专利名称：皮肤炎治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及7-氨基-3-苄基-1-苯基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶-2,4-二酮衍生物作为皮肤炎治疗剂，特别是作为特应性皮肤炎治疗剂的医药用途。
皮肤炎是由于各种外因或内因引起的皮肤的炎症反应，是皮肤病中最常见的疾病，通常与湿疹意义相同。典型的急性期临床表现，首先是产生浮肿性红斑，然后在红斑上出现丘疹、浆液性丘疹，形成小水泡、脓泡、糜烂、成痂、鳞屑，逐渐向治愈发展。慢性期则表现为皮肤肥厚、苔藓化、色素沉着、同时伴随搔痒。组织学观察急性期的特征是表皮细胞间浮肿(海绵状态)。皮肤的范围包括接触性皮肤炎、特应性皮肤炎、脂溢性皮肤炎、钱币状湿疹、Vidal苔藓、郁滞性皮肤炎、异汗性湿疹、皮脂缺乏性湿疹、自体致敏性湿疹等。
特应性皮肤炎是由与特应性、即免疫球蛋白E(IgE)相关的过敏反应引起的疾病，但目前对其发病的原因还不十分明了。特应性皮肤炎的血中IgE值很高，经常伴随嗜酸性粒细胞增多。特应性自体属于I型，但由于从病理学的角度来看特应性皮肤炎与湿疹、接触性皮肤炎等的反应类似，所以认为与Ⅳ性过敏(迟发型)有关。特应性皮肤炎的发病或慢性化时伴随嗜酸性粒细胞或淋巴细胞的浸润的迟发型反应起着重要的作用(Iwamoto等人的论文J.Leukoc.Biol.,52,pp.572-578(1992),Frigas等人的论文J.Allergy.Clin.Immunol.,77,pp.527-537(1986)等)。特应性皮肤炎的症状是，从发生后2～6个月开始出现颜面的湿润性湿疹，然后扩大到四肢、躯干。搔痒强烈也是特征。症状随年龄变化，分为乳儿期(至2岁)、幼儿期(2～12岁)、成人期。乳儿期主要限于面部，但躯干的皮肤也随之发生干燥，产生毛孔性丘疹(特应性皮肤炎)。幼、小儿期发生病变，发生干燥，在肘窝、膝窝处发生肥厚的局部表面(苔癣化)。到12岁左右治愈的情况较多，但也有一直发展到成人的严重情况，即使有减轻的趋势，有时还会再发，有些直至完全治愈需要很长时间，也有没能治愈的例子。用甾族化合物类外用剂(软膏)涂布治疗最有效果，尚未确立能替代该方法的治疗方法。
但是，频繁用于以特应性皮肤炎为代表的皮肤炎的治疗的甾族化合物制剂虽然临床效果较好，但有多种副作用。有关甾族化合物制剂的副作用有多种报告，在软膏剂等外用剂中，发生皮肤菲薄化、萎缩、潮红等直接对皮肤的有害作用，是产生社会问题的重大副作用。鉴于这种作为常用的皮肤炎治疗剂，特应性皮肤炎治疗剂的甾族化合物制剂具有重大的副作用，所以患者和医疗现场迫切期望一种副作用更少、安全性更高、可以安全使用的药剂。
本发明的皮肤炎治疗剂使用的化合物，作为具有支气管扩张作用的新型化合物，已经申请了专利(特开2000-119272号)。另外与此构造相似的具有吡啶并〔2,3-d〕嘧啶骨架的化合物具有抗过敏作用(特开昭63-45279号公报)、具有7-氨基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶骨架的化合物具有支气管扩张作用(特开平8-3046号、特开平8-3164号公报、特开平8-3165号公报)。
本发明解决了上述的以往技术中存在的问题，提供了患者和医疗机构所需要的、副作用少且安全性高的皮肤炎治疗剂、特别是特应性皮肤炎治疗剂。
本发明者通过对7-氨基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶衍生物进行锐意的研究，结果发现7-氨基-3-苄基-1-苯基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶-2,4-二酮衍生物作为皮肤炎治疗剂、特别是特应性皮肤炎治疗剂有用，对皮肤的副作用少，由此完成了本发明。
本发明涉及含有下面通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学允许的盐或水和物作为有效成份的皮肤炎治疗剂，特别是特应性皮肤炎治疗剂。 式中，R表示氢或卤素。
上面通式(Ⅰ)的取代基中，R表示氢或卤素，优选氟、氯、溴、碘等卤素原子。
下面是本发明优选的形式。
