专利名称：对于治疗和预防衣原体感染有效的源于植物的与合成的酚类化合物和植物提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及有效的源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物以及包含它们的组合物，其有益于衣原体感染的治疗和预防，本发明也涉及源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物以及包含它们的组合物在衣原体感染的治疗和预防中的用途。源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物可以用于药物制剂、食物添加组合物和有益健康的功能性食品的制备。
衣原体是小的革兰氏阴性细菌。由于它们独特的细胞内繁殖周期，将它们归类为一个单独的衣原体目(Chlamydiales)，包括衣原体属(Chlamydia)。衣原体属最初已经分成两个种，砂眼衣原体(C.trachomatis)和鹦鹉热衣原体(C.psittaci)。这一分类基于生化特性砂眼衣原体 鹦鹉热衣原体糖原在衣原体包涵体中的积累+ -(碘染色+)对磺胺类(sulpha)药物的敏感性+ -刚开始时，“砂眼衣原体”被认为是同质的种群，而“鹦鹉热衣原体”是非常异质的种群。当发现某种不通过鸟类接触而能引起呼吸系统感染的衣原体菌株(后来知道是肺炎衣原体(C.pneumoniae))时，其无可置疑地被认为属于“鹦鹉热衣原体”种群，因为其满足上述基于生物化学的条件。砂眼衣原体和肺炎衣原体在它们的表面结构方面是不同的。砂眼衣原体表面结构的主要成分是主要外膜蛋白(MOMP)，其在4个不同的位点变化，由此提供了目前将砂眼衣原体分类成差不多20种不同免疫型的依据。在肺炎衣原体中，MOMP是非常保守的，发现其只有一种免疫型。另外，组织中的靶细胞是不同的在砂眼衣原体的情况中是生殖器和结膜的上皮细胞，在肺炎衣原体的情况中是呼吸道的上皮细胞。前者，除罕见的性病淋巴颗粒瘤菌株(LGV)外，不能在吞噬细胞和巨噬细胞中繁殖，而吞噬细胞和巨噬细胞特别地构成了后者的靶细胞。当渗入细胞时，肺炎衣原体利用肝素受体，而该受体却不被除LGV外的生殖器衣原体所利用。此外，传播路线和结果导致的临床症状是不同的肺炎衣原体通过呼吸道传播，并可以在单核细胞内散布入循环系统中，然而砂眼衣原体主要通过性接触传播。另外，治疗方法不同对于砂眼衣原体通常用单次剂量治疗，然而对于肺炎衣原体，甚至推荐进行3个星期的抗生素疗程。
由这些衣原体物种引起的或与其相关联的疾病的名单列于下面砂眼衣原体-结膜炎-子宫颈炎-尿道炎-盆腔炎症性疾病(PID)-新生儿感染如婴儿肺炎-腹膜炎-肝周炎-反应性关节炎肺炎衣原体-上呼吸道感染-支气管炎-肺炎-慢性阻塞性肺病(COPD)-哮喘-血管炎-动脉粥样硬化及其并发症-大脑炎-某些类型的多发性硬化-部分的阿尔茨海默氏病的晚期发病早在1989年就已如此清晰地表明不通过鸟类接触而能引起呼吸系统感染的衣原体菌株在遗传上不同于砂眼衣原体和所描述的鹦鹉热衣原体物种，以至将该菌株分类为它自己的一个物种——肺炎衣原体。它与砂眼衣原体的核酸同源性低于10％。砂眼衣原体含有基因组外质粒，而在人类肺炎衣原体菌株中却没有发现。两者物种的基因组已被测序，肺炎衣原体的基因数目比砂眼衣原体高得多(大约200)。在新近的衣原体的重新分类中，其已经转移到一个完全不同的属——Chlamydophila中。这样，就有良好的理由相信从砂眼衣原体所获知的一切不能应用于肺炎衣原体。
