正常细胞全部死亡，计数转染细胞内存活克隆数，改用维持量G418 150μg/ml10)转染细胞继续用终浓度为500ng/ml的GCV进行筛选11)7～10天大部分克隆死亡，剩余存活细胞改用维持量GCV250μg/ml或不加经过筛的细胞长至70～80％满底后，测定转移基因的表达活性。
3．结果利用该载体将FⅨ基因用电穿孔的方法导入HT1080细胞，经正、负筛选得到阳性细胞株，FISH证实为定点插入(图3)。
FⅨ活性由阴性对照的低于0.1μg/ml升高到4.27μg/ml，而且转化后144天表达量仍为3.15/μg/ml，见表l。其表达产物通过Western杂交证实(图4)。
表1 FⅨ活性测定(μg/ml/105细胞/24小时)
转化后天数克隆F2335天 4.2772天 4.39100天4.6111天3.95139天4.0144天3.15实施例4在人群中存在的安全性实例从1973年夏家辉从事人类与医学细胞遗传学研究以来，所发现和鉴定的来自全国189个实验室的470位临床细胞遗传学工作者所申报的732种世界首报核型中，有41种核型涉及D、G组染色体短臂，但不论易位到D、G染色体短臂的片段来源于1-22号哪一号染色体，或源于同一号染色体的片段长短各异，所含基因从1个到上千个，而携带者本人的表型都是正常的，说明易位到D、G染色体短臂的基因能正常表达，据此，我们将D、G组染色体短臂作为基因治疗的靶位点应该是安全的。1、核型46,XX,t(1；12；22；15；11；8)(1qter→1p11::8p23→8pter；12pter→12q11::1p11→1pter；22qter→22p11::12q11→12qter；15pter→15q15::22p11→22pter；11pter→11q21::15q15→15qter；8qter→8p23::11q21→11qter)。表型女，28岁，为表型正常的携带者资料提供者吴素彬，广东省广州市，中山医科大学附一院妇产科细胞遗传室，邮政编码5100802、核型46,XY,t(1；13)(1pter→1q32::13p11→13pter；13qter→13p11::1q32→1qter)．表型女，24岁，为表型正常的携带者资料提供者肖晟，哈尔滨医科大学生物教研室，邮政编码1500863、核型46,XX,t(2；15)(2pter→cen→15qter；2qter→cen→15pter)。表型女，26岁，为表型正常的携带者资料提供者郭裕萍等，江西省南昌市，江西省妇产科医院细胞遗传室，邮政编码3300064、核型46,XY,t(2；21)(2pter→cen→21pter；2qter→cen→21qter)。表型男，32岁，为表型正常的携带者资料提供者康过秦等，山西省太原市，山西医学院附二院遗传研究室，邮政编码0300015、核型46,XY,t(3；22)(3qter→cen→22pter；3pter→cen→22pter)。表型男，26岁，为表型正常的携带者资料提供者高永，山东省滨州市医学院毒理室，邮政编码2566036、核型46,XY,t(3；22)(3pter→cen→22qter；3qter→cen→22pter)。表型男，29岁，为表型正常的携带者资料提供者石化金等，辽宁锦州市妇婴医院遗传室，邮政编码1210007、核型46,XX,t(4；15)(4qter→4p13::15p13→15pter；15qter→15p13::4p13→4pter)。表型女，28岁，为表型正常的携带者资料提供者周玲等，湖北省武汉市，武汉市儿童医院遗传实验室，邮政编码4300168、核型46,XY,t(4；21)(4qter→4p15::21p11→21pter；21qter→21p11::4p15→4pter)。表型男，25岁，为表型正常的携带者资料提供者徐竞芳等，上海市第六人民医院遗传室，邮政编码2000009、核型46,XY,t(4；14)(4pter→4q31::14p11→14pter；14qter→14p11::4q31→4qter)。表型男，为表型正常的携带者资料提供者周明君等，河志省许昌市中心医院，邮政编码16100010、核型46,XY,t(4；14)(4pter→4q35::14p11→14pter；14qter→14p11::4q35→4qter)。表型男，27岁，为表型正常的携带者资料提供者张秀泉等，广东省佛山市，佛山市妇幼保健院，邮政编码52800011、核型46,XX,t(5；22)(5pter→5q13::22p11→22pter；22qter→22p11::5q13→5qter)。表型女，32岁，为表型正常的携带者资料提供者曹建萍，河南安阳市妇幼保健院遗传室，邮政编码45500012、核型46,XY,t(6；22)(6pter→cen6→22qter；6qter→cen22→22pter)表型男，25岁，为表型正常的携带者资料提供者祝新霞等，山东省泰安市，山东泰安第88医院妇产科细胞遗传室，邮政编码27100013、核型46,XY,t(6；22)(6qter→6p21::22p11.2→22pter；22qter→22p11.2::6p21→6pter)。