(1)含有上述通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学允许的盐或水和物作为有效成份的皮肤炎治疗剂。
(2)上述(1)记载的皮肤炎治疗剂是特应性皮肤炎治疗剂。
(3)上述(1)或(2)中任一项记载的皮肤炎治疗剂是外用制剂。
(4)上述(1)至(3)中任一项记载的皮肤炎治疗剂中，含有上述通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学允许的盐或水和物作为有效成份，通式(Ⅰ)中R表示氢。
(5)上述(1)至(3)中任一项记载的皮肤炎治疗剂中，含有上述通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学允许的盐或水和物作为有效成份，通式(Ⅰ)中R在邻位取代。
(6)上述(5)记载的皮肤炎治疗剂中含有上述通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学允许的盐或水和物作为有效成份，通式(Ⅰ)中R表示氯。
本发明的皮肤炎治疗剂所使用的上述通式(Ⅰ)表示的化合物中，特别优选的化合物如下所示。
7-氨基-3-苄基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶-2,4-二酮〔化合物1〕7-氨基-3-(2-氯苄基)-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶-二酮〔化合物2〕上述化合物中，最优选的化合物是7-氨基-3-苄基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并〔2,3-d〕嘧啶-二酮〔化合物1〕。
本发明皮肤炎治疗剂所使用的上述通式(Ⅰ)表示的化合物，可以按照特开昭63-45279号公报、特开平8-3046号公报、特开平8-3164号公报、特开平8-3165号公报或特开2000-119272号公报的申请说明书中记载的方法，或参照该方法制备，制造方法将在后面的实施例中详细说明。
上述通式(Ⅰ)表示的化合物，当存在药学上允许的盐时，则包括这些盐类，例如与盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸、甲酸、乙酸、卤代乙酸、丙酸、乙醇酸、枸橼酸、酒石酸、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、丙二酸、富马酸、氨茴酸、苯甲酸、桂皮酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等酸的加成盐。这些盐可以按照公知的方法与游离的各化合物反应制备，也可以相互转换得到。另外，如果存在顺反异构体、光学异构体、配位异构体等立体异构体或水和物，或在金属配位化合物的状态下存在时，本发明也包括这些立体异构体、水和物和配位化合物。
将上述通式(Ⅰ)表示的化合物与适当的医药用载体或稀释剂组合，可以制得药物产品，得到本发明的皮肤炎治疗剂。制剂化方法可以按照通常使用的方法进行。作为皮肤炎治疗剂，最适宜制备成外用制剂如液体制剂、混悬剂、乳剂、硬膏剂、软膏剂、湿敷剂、搽剂、洗剂等。根据处方，可以使用上述通式(Ⅰ)表示的化合物的药学允许的盐或水和物的形式，也可以与其他医药活性成份配合使用。外用制剂的调配方法，在日本药局方解说书第十三次修订本(广川书店发行，1996年)的制剂总则中进行了详细的描述。
软膏剂根据所使用的基质种类不同可以大致分为油脂性软膏、乳剂性软膏、水溶性软膏、混悬性软膏。这些软膏剂可以通过将脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蜡。蜡、树脂、塑料、醇类、高级醇类、甘油、水、乳化剂、混悬化剂或其他适当的添加剂作为原料，或作为基质，再加入本发明的化合物混合均匀后制备得到。
在制备湿敷物时，可以将上述通式(Ⅰ)表示的化合物的粉末与精油成分混合成泥状即可。对于不同的疾病种类和状态，也可以选择适合治疗的上述以外的其他剂型制剂化。
本发明化合物所希望的给药量可以根据给药对象、剂型、给药方法、给药时间等不同适当设定。例如通常对成人来说为了得到所希望的治疗效果，可以将含有0.1％-15％的本发明化合物的软膏在适当患部1日1次或数次涂布。
下面通过实施例更具体的说明本发明，但本发明并不局限于此。