最常见的人类中的衣原体物种是肺炎衣原体和砂眼衣原体，它们引起常见的重大疾病。鹦鹉热衣原体在动物界中分布相当广泛，但是其只是偶而也能引起人体中的感染。另外知道猫心衣原体(C.pecorum)引起反刍动物中的感染。衣原体目中新的属和种的分类正在进行中。
肺炎衣原体是最常见的人类的衣原体，差不多每个人在一生中要受到其2至3次感染。肺炎衣原体能够容易地侵袭肺组织和在巨噬细胞与血管内皮中繁殖。由肺炎衣原体所引起的呼吸系统感染的临床症状从通常的儿童轻度上呼吸道感染到成人的严重性肺炎大范围地变化。所有肺炎的5-10％是由肺炎衣原体引起的。肺炎衣原体作为气道传染从人传播到人。明显地，某些个体是有效的传播介质，因为只有在学龄期传染变得更普遍。在北欧国家，由肺炎衣原体引起的感染作为带有大约6年间隔期的2至3年长的流行病发生。
衣原体感染具有隐匿和潜伏的特性，它们的慢性晚期并发症显然是所有之中最重要的。流行病学研究指出慢性肺炎衣原体感染和动脉粥样硬化之间具有重要的关联；许多研究也揭示出衣原体感染和急性心肌梗塞(AMI)发病率之间的联系。此外，慢性肺炎衣原体感染显然在哮喘及慢性阻塞性肺病的发作中起了作用。
动脉硬化(arteriosclerosis)是一种慢性炎症状态，能够在超过一半的动脉粥样斑中的泡沫细胞和平滑肌细胞中证明含有肺炎衣原体颗粒。在AMI的病人中通常会发生对于衣原体脂多糖(LPS)的免疫反应，这表明感染的加剧。也有可能在受损的心脏瓣膜中检测出衣原体，它们在腹部主动脉瘤中尤其丰富。另外，发现肺炎衣原体在脑梗塞和短暂的大脑局部缺血发作中起着作用。到目前为止，最终并不清楚于受损部位找到的衣原体在损害本身的发展中所起的作用，但是在这些疾病的缓慢进展中的一个因素无论如何似乎是慢性衣原体感染。可是在动物模型中，表明肺炎衣原体可发动和加速动脉粥样硬化的发展。流行病学和临床研究表明在慢性肺炎衣原体感染和动脉粥样硬化与AMI之间有着清楚的关系。在最近的研究中，断定肺炎衣原体感染是心脏病事件的危险因素。肺炎衣原体感染通常与吸烟相联系，吸烟明显地易于得慢性衣原体感染。
发现抗生素治疗可减少心脏发病的危险，使用抗生素治疗还有可能影响常见的炎症标记物CRP和血清纤维蛋白原的水平。在大多数工业化国家中，当抗衣原体非常有效的抗生素的使用在治疗其他的感染之中变得普遍时，心脏疾病的发病率开始下降。
砂眼衣原体是妇女生殖器感染最重要的原因。另外，一部分的育龄妇女细菌培养阴性尿道感染是由砂眼衣原体引起的。砂眼衣原体是慢性子宫内膜异位的常见原因，PID是妇女中砂眼衣原体感染最常见的并发症。砂眼衣原体感染可以几乎是无症状的，甚至宫外孕和不育被认为是由隐匿的沉默性感染引起的梗阻性疤痕形成的并发症。大约一半出生时为衣原体携带者的儿童会在出生时受到感染，大约一半的受感染的新生儿会发展成为带有砂眼衣原体肺炎作为并发症的包涵体性结膜炎。砂眼衣原体也可引起男子的生殖器感染。