表型男，33岁，为表型正常的携带者资料提供者杨兰青，山东省滨州市滨州医学院附属医院妇产科，邮政编码25660314、核型45,XX,t(7；21)(7qter→7p22::21p12→21qter)。表型女，23岁，为表型正常的携带者资料提供者孙吉庆等，湖北省武汉市，湖北省武汉市儿童医院医学遗传实验室，邮政编码43001615、核型46,XY/46,XY,t(7；14)(7pter→7q11::14p11→14pter；14qter→14p11::7q11→7qter)表型男，28岁，为表型正常的携带者资料提供者李麓芸、夏家辉等，湖南省长沙市，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码41007816、核型46,XY,t(8；14)(8qter→8p21::14p12→14pter；14qter→14p12::8p21→8pter)表型男，27岁，为表型正常的携带者资料提供者石化金等，辽宁锦州市妇婴医院遗传室，邮政编码12100017、核型46,XY,t(9；14)(9pter→cen→14pter；9qter→cen→14qter)表型男，28岁，为表型正常的携带者资料提供者程秋云等，衡阳医学院附一生殖医学研究室，邮政编码42100118、核型46,XX,t(9；22)(9pter→9p13::22p12→22pter；22qter→22p12::9p13→9pter)mat表型女，31岁，其母、1妹、1弟、1子具有相同核型，同为表型正常的携带者资料提供者李麓芸，夏家辉等，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码41007819、核型46,XX,t(9；14)(9pter→9q12::14p12→14pter；14qter→14p12::9q12→9qter)表型女，32岁，为表型正常的携带者资料提供者孙艳阳等，黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学生物教研室，邮政编码15008620、核型46,XX,t(9；15)(9pter→9q21::15p12→15pter；15qter→15p12::9q21→9qter)mat。表型女，36岁，为表型正常的携带者资料提供者朱桂珍等，山东省泰安市，山东泰安第88医院妇产科细胞遗传室，邮政编码27100021、核型46,XX,t(10；13)(10pter→10q24::13p11→13pter；13qter→13p11::10q24→10qter)。表型女，28岁，为表型正常的携带者资料提供者严敦清，青岛医学院附属医院妇产科研究室，邮政编码26600322、核型46,XX,t(10；13)(10pter→10q24::13p12→13pter；13qter→13p12::10q24→10qter)。表型女，29岁，为表型正常的携带者资料提供者张影如等，广东省广州市，中山医科大学附一院神经科，邮政编码51008023、核型46,XX,t(11；14)(11pter→cen→14pter；11qter→cen→14qter)表型女，2岁，为表型正常的携带者资料提供者王志勇，河南省柘城县，柘城县人民医院遗传室，邮政编码47620024、核型46,XX,t(11；21)(11pter→11p11::21p11→21pter；21qter→21p11::11p11→11pter)。表型女，26岁，为表型正常的携带者资料提供者郑军等，陕西省西安市，陕西省妇幼保健院医学遗传实验室，邮政编码71000325、核型46,XY,t(11；15)(11pter→11q13::15p12→15pter；15qter→15p12::11q13→11qter)表型男，23岁，为表型正常的携带者资料提供者杨瑞芳等，山东医科大学附属医院围产医学中心，邮政编码25001226、核型46,XX,t(12；14)(12pter→cen→14pter；12qter→cen→14qter)表型女，28岁，为表型正常的携带者资料提供者韩维田等，辽宁省计划生育科研所优生研究室，邮政编码11003127、核型46,XX,t(13；16)(13qter→13p11::16p11.2→16pter；16qter→16p11.2::13p11→13pter)。表型女，27岁，为表型正常的携带者资料提供者安松兰，辽宁省大连市，大连市妇产医院遗传室，邮政编码11007828、核型46,XY/45,XY,t(13；13)(13qter→13p12::13p12→13qter)。