专利名称：治疗脑血栓的针剂及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有生物活性物质，用于治疗脑血栓的溶栓针剂及其制备方法。
背景技术：
随着社会的进步，生活水平的提高，社会上得血栓病的患者也越来越多，并且越趋于年轻化。国内外出现的几种治疗血栓病的药物都不十分理想。如丹参注射液，其主要成份是丹参，治高血脂有效率为80％，价格便宜，但效果不显著。东菱克栓酶治脑血栓，有效率90％，但价格高400元/支，效果好，不能长期使用。消栓通络片主要成份为川芎、丹参、黄芪等，起活血化瘀，温经通络作用，治疗效果不好。
发明内容
本发明是针对治疗脑血栓病人而提出的一种含生物活性物质具有溶栓、抗凝、抗血小板聚集，改善微循环的治疗脑血栓的针剂及其制法。
治疗脑血栓的针剂的制备方法为分两次层析和包装工艺。
第一步G75层析柱层析，经0.15～0.3M NaOH处理后装柱，用0.15～0.3M磷酸盐缓冲液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于0.15～0.3M磷酸盐缓冲液中，离心上样，上柱，以0.01～0.03M磷酸盐缓冲液洗脱，用分部收集器收集，收集酶活峰，浓缩冻干。
第二步Sephadex-A25层析柱层析，用0.01M Tris-HCl缓冲液，PH7.0浸泡凝胶，然后装入柱中，用0.01 M Tris-HCl缓冲液平衡。将第一步层析的样品溶于0.01M Tris-HCl缓冲液中上柱，缓冲液平衡，用0.01M NaCl的缓冲液洗去杂蛋白，换0.45～0.8M NaCl的缓冲液洗脱，收集酶活峰，浓缩冻干，得干粉。
第三步取上述干粉，分瓶包装得粉针剂。取上述干粉加生理盐水，以0.22μm微孔滤膜过滤，以1ml/支灌封于1ml安瓶中得水针剂。
经上述的方法制备的治疗脑血栓的针剂含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽释放酶与神经生长因子，其中精氨酸脂酶活性成份占总重量不低于70％。
鉴别方法取本品5ml于试管中，加0.4mol/l碳酸钠溶液1ml，再加磷钨酸钼-硫酸锂试液1ml，置水浴中加热，溶液应呈蓝色。
检查结果酸碱度，取本品依法检查，中国医典90版二部附录44，PH值应为6.0-7.5。
热原，取本品4支加灭菌生理盐水96ml，按每公斤家兔静脉注射10ml的剂量，应符合规定。
无菌，按无菌检查，中国医典90版二部附录169，应符合规定。
活性测定方法采取TAME法，①取试管六支，编号后依次加入TAME标准溶液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，再依次加入Tris-NaCl缓冲溶液2ml，1.8ml，1.6ml，1.4ml，1.2ml，1.0ml，使总体积为2ml，置37℃水浴中保温15分钟，各加碱性羟胺液2.0ml，继续保温20分钟，混匀，按分光度法，在500nm波长处于15-30分钟内测定吸收度A，以TAME浓度为横座标，以A值为纵座标，绘制A-C曲线，得出回归方程。②取本品10支，加入少量Tris-HCl缓冲液溶解，定量转移至10ml容量瓶中。取供试品溶液0.5毫升加Tris-HCl缓冲液0.5ml，加TAME标准液1.0ml，混匀，在另一支试管中加供试品溶液0.5ml，Tris-HCl缓冲液1.5ml，做空白，照标准曲线测定A值，供试品的A值减空白A值后从标准曲线上查得供试品溶液剩余TAME的微克分子数(X)，按(5－X)×15×0.5＝酶活力单位(U)算出，用得到的酶活除以标示量0.5u，即为标示酶的含量。
本发明的有益效果是主要治疗脑血栓形成各期、脑萎缩、冠心病、心机梗塞、血栓闭塞性脉管炎、血栓性静脉炎、雷诺氏病、大动脉炎、高粘血症等血管血栓性疾病。具有抗凝溶栓、去纤、抗血小板粘附聚集、降脂、扩张血管、促进神经细胞恢复等多种功效，是一种预防和治疗血管血栓性疾病的理想药物。
用法与用量(1)本品每支为1ml，0.25单位。
(2)常规治疗每日一次，每次4～8支，溶于生理盐水250ml静脉滴注，每分钟45滴为宜。
(3)大剂量冲击疗法每日一次，每次8～10支，先将四支溶于生理盐水10-20ml静脉注射，再将其余四支溶于生理盐水250ml静脉滴注，根据病情可在2-4小时后重复注一次。抢救病例遵医嘱。