实施例始发原料可以从Aldrich chemical有限公司、Furuca chemical有限公司、Lancasta Synthesis有限公司、Maybridge chemical有限公司或东京化成(株)等购入，原料化合物也可以按照J.Org.Chem.,16,p.1879(1951),J.Am.Chem.Soc.,75,p.114(1953)等文献记载的公知的方法制得。
实施例1软膏剂的调制(1)6-氨基-1-苯基尿嘧啶的制备在甲醇(400ml)中混合叔丁醇钾(67.3g,0.6mol)的溶液中，加入苯基脲(68.1g,0.5mol)和氰基乙酸乙酯，(53ml,0.5mol)。将混合液回流5.5小时，减压下蒸发溶剂至生成残渣，将残渣溶于热水(2L)中。使溶液成酸性，在溶液中加入冰醋酸，直至得到作为体积较大的略带黄色的沉淀物的嘧啶衍生物。过滤收集沉淀物，用水洗涤数次，在50℃下干燥，得到6-氨基-1-苯基尿嘧啶67.4g，收率66％。Mp＞280℃1H-NMR(DMSO-d6)δ:4.67(s,1H),6.08(s,2H),7.31(d,2H,J=7Hz),7.47-7.54(m,3H),10.43(s,1H)IR(KBr):3478,3334,2981,1712,1634,1476,1387,1299,704cm-1MS(EI)m/z:203[M+],160,132,77(2)7-氨基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮的制备在叔丁醇(300ml)中混合叔丁醇钾(18.7g,225mmol)的溶液中，加入6-氨基-1-苯基尿嘧啶(30.5g,150mmol)和3-甲氧基氰化丙烯(25ml,225mmol)。-边搅拌混合液一边在110℃下加热12小时。蒸发丁醇，在残渣中加入水(200ml)，用醋酸调成酸性。过滤收集沉淀物，用热乙醇洗涤，得到7-氨基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮20g，收率53％。Mp＞300℃1H-NMR(DMSO-d6)δ:6.27(d,1H,J=9Hz),6.89(s,2H),7.20-7.87(m,5H),7.88(d,1H,J=9Hz),11.26(s,1H)IR(KBr):3038,1709,1605,1417,789cm-1MS(EI)m/z:254[M+],211,77(3)7-氨基-3-苄基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮[化后物1]的制备在六甲基二硅烷基胺(100ml)中加入7-氨基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮(3g,12mmol)和硫酸铵(500mg)形成悬浮液，将该悬浮液在室温、大气压下回流24小时。蒸发溶剂，将残渣溶于100ml的L(-)-5,6,7,8-四氢叶酸(THF)中,在该溶液中，一边回流一边滴加在THF(14ml,14mmol)中加入了苄基溴(2ml,18mol)和1M的Bu4NF的溶液。搅拌混合液2小时，减压下浓缩。残渣用硅胶柱色谱法精制(苯∶丙酮=5∶1)，用甲醇重结晶，得到7-氨基-3-苄基-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮(化合物1)1g，收率27％。Mp 261-262℃1H-NMR(DMSO-d6)δ:5.08(s,2H),6.32(d,1H,J=8Hz),6.98(s,2H),7.22-7.49(m,10H),7.94(d,1H,J=8Hz)IR(KBr):3498,3392,1695,1655,1618,787,700cm-1Anal.Calcd for C20H16N4O2:C,69.76；H,4.68；N,16.27、Found:C,69.81；H,4.77；N,16.13MS(EI)m/z:344[M+],211,91应用上述(1)～(3)的方法，得到7-氨基-3-(2-氯苄基)-1,2,3,4-四氢-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮(化合物2)。