表型男，39岁，为表型正常的携带者资料提供者李麓芸、夏家辉等，湖南省长沙市，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码41007829、核型46,XY,t(14；18)(14pter→cen→18pter；14qter→cen→18qter)表型男，30岁，为表型正常的携带者资料提供者王素桂等，北京市计划生育技术指导所，邮政编码10000630、核型46,XX,t(14；15)(14pter→14q13::15p13→15pter；15qter→15p13::14q13→14qter)表型女，28岁，为表型正常的携带者资料提供者李麓芸，夏家辉等，湖南省长沙市，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码41007831、核型45,XX,t(15qter→cen→22qter)。表型女，27岁，为表型正常的携带者资料提供者夏家辉等，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室，邮政编码41007832、核型46,XY,t(15；18)(15pter→cen→18pter；15qter→cen→18qter)。表型男，30岁，为表型正常的携带者资料提供者任国庆等，北京市计划生育技术指导所，邮政编码10000633、核型46,XX,t(15；20)(15pter→cen→2pter；15qter→cen→2qter)表型女，26岁，为表型正常的携带者资料提供者王新等，湖南医科大学附二医院妇产科遗传室，邮政编码41001134、核型46,XX,t(15；22)(15pter→15q11::22p13→22pter；22qter→22p13::15q11→15qter)。表型女，27岁，为表型正常的携带者资料提供者符生苗，海南省海口市，海南省人民医院遗传室，邮政编码57001135、核型46,XX,t(15；22)(15pter→15q22::22p11→22pter；22qter→22p11::15q22→qter)表型女，29岁，为表型正常的携带者资料提供者李牧尧等，新疆乌鲁木齐，新疆医学院医学遗传室，邮政编码83005436、核型46,XY,t(16；21)(16pter→16q21::21p11→21pter；21qter→21p11::16q12→16qter)。表型男，29岁，为表型正常的携带者资料提供者张惠芳等，广东省计划生育科学技术研究所，邮政编码51008037、核型46,XX,t(18；21)(18qter→cen→21qter；18pter→cen→21pter)表型女，为表型正常的携带者资料提供者石化金等，辽宁锦州市妇婴医院遗传室，邮政编码12100038、核型46,XX,t(18；21)(18pter→18q11::21p12→21pter；21qter→21p12::18q11→18qter)表型女，26岁，为表型正常的携带者资料提供者李修林等，辽宁省沈阳市，中国医科大学附一院小儿科遗传室，邮政编码11000139、核型45,X,dic(Y；13)(Ypter→Yq1200::13p11→cen→13qter)表型男，4岁，为表型正常的携带者资料提供者夏家辉等，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室，邮政编码41007840、核型46,XY,t(Y；15)(15qter→15p12::Yq12→Ypter)pat。表型男，新生儿，为表型正常的携带者资料提供者夏家辉等，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室，邮政编码41007841、核型45,X,psu dic(Y；22)(Ypter→Yq1209::22p12→cen→22qter)表型男，为表型正常的携带者资料提供者刘希贤等，湖北武汉同济医科大学医学遗传学研究室，邮政编码430030
上述实例说明在核仁组织区不但可接受外源基因，而且能让外源基因正常表达。这也证明了本发明提供的基因药物治疗血友病B的可行性。
序列表<110> 夏家辉<120> 治疗血友病B的基因药物<160> 1<211> 13928bp<212> DNA<213> 基因载体-FⅨ重组体<400>
1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC TCTAGACTCG AGGAATTCTA51 CCGGGTAGGG GAGGCGCTTT TCCCAAGGCA GTCTGGAGCA TGCGCTTAAG101 CAGCCCCGCT GGGCACTTGG CGCTACACAA GTGGCCTCTG GCCTCGCACA151 CATTCCACAT CCACCGGTAG GCGCCAACCG GCTCCGTTCT TTGGTGGCCC201 CTTCGCGCCA CCTTCTACTC CTCCCCTAGT CAGGAAGTTC CCCCCCGCCC251 CGCAGCTCGC GTCGTGCAGG ACGTGACAAA