注意事项(1)本品系蛋白酶制剂，用药前需作过敏试验，用生理盐水将本品稀成0.001单位/ml浓度，取0.1ml作皮试，15分钟观察，红晕直径不超过1厘米或伪足不超过三个者判为阴性。试敏阴性方可使用。用药过程中注意过敏反应，如遇有过敏反应时，应给脱敏药物治疗。
(2)用药过程中出现患肢无力，多眠、头痛等症状无需处理，可以自行缓解。
(3)在医师指导下用药，定期检查血小板，每周一次，如血小板降至8万/mm3以下时需停药，恢复后再继续用药。
(4)用药三周为一疗程，如需继续用药应间隔一周左右为宜，或根据病情连续给药。
禁忌症出凝血机理障碍，低纤维蛋白血症，脑出血二周内者，活动性肺结核和溃疡病，重症高血压，亚急性细菌性心内膜炎，严重肝、肾功能不全者禁用，妇女月经期慎用。
药理学研究通过大量动物实验和临床实践发现对心率、血压、血流量等血液动力学指标的影响，均属良性，在血液流变学方面，红细胞压积，血中胆固醇，甘油三脂，纤维蛋白及血小板均有明显降低。用125碘标记观察其在体内的分布，血液中浓度的变化及自体内排泄，微量元素测定，抗栓酶抗凝及血块溶解作用等均表明具有抗凝，溶栓，去纤，降脂，降低血液粘度，改善微循环，增加血流量，促进冠脉血液供应及脑和肢体血液循环的作用。
毒理学方面的研究主要包括急、慢性毒性学研究。对动物的一般状况，肝，肾功能以及血常规等进行了病理，生化学观察，证明在剂量高于成人每次用量的10-40倍情况下亦未见毒性反应，说明按卫生部暂定标准均属低毒性物质。
微核试验，小白鼠睾丸染色体畸变试验，Ames致突变试验均未发现有致突变和致畸变作用。
为证明本发明的治疗效果，例举临床治疗脑梗塞136病例观察。
(1)临床资料273例中男性172例，女性101例，年龄55～84岁，平均62.34±7.82岁。均於发病48h内入院。於发病24～72h内作头颅CT扫描。CT扫描证实内囊后肢梗塞者22例，内囊前肢梗塞者36例，丘脑梗塞者12例，基底节区多发性腔隙性梗塞者12例，基底节区多发性腔隙性梗塞者25例。273例均有高血压动脉硬化症；其中有糖尿病史者81例，高血脂症123例，均无心律紊乱和心肌梗塞史。
(2)方法入院次晨及治疗一个疗程后次晨各抽血检测全血比粘度、血浆比粘度、红细胞电泳和血球压积，血小板粘附率。
273例按病灶分布随机配对分治疗组，其中136例应用本品治疗，为治疗组。同期137例应用低分子右旋糖酐丹参注射液治疗，为对照组。具体实施为治疗组患者入院次日本品2.5u＋生理盐水20ml，iv，即刻一次；然后3h，6h和12h各本品2u＋生理盐水250ml，ivgtt一次，次日起本品2u＋生理盐水250ml ivgtt每日一次，12天为一个疗程。对照组入院次日低分子右旋糖酐500ml＋丹参注射液16ml，ivgtt每日一次，13天为一个疗程。
(3)结果临床疗效按1981年全国脑血管病会议制定标准判定。治疗组痊愈显效为91.91％(125/136)；对照组为75.18％(103/137)，两组对比男女两组治疗组较对照组显著优(P＜0.05)，但男女总和的比较则治疗组较对照组为非常显著优(P＜0.01)。见表1。血液流变学两组治疗前后对比，除血小板粘附率治疗后较治疗前显著下降外(P＜0.05)，余四项指标均治疗后较治疗前有非常显著粘度下降(P＜0.01)，治疗组与对照组比较，本品在降低血球压积和增加红细胞电泳速度上均优于对照组(P＜0.05)，见表2。
表1 273例急性脑梗塞疗效观察治疗组对照组项目痊愈 显效 好转 无效 痊愈 显效 好转 无效男172 32476 1363117 2女101 28184 0191710 5男 X2＝5.47 P＜0.05P值 女 X2＝6.42 P＜0.05总体 X2＝12.69P＜0.01表2 273例急性脑梗塞血液流变学治疗前后对比治疗组 对照组项目治疗前治疗后P值治疗前治疗后P值HCT41.69±5.78 37.63±6.12 T＝5.6241.21±4.7 38.47±5.49T＝4.43P＜0.01P＜0.01全血 高切 5.34±1.01T＝5.186.38±1.32 5.64±1.21 T＝4.846.01±1.02 P＜0.01P＜0.01粘度 低切 11.73±0.89 T＝12.60 12.98±1.02 11.11±0.91T＝16.0113.15±0.97 P＜0.01P＜0.01血浆比 1.72±0.711.49±0.23T＝3.591.69±0.58 1.52±0.32 T＝3.00粘度 