(4)将上述得到的化合物1或2在乳钵上充分悬浮于白凡士林中，制剂成最终含量为0.3％、1％、3％和10％的软膏剂。作为对照，准备只含有基质的软膏。作为阳性对照，准备含0.12％戊酸倍氟美松(甾族化合物剂)的软膏。
实施例2特应性皮肤炎模型动物的制备购入7周龄的BALB/c雌性(SPF)小鼠供试验使用。按照田中等人的方法(过敏、46,pp42-48(1997))，将卵白蛋白(最终浓度2μg/ml)与氢氧化铝凝胶(最终浓度10mg/ml)在生理食盐水中混悬，取0.5ml于试验开始之日在小鼠腹腔内致敏，第14日在相同条件下追加致敏。然后在第28日取20μg/ml的卵白蛋白(生理食盐水)25μl在小鼠右耳廓皮内给药，诱发浮肿反应。
浮肿反应在抗原诱发第4小时达到峰值，经24至48小时后，与仅诱发(未致敏)的对照相比发现显著的浮肿反应。在此模型中诱发1-4小时后发生的反应是由肥大细胞释放的各种介质引起的即发型浮肿反应，与嗜酸性粒细胞或淋巴细胞等炎症细胞无关。另外诱发24至48小时出现的浮肿是由嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞的浸润产生的所谓的迟发型浮肿反应。另外抗原诱发部位的耳廓在诱发第24小时出现发红反应的峰值。发红和浮肿同样是炎症的重要症状之一。该发红反应的出现机制还不明确，但从出现的时程来看属于迟发型的发红反应。所以被诱发出现即发型和迟发型两种炎症的这种模型动物，作为特应性皮肤炎模型动物是适当的。在下面试验中使用该病态模型的动物供本发明的皮肤炎治疗剂试验使用。
下面实施例3至6探讨了本发明皮肤炎治疗剂的作用和安全性，结果如表所示。另外对下面实施例的统计学处理，结果以平均值±标准差来表示，各组间的检定使用统计库(Yukms)，基质对照组和诱发组、未处置对照组间通过Student的两侧unpaired t-test，另外对照组与试验药给药组之间通过Dunnett的两侧多重比较检定或Mann-Whitney-test进行解析。
实施例3抗原诱发小鼠的耳廓浮肿反应的抑制作用在按实施例2诱发浮肿的小鼠的抗原诱发部位(右耳廓)上，在诱发2小时前和4小时后分别涂布基质(对照)、被检药物(本发明皮肤炎治疗剂、阳性对照)。诱发后用DIAL THICKNESS GAUGE(尾崎制作所)经时测定诱发耳廓的厚度。反应强度为诱发前测定的右耳廓的厚度(前值)与诱发后耳廓的厚度之差，用耳廓厚度增加值来表示。被检药物的耳廓浮肿抑制率可以由下式计算得出。
抑制率(％)=100×(基质对照组耳廓厚度增加值-试验组的耳廓厚度增加值)/(基质对照组耳廓厚度增加值-诱发组耳廓厚度增加值)结果如表1和表2所示。本发明的皮肤炎治疗剂与用量成正比地对抗原诱发小鼠的耳廓浮肿反应具有明显地抑制作用。
表1
平均值±标准偏差相结于基质对照的明显偏差*p＜0.05,**p＜0.01,(Dunnett多重比较检定)#p＜0.05,###p＜0.001(Stident’s t-test)表2
平均值±标准偏差相结于基质对照的明显偏差*p＜0.05,**p＜0.01,(Dunnett多重比较检定)
实施例4小鼠抗原诱发发红反应的抑制作用在按实施例2诱发浮肿的小鼠的抗原诱发部位(右耳廓)上，在诱发2小时前和4小时后分别涂布基质(对照)、被检药物(本发明皮肤炎治疗剂、阳性对照)。用肉眼观察右耳廓，发红的程度按下面标准评分。
0不发红1可确认发红，颜色为透明红色或淡红色，程度小2介于3和1之间3颜色为透明的红色，面积大结果如表3所示，本发明的皮肤炎治疗剂对小鼠抗原诱发发红反应有明显地抑制作用。
表3
平均值±标准偏差相结于基质对照的明显偏差*p＜0.05,***p＜0.001, (Mann-Whitney test)实施例5对嗜酸性粒细胞向小鼠抗原诱发耳廓浸润的抑制作用嗜酸性粒细胞对小鼠耳廓的浸润程度以皮肤组织匀浆产物中嗜酸性过氧化物酶的活性为指标进行测定。在按实施例2诱发浮肿的小鼠的抗原诱发部位(右耳廓)上，在诱发2小时前和4小时后分别涂布基质(对照)、被检药物(本发明皮肤炎治疗剂、阳性对照)。诱发24小时后切下右耳廓，将组内耳廓组织放在1个池中，按Holliday等人的方法(Toxicology,106,pp.237-242(1996))制作耳廓组织的匀浆物。该匀浆物在20000rpm下离心分离20分钟(Kubota、KR20000T)，上清液的过氧化物酶活性在o-phenyleneiamine dihydrochlorid(Sigma公司)基质上测定。在492nm处经时测定吸光度，反应曲线在线性关系的范围内，将对照组作为100％比较嗜酸性粒细胞的浸润程度。