TGGAAGTAGC ACGTCTCACT301 AGTCTCGTGC AGATGGACAG CACCGCTGAG CAATGGAAGC GGGTAGGCCT351 TTGGGGCAGC GGCCAATAGC AGCTTTGCTC CTTCGCTTTC TGGGCTCAGA401 GGCTGGGAAG GGGTGGGTCC GGGGGCGGGC TCAGGGGCGG GCTCAGGGGC451 GGGGCGGGCG CCCGAAGGTC CTCCGGAGGC CCGGCATTCT GACGCTTCAA501 AAGCGCACGT CTGCCGCGCT GTTCTCCTCT TCCTCATCTC CGGCCTTTCG551 ACCTGCAGCG ACCCGCTTAA CAGCGTCAAC AGCGTGCCGC AGATCTTGGT601 GGCGTGAAAC TCCCGCACCT CTTCGGCAAG CGCCTTGTAG AAGCGCGTAT651 GGCTTCGTAC CCCTGCCATC AACACGCGTC TGCGTTCGAC CAGGCTGCGC701 GTTCTCGCGG CCATAGCAAC CGACGTACGG CGTTGCGCCC TCGCCGGCAG751 CAAGAAGCCA CGGAAGTCCG CCTGGAGCAG AAAATGCCCA CGCTACTGCG801 GGTTTATATA GACGGTCCTC ACGGGATGGG GAAAACCACC ACCACGCAAC851 TGCTGGTGGC CCTGGGTTCG CGCGACGATA TCGTCTACGT ACCCGAGCCC901 GATGACTTAC TGGCAGGTGC TGGGGGCTTC CGAGACAATC GCGAACATCT951 ACACCACACA ACACCGCCTC GACCAGGGTG AGATATCGGC CGGGGACGCG1001 GCGGTGGTAA TGACAAGCGC CCAGATAACA ATGGGCATGC CTTATGCCGT1051 GACCGACGCC GTTCTGGCTC CTCATATCGG GGGGGAGGCT GGGAGCTCAC1101 ATGCCCCGCC CCCGGCCCTC ACCCTCATCT TCGACCGCCA TCCCATCGCC1151 GCCCTCCTGT GCTACCCGGC CGCGCGATAC CTTATGGGCA GCATGACCCC1201 CCAGGCCGTG CTGGCGTTCG TGGCCCTCAT CCCGCCGACC TTGCCCGGCA1251 CAAACATCGT GTTGGGGGCC CTTCCGGAGG ACAGACACAT CGACCGCCTG1301 GCCAAACGCC AGCGCCCCGG CGAGCGGCTT GACCTGGCTA TGCTGGCCGC1351 GATTCGCCGC GTTTACGGGC TGCTTGCCAA TACGGTGCGG TATCTGCAGG1401 GCGGCGGGTC GTGGCGGGAG GATTGGGGAC AGCTTTCGGG GACGGCCGTG1451 CCCGCCCCAG GGTGCCGAGC CCCAGAGCAA CGCGGGCCCA CGACCCCATA1501 TCGGGGACAC GTTATTTACC CTGTTTCGGG CCCCCGAGTT GCTGGCCCCC1551 AACGGCGACC TGTACAACGT GTTTGCCTGG GCCTTGGACG TCTTGGCCAA1601 ACGCCTCCGT CCCATGCACG TCTTTATCCT GGATTACGAC CAATCGCCCG1651 CCGGCTGCCG GGACGCCCTG CTGCAACTTA CCTCCGGGAT GGTCCAGACC1701 CACGTCACCA CCCCCGGCTC CATACCGACG ATCTGCGACC TGGCGCGCAC1751 GTTTGCCCGG GAGATGGGGG AGGCTAACTG AAACACGGAA GGAGACAATA1801 CCGGAAGGAA CCCGCGCTAT GACGGCAATA AAAAGACAGA ATAAAACGCA1851 CGGGTGTTGG GTCGTTTGTT CATAAACGCG GGGTTCGGTC CCAGGGCTGG1901 CACTCTGTCG ATACCCCACC GAGACCCCAT TGGGGCCAAT ACGCCCGCGT1951 TTCTTCCTTT TCCCCACCCC ACCCCCCAAG TTCGGGTGAA GGCCCAGGGC2001 TCGCAGCCAA CGTCGGGGCG GCAAGCCCTG CCATAGCCAC GGGCCCCGTG2051 GGTTAGGGAC GGGGTCCCCC ATGGGGAATG GTTTATGGTT CGTGGGGGTT2101 