P＜0.01P＜0.01红细胞 20.18±1.59 17.23±1.24 T＝17.06 21.28±1.62 18.99±1.78T＝11.14电泳S P＜0.01P＜0.01血小板 0.38±0.370.30±0.21T＝2.190.38±0.43 0.28±0.37 T＝2.06粘附率 P＜0.05P＜0.05经动物实验证实本品具有降低血浆纤维蛋白原浓度，降低血粘度70％，血胆固醇14％、甘油三脂23.8％，并使血栓素(TXB2)略有降低，PGI2升高53.8％的作用，因此在用药10h后使栓子表面及横切面纤维变细，变短和部分栓子断裂，在蝮蛇毒中发现神经生长因子。
为证明本发明的治疗效果，例举临床治疗冠心病心绞痛84病例观察。
(1)研究对象分治疗组和自身随机对照组。冠心病治疗组84例中男49例，女35例，年龄39～82岁，平均50.6岁，病程一年之内19例，1～5年44例，5～10年11例，10年以上10例。发作次数每日3次以上，最多7次。其中稳定型心绞痛45例，不稳定性心绞痛39例。以上病例符合1979年全国冠心病防治诊断参考标准。自身对照组服消心痛50例，男39例，女11例。
(2)研究方法分本品治疗冠心病心绞痛治疗组，消心痛对照组。给药方法本品治疗组1.5u加入0.9％生理盐水250ml，静滴每分钟30～50滴，21天为一疗程。对照组给消心痛每次10mg，一日3次，4周为一疗程。
(3)结果心绞痛止痛疗效显效 ％ 有效 ％ 无效％总有效率％本品 23 27.38 57 61.71 1011.9 74 88.09消心痛19 3825 506 1244 88P值 70.05心电图疗效显效 ％ 有效 ％ 无效％总有效率％本品 16 19.04 23 27.38 4553.57 39 46.42消心痛15 30.0 7 142856.0 22 44.0P值 70.05治疗前后血液流变学变化
本品治疗冠心病心绞痛研究观察，心绞痛症状疗效为88.09％，心电图疗效46.42％，说明对冠心病心绞痛有一定疗效。有一定的扩冠和改善冠脉循环解除冠脉痉挛的作用。可减少TXA2含量，增加前列腺环素，降低血中大分子物质，降低血中纤维蛋白原含量，从而降低了血液粘稠度，减轻冠脉阻力，改善了冠脉循环。副作用除一例轻度牙龈出血外，无其它副作用，肝肾功能无变化。
具体实施例方式实施例1第一步G75层析柱层析，经0.2M NaOH处理后装柱，用0.2M磷酸氢二钠缓冲液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于0.2M磷酸氢二钠缓冲液10ml中，离心上样，上柱，以0.02M磷酸氢二钠缓冲液洗脱，用分部收集器收集，收集酶活峰浓缩冻干。蝮蛇毒为江浙蝮蛇蛇毒冻干粉。
第二步Sephadex-A25层析柱层析，用0.01M Tris-HCl缓冲液，PH7.0浸泡凝胶，Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液中(三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度为0.01M～0.05M，PH值为7.5)，Sephadex(交联葡萄聚糖)。然后装入柱中，用0.01 M Tris-HCl缓冲液平衡。将第一步层析的样品溶于0.01M Tris-HCl缓冲液中上柱，缓冲液平衡，用0.01M NaCl的缓冲液洗去杂蛋白，换0.5M NaCl的缓冲液洗脱，收集酶活峰，浓缩冻干。
第三步取上述干粉，测定该干粉10.5单位/mg。分瓶包装，得粉针剂，0.25u/支。取上述干粉，加生理盐水，1000ml生理盐水中加入23.8mg干粉，以0.22μm微孔滤膜过滤，以1ml/支灌封于1ml安瓶中得水针剂，0.25u/支。操作温度10～14℃。
经上述的方法制备的治疗脑血栓的针剂含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽释放酶与神经生长因子，其中精氨酸脂酶活性成份占总重量的70％。
实施例2第一步G75柱层析，经0.15MNaOH处理后装柱，用0.15M磷酸二氢钠缓冲液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于10ml上述缓冲液中，离心上样，上柱，以0.01M磷酸二氢钠缓冲液洗脱，用分部收集器收集，收集酶活峰浓缩冻干。