本发明的皮肤炎治疗剂，与用量成正比地对小鼠抗原诱发耳廓的嗜酸性粒细胞的浸润具有抑制作用。另外化合物1的3％软膏的嗜酸性粒细胞浸润抑制作用与作为阳性对照的甾族化合物制剂的抑制作用程度相同。
实施例6反复涂布对正常小鼠耳廓厚度的影响将本发明皮肤炎治疗剂或阳性对照(甾族化合物制剂)在正常小鼠的右耳廓上1日涂布2次，共计9次，在最终涂布结束2小时后测定耳廓的厚度。
结果如表4所示。如上述试验结果所示，本发明皮肤炎治疗剂的3％软膏具有优良的耳廓浮肿抑制作用、发红抑制作用、嗜酸性粒细胞浸润抑制作用，另外反复涂布高浓度的10％软膏，对皮肤没有造成任何影响，与阳性对照(甾族化合物制剂)反复涂布时耳廓厚度相比显著减少。
表4
平均值±标准偏差相结于基质对照的明显偏差**p＜0.001,(Dunnett多重比较检定)实施例7对豚鼠腹腔嗜酸性粒细胞游离的抑制作用使用Boyden Chamber法探讨本发明化合物对LTB4引起的豚鼠腹腔嗜酸性粒细胞游离的作用。即使用Hartley系雄性豚鼠，在被检药剂(本发明皮肤炎治疗剂)的存在或不存在下，相对于10-7M的LTB4，在37℃下使按常法调制的豚鼠腹腔嗜酸性粒细胞游离2小时。固定游离细胞，进行吉姆萨染色后，用400倍的显微镜测量10个视野的游离细胞数。将该实验进行数次，按下式求出各实验中的抑制率，再以该抑制率为基础，利用最小二乘法求出回归曲线的公式，算出50％抑制浓度(IC50)。
抑制率(％)=100×(对照组的嗜酸性粒细胞的游离数-被检药剂的嗜酸性粒细胞的游离数)/(对照组的嗜酸性粒细胞的游离数-自发嗜酸性粒细胞游离数)被检药剂使用化合物1，进行5次实验。其结果，化合物1的IC50为1.9±0.4μmol/L，显示出非常强的嗜酸性粒细胞游离的抑制作用。
实施例8磷酸二酯酶阻碍作用按常法研究本发明化合物对磷酸二酯酶(PDE)同工酶的阻碍作用。研究本发明化合物对来自人血小板的Ⅱ型磷酸二酯酶(PDEⅡ)、来自人血小板的Ⅲ型磷酸二酯酶(PDEⅢ)、来自人U937细胞的Ⅳ型磷酸二酯酶(PDEⅣ)、来自人血小板的Ⅴ型磷酸二酯酶(PDEⅤ)的阻碍作用。
化合物1为100μm时，对PDEⅡ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别表现出6％、22％、82％、15％的抑制，对PDEⅣ表现出选择性阻碍作用。化合物1对PDEⅠ的阻碍作用与用量成正比。
如上述动物实验所示，7-氨基-3-苄基-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮衍生物可以显著且与用量成正比地抑制作为特应性皮肤炎模型的抗原诱发小鼠耳廓浮肿反应，而且可以显著抑制与其相伴发生的小鼠抗原诱发发红反应。此外还具有抑制嗜酸性粒细胞向小鼠抗原诱发耳廓浸润的作用、抑制嗜酸性粒细胞向豚鼠腹腔游离的作用、选择性阻碍PDEⅣ的作用。因此，本发明的7-氨基-3-苄基-1-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4-二酮衍生物作为特应性皮肤炎、湿疹、接触皮肤炎等皮肤炎治疗剂有用。
另外，在使用甾族化合物剂时发生的皮肤菲薄化等对皮肤直接的有害作用(副作用)在使用本发明的皮肤炎治疗剂时完全没有发生，安全性极高。
如上所述，本发明的皮肤炎治疗剂作为特应性皮肤炎、皮肤炎治疗剂有用，副作用少，安全性高，可以解决现有技术的问题，作为患者和医疗现场迫切需要的药物有用性极高。
权利要求
1．含有下列通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学允许的盐或水和物作为有效成份的皮肤炎治疗剂，
2．权利要求1记载的皮肤炎治疗剂，是特应性皮肤炎治疗剂。
3．权利要求1或2记载的皮肤炎治疗剂，是外用制剂。
全文摘要
本发明提供含有通式(Ⅰ)表示的化合物或其药学上允许的盐或水和物为有效成分的皮肤炎治疗剂,特别是特应性皮肤炎治疗剂。式中,R表示氢或卤素。
文档编号A61P17/00GK1321465SQ01116389
公开日2001年11月14日 申请日期2001年4月13日 优先权日2000年4月13日
发明者吉井春夫, 藤田明弘 申请人:日本脏器制药株式会社