ATTATTTTGG GCGTTGCGTG GGGTCAGGTC CACGACTGGA CTGAGCAGAC2151 AGACCCATGG TTTTTGGATG GCCTGGGCAT GGACCGCATG TACTGGCGCG2201 ACACGAACAC CGGGCGTCTG TGGCTGCCAA ACACCCCCGA CCCCCAAAAA2251 CCACCGCGCG GATTTCTGGC GCCGCCGGAC GAACTAAACC TGACTACGGC2301 ATCTCTGCCC CTTCTTCGCT GGTACGAGGA GCGCTTTTGT TTTGTATTGG2351 TCACCACGGC CGAGTTTCCG CGGGACCCCG GCCAGGACCT GCAGAAATTG2401 ATGATCTATT AAACAATAAA GATGTCCACT AAAATGGAAG TTTTTCCTGT2451 CATACTTTGT TAAGAAGGGT GAGAACAGAG TACCTACATT TTGAATGGAA2501 GGATTGGAGC TACGGGGGTG GGGGTGGGGT GGGATTAGAT AAATGCCTGC2551 TCTTTACTGA AGGCTCTTTA CTATTGCTTT ATGATAATGT TTCATAGTTG2601 GATATCATAA TTTAAACAAG CAAAACCAAA TTAAGGGCCA GCTCATTCCT2651 CCCACTCATG ATCTATAGAT CTATAGATCT CTCGTGGGAT CATTGTTTTT2701 CTCTTGATTC CCACTTTGTG GTTCTAAGTA CTGTGGTTTC CAAATGTGTC2751 AGTTTCATAG CCTGAAGAAC GAGATCAGCA GCCTCTGTTC CACATACACT2801 TCATTCTCAG TATTGTTTTG CCAAGTTCTA ATTCCATCAG AAGCTCCTTA2851 ATTTTATACC ACTGACTTAT TTTGAAGGCT GCTATAAGAA ACAGCCCTAT2901 GAAACTGGTA TTTTCCTACT GCAAGGTGGC TACTTTAAGA CAATTTTTCA2951 TTGCATTCTA TCAAGGGATG TCTTATTATT ATATCATTAT ATCAAGTGAT3001 GTTATAAATA GTAAGAATCA GATTAAGGGC TCATATGTCC TTCTTTGTAT3051 TGACTGTTGA AAAGGTATGG GGCCAAATTT GTAGTTTGTC TGGAATTACA3101 TATTTTTGGG GGTCTCTATT ATCTTCATAC TTATCCTATC TAAATTTTCC3151 ATTGCCAAAT TTCCTTACTT ATTTTTAGTT TTATCCTATT GCTCATGTAT3201 TTTTATGTCT CCATAAGTCT ATTTTGGAAA AAGGCAGAGT ACTCATAATT3251 TTAGTATATC TTTTAGCTTT ATGTTGCCAT AAACCTTTCA TTATATACAT3301 GATCAACAAC AGCAAATTAT CTCACTTCAG TATTTAGTTT ATTATTTTAC3351 AAACTGATTT ATGATTGCTA ACATGTAACT GAAGGTATAC ACTATTAGAA3401 CACAGTTTTC AGTAGAAAGT AGCACTGCCA TTGAGTAAAA AAATGTTCTA3451 ACATTAGAGC AACATTCTTA TACAAGTTTG CATGTTGTTT ACTGAGGTCT3501 AAAGCATGAC TACACAAAAG GCTGAATAAA ATTCAGATTC TTACATACAC3551 ATAAAATTGT TTTATTGAGA TGACAAAGTA TATTTATTAT GCCACCCAGA3601 ATATAATCCA CTCTGATAAC TGCCAGTGTA TGCACTTGCT GAAGTAACTC3651 AGTACATAAA TGGTAGCCAC AACAGTTGCT GTGCATGAAA GTTCTTCTCT3701 TCCAGATTGA AGAGTGTACA ATCTAAAGCA TTTTAAAACT TTAAATCCCT3751 TATTAGCTTA AATATAATTT AAAATTTTAG TTTGCCGTAC CTATAATTTG3801 TCTGTACACT AGGTTACTAA GGGTGATATG ATTACATATG TGGATACAAA3851 ATAATTTTAA TGGAAAATGA AATTAGGGTA CTCAACAAAG ATAAAGGGTA3901 