第二步Sephadex-A25层析柱层析，用0.01M Tris-HCl缓冲液，PH7.0浸泡凝胶，然后装入柱中，用0.01M Tris-HCl缓冲液平衡。将第一步层析的样品溶于0.01M Tris-HCl缓冲液中上柱，缓冲液平衡，用0.01M NaCl的缓冲液洗去杂蛋白，换0.45M NaCl的缓冲液洗脱，收集酶活峰，浓缩冻干。第三步同实施例1，包装得粉针剂或水针剂。
经上述的方法制备的治疗脑血栓的针剂含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽释放酶与神经生长因子，其中精氨酸脂酶活性成份占总重量的71％。
实施例3第一步G75柱层析，经0.3M NaOH处理后装柱，用0.3M磷酸氢二钠缓冲液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于10ml上述缓冲液中，离心上样，上柱，以0.03M磷酸氢二钠缓冲液洗脱，用分部收集器收集，收集酶活峰浓缩冻干。
第二步Sephadex-A25层析柱层析，用0.01M Tris-HCl缓冲液，PH7.0浸泡凝胶，然后装入柱中，用0.01 M Tris-HCl缓冲液平衡。将第一步层析的样品溶于0.01 M Tris-HCl缓冲液中上柱，缓冲液平衡，用0.01M NaCl的缓冲液洗去杂蛋白，换0.8M NaCl的缓冲液洗脱，收集酶活峰，浓缩冻干。第三步同实施例1，包装得粉针剂或水针剂。
经上述的方法制备的治疗脑血栓的针剂含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽释放酶与神经生长因子，其中精氨酸脂酶活性成份占总重量的70.5％。
权利要求
1.治疗脑血栓的针剂制法，分两次层析和包装工艺，其特征是第一步G75层析柱层析，取蝮蛇毒溶于0.15～0.3M磷酸盐缓冲液中，离心上样，上柱，以0.01～0.03M磷酸盐缓冲液洗脱，用分部收集器收集，收集酶活峰，浓缩冻干；第二步Sephadex-A25层析柱层析，用0.01M Tris-HCl缓冲液，PH7.0浸泡凝胶，然后装入柱中，用0.01 M Tris-HCl缓冲液平衡，将第一步层析的样品溶于0.01M Tris-HCl缓冲液中上柱，缓冲液平衡，用0.01M NaCl的缓冲液洗去杂蛋白，换0.45～0.8M NaCl的缓冲液洗脱，收集酶活峰，浓缩冻干，得干粉。
2.根据权利要求1所述的治疗脑血栓的针剂制法，其特征是G75层析柱是经0.15～0.3M NaOH处理后装柱，用0.15～0.3M磷酸盐缓冲液平衡PH6.8。
3.根据权利要求1所述的治疗脑血栓的针剂制法，其特征是磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。
4.根据权利要求1所述的治疗脑血栓的针剂制法，其特征是取上述干粉，包装得粉针剂；取上述干粉加生理盐水，以0.22μm微孔滤膜过滤，以1ml/支灌封于1ml安瓶中得水针剂；0.25u/支。
5.根据权利要求1所述的治疗脑血栓的针剂制法，其特征是操作温度10～14℃。
6.根据权利要求1所述的治疗脑血栓的针剂制法，其特征是原料冻干蝮蛇毒为江浙蝮蛇蛇毒冻干粉。
7.如权利要求1所述的制法治疗脑血栓的针剂，其特征是含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽释放酶与神经生长因子，其中精氨酸脂酶活性成份占总重量不低于70％。
全文摘要
治疗脑血栓的针剂及其制法,是针对治疗脑血栓病人而提出的一种含生物活性物质具有溶栓、抗凝、抗血小板聚集,改善微循环的治疗脑血栓的针剂及其制法。制备方法为:G75层析柱层析,取蝮蛇毒溶于磷酸盐缓冲液中,离心上样,上柱,以磷酸盐缓冲液洗脱,收集酶活峰,浓缩冻干。Sephadex－A25层析柱层析,用Tris－HCl缓冲液,PH7.0浸泡凝胶,然后装入柱中,将层析的样品溶于Tris－HCl缓冲液中上柱,用NaCl的缓冲液洗脱,收集酶活峰,浓缩冻干,得干粉。针剂含有精氨酸脂酶活性成份占总重量不低于70%。主要治疗脑血栓形成各期、脑萎缩、冠心病、心机梗塞、血栓闭塞性脉管炎、血栓性静脉炎、雷诺氏病、大动脉炎、高粘血症等血管血栓性疾病。
文档编号A61K38/43GK1333057SQ0112798
公开日2002年1月30日 申请日期2001年7月25日 优先权日2001年7月25日
发明者郝文学 申请人:郝文学