ATGATCATGT ACACTAACCG TATTTGAGAT TAGTTTAAGC CTGGGGTAGC3951 TATACTTATG TTTCACAGAC CTTGAGAAGA TAGGGAAAAA AAGCTTTTAT4001 CAACATTGCT AAGGAACAGG TAAAAGCTAA CATTAGGTAA CTAAGAGGTG4051 ACATAAAAAA GACTGAATAA AATATCATGG AGGTTTCATA ATAAGATTGG4101 AAATTCCATA GACTAGGAGA GAAAAGATCC CAAAATATAC ATGCTCATTG4151 GGAAAACAGC TAGTAAGAAC AAGGAGAGAT CTCTATTTAA TGATACAATA4201 GTAGAGTTAT AATTTCCTGT ATATTGTAAA TTTCAAGCAT TTAAACATTT4251 TCATTGAATT ATAAAATATT ATTTGTAAAA GAAAGAAAAA CAGCACAACT4301 GCAGATTACA GATGACTAAG ATAGATGAAT CATGAAAAGG TGCTAGATTG4351 TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA GCTATGACCA TGATTACGCC4401 AAGCTCTCGA CGGGATCGCG GCCGCGATCC AGACATGATA AGATACATTG4451 ATGAGTTTGG ACAAACCACA ACTAGAATGC AGTGAAAAAA ATGCTTTATT4501 TGTGAAATTT GTGATGCTAT TGCTTTATTT GTAACCATTA TAAGCTGCAA4551 TAAACAAGTT GGGGTGGGCG AAGAACTCCA GCATGAGATC CCCGCGCTGG4601 AGGATCATCC AGCCGGCGTC CCGGAAAACG ATTCCGAAGC CCAACCTTTC4651 ATAGAAGGCG GCGGTGGAAT CGAAATCTCG TGATGGCAGG TTGGGCGTCG4701 CTTGGTCGGT CATTTCGAAC CCCAGAGTCC CGCTCAGAAG AACTCGTCAA4751 GAAGGCGATA GAAGGCGATG CGCTGCGAAT CGGGAGCGGC GATACCGTAA4801 AGCACGAGGA AGCGGTCAGC CCATTCGCCG CCAAGCTCTT CAGCAATATC4851 ACCGGTAGCC AACACTATGT CCTGATAGCG GTCCGCCACA CCCAGCCGGC4901 CACAGTCGAT GAATCCAGAA AAGCGGCCAT TTTCCACCAT GATATTCGGC4951 AAGCAGGCAT CGCCATGGGT CACGACGAGA TCCTCGCCGT CGGGCATGCT5001 CGCCTTGAGC CTGGCGAACA GTTCGGCTGG CGCGAGCCCC TGATGCTCTT5051 CGTCCAGATC ATCCTGATCG ACAAGACCGG CTTCCATCCG AGTACGTGCT5101 CGCTCGATGC GATGTTTCGC TTGGTGGTCG AATGGGCAGG TAGCCGGATC5151 AAGCGTATGC AGCCGCCGCA TTGCATCAGC CATGATGGAT ACTTTCTCGG5201 CAGGAGCAAG GTGAGATGAC AGGAGATCCT GCCCCGGCAC TTCGCCCAAT5251 AGCAGCCAGT CCCTTCCCGC TTCAGTGACA ACGTCGAGCA CAGCTGCGCA5301 AGGAACGCCC GTCGTGGCCA GCCACGATAG CCGCGCTGCC TCGTCTTGCA5351 GTTCATTCAG GGCACCGGAC AGGTCGGTCT TGACAAAAAG AACCGGGCGC5401 CCCTGCGCTG ACAGCCGGAA CACGGCGGCA TCAGAGCAGC CGATTGTCTG5451 TTGTGCCCAG TCATAGCCGA ATAGCCTCTC CACCCAAGCG GCCGGAGAAC5501 CTGCGTGCAA TCCATCTTGT TCAACCATGG TGGATCGATC CAAGCTCCCA5551 ACACAACTAT GTCAGAAGCA AATGTGAGGA GCAACTGATC CTACCTCACC5601 TTATATGCTC TGCCCTGGCT CCTGCCCTCT CTATCCTGTG TGAGCAGATT5651 GGCCCTTACC AAGGTGTGGC TCTACGGAAT CAGGCTTCGG TGATGACAAG5701 CATATTTCTC CCTAGAATGC TGTGCCACTC ACTGGCTTAG GAGTCTCAGC5751 TCTGGGTACT CCCTCTGAAT AATGTTTGTC CTTATCTGTG CAGAGAACAC5801 TGTCTCTAAA GCATCCTTTT TGGCAACGCA TTTGCTCAAT CAACTACTGA5851 ATTGGTGTTA AAATTAATTT TCCTTTTTTT CTCATTATGC AAATAAGAAA5901 TTGAGAAGCA AAGCTAGGTA CCCCCTAGAG CCCCAGCTGG TTCTTTCCGC5951 CTCAGAAGCC ATAGAGCCCA CCGCATCCCC AGCATGCCTG CTATTGTCTT6001 CCCAATCCTC CCCCTTGCTG TCCTGCCCCA CCCCACCCCC CAGAATAGAA6051 TGACACCTAC TCAGACAATG CGATGCAATT TCCTCATTTT ATTAGGAAAG6101 GACAGTGGGA GTGGCACCTT CCAGGGTCAA GGAAGGCACG GGGGAGGGGC6151 AAACAACAGA TGGCTGGCAA CTAGAAGGCA CAGTCGAGGC TGATCAGCGG6201 TTTAAACTTA AGCTTCAGCT CAGGTAAAAT ATGAAATTCT CCCCTGTAAA6251 GAGAAAAAGC AATGATCATA GAATGTATAT ATTCAAATCT AACAAAAGAT6301 GGGAAAGTGA TTAGTTAGTG AGAGGCCCTG TTAATTTTCA ATTCCAATGA6351 ATTAACCTTG GAAATCCATC TTTCATTAAG TGAGCTTTGT TTTTTCCTTA6401 ATCCAGTTGA CATACCGGGA TACCTTGGTA TATATTCCAT ATTTGCCTTT6451 CATTGCACAC TCTTCACCCC AGCTAATAAT TCCAGTTAAG AAACTGGTCC6501 CTTCCACTTC AGTAACATGG GGTCCCCCAC TATCTCCTTG ACATGAATCT6551 CTACCTCCTT CATGGAAGCC AGCACAGAAC ATGTTGTTAT AGATGGTGAA6601 CTTTGTAGAT CGAAGACATG TGGCTCGGTC AACAAGTGGA ACTCTAAGGT6651 ACTGAAGAAC TAAAGCTGAT CTCCCTTTGT GGAAGACTCT TCCCCAGCCA6701 CTTACATAGC CAGATCCAAA TTTGAGGAAG ATGTTCGTGT ATTCCTTGTC6751 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权利要求
1.治疗血友病B的基因药物，含有以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列所构建的基因载体-FⅨ重组体。
2.根据权利要求1所述的治疗血友病B的基因药物，其特征在于所述的载体-FⅨ重组体具有序列表1表示的DNA序列，FⅨ治疗基因的插入位点为5910位。
3.制备权利要求1所述的治疗血友病B的基因药物的方法，其特征在于包括下列步骤(1)以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列，构建基因载体；(2)将FⅨ治疗基因装入上述基因载体，得到载体-FⅨ重组体。
4.根据权利要求3所述的治疗血友病B的基因药物的方法，其特征在于(1)治疗基因引导序列选自人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列，其长度为3.8Kb，利用TK做为负筛选基因，将正筛选基因Neo基因插入治疗基因引导序列中的1500位，使其分为1.5kb和2.3kb两臂，构建成基因载体；(2)FⅨ治疗基因的插入位点为5910位。
全文摘要
本发明涉及治疗血友病B的基因药物,它含有以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50%及50%以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列所构建的基因载体－FIX重组体(保藏号CCTCC M200031)。该治疗血友病B的基因药物治疗基因表达稳定性好,安全性好,表达效率高,无免疫原性。
文档编号A61K35/76GK1302664SQ01102830
公开日2001年7月11日 申请日期2001年1月19日 优先权日2000年8月30日
发明者夏家辉 申请人:夏家辉