衣原体对于四环素和红霉素是敏感的；利福平和某些新的fluorokinolones也是有效的。与例如肺炎衣原体相反，砂眼衣原体对于磺胺类药物也是敏感的。尽管对于治疗有反应，衣原体感染还是常常复发，且有变成慢性的危险。由于衣原体只在细胞中繁殖，因此高效集中进入细胞的新的大环内酯抗生素和氮杂内酯类现在成为四环素和红霉素的替代物从而作为首选药物。在复杂的衣原体感染中，治疗可能不得不持续较长时间，例如在由衣原体引起的莱特病中推荐进行三个星期的治疗。
迄今，还没有预防衣原体感染的疫苗。免疫反应的特性还未得到充分的了解，而且一种向超敏反应的趋向与之有关系。
在专利EP 0 377 722中，描述了评价心脏梗塞危险性的方法、诊断心脏与血管疾病的方法和抗衣原体有效的药物的应用。在该出版物中，将四环素、红霉素、利福平和fluorokinolones描述为对于治疗或预防衣原体引起的慢性心脏疾病合适的药物。
WO 98/50074描述了一种抗衣原体试剂的组合，其中的活性成分各自在衣原体生活周期的某个阶段起作用，该组合特别用于肺炎衣原体引起的感染的治疗。
在专利US 5 830 874中，描述了诊断肺炎衣原体引起的动脉衣原体肉芽肿的方法和用于治疗动脉衣原体肉芽肿病的治疗用组合物。作为合适的具有治疗效用的化合物，提到了抗衣原体有效的四环素、红霉素、克拉霉素、氮红霉素(azitromycin)和kinolones等等。
专利JP 10 139 686描述了2-(3，4-dimetoxycinnamoyl)-氨基苯甲酸作为以100-1000mg的日剂量而具有治疗活性的化合物在治疗由肺炎衣原体引起的动脉粥样硬化中的应用。
根据上述资料，就有对于能够用于治疗和预防衣原体感染的新的化合物和组合物的明显需要。
从莽草酸经过生物合成途径形成的shikimates或化合物、经过乙酸-丙二酸生物合成途径形成的化合物和经过两个途径联合形成的化合物属于源于植物的酚类化合物。简单的aromates、酚、香豆素、木聚素、木素与类黄酮和它们的衍生物属于所述化合物。简单的aromates主要包括丙苯衍生物和甲苯衍生物。在自然界中，结构上为酚类化合物的类黄酮形成了分布广泛的植物色素类。类黄酮出现于植物界的各处、苔藓植物、景天(stonecrop)科和别的低等植物中。特别从高等植物和维管植物中发现了它们，它们出现于所有的水果和蔬菜中，还出现在茶叶和酒尤其是红酒中。类黄酮在自然界中主要以糖苷的形式存在，但是它们也能够以所谓的苷元的形式成为游离的酚和硫酸盐，或者与多糖和蛋白质结合。在大多数情况下，类黄酮是具有它们的化学结构的多酚类化合物。从植物中已经鉴定出超过8000种类黄酮，它们具有无数的功能。由于它们的苦味，其可以保护植物抗有害昆虫；由于它们的抗生素特性，其可以保护植物抗病毒和细菌。根据目前的看法，类黄酮不是营养上的重要化合物，但它们似乎具有对健康有益的效用。这种效用显然地不依赖于植物中所含的维生素和矿物质。几乎没有人能够避免摄取类黄酮，但是它们起效用的可能性总之取决于吸收特性和生物利用率，另外还取决于同时获得的类黄酮之间的相互作用。
天然酚类化合物的抗氧化剂效用已经知道了相当长一段时间，抗氧化剂效用和对自由基的捕获已在几个研究项目中进行了研究。根据目前的研究资料，认为类黄酮防止LDL胆固醇氧化的能力是它们最重要的特性之一。血管内皮下膜中LDL胆固醇的氧化是动脉粥样化形成的最初因素。许多研究显示出从营养物中类黄酮摄取量的不足将成为由心脏和血管疾病引起的发病的一个重要因素。在关于类黄酮的人类研究中，只观测到少许最重要的类黄酮，其中的栎精显示出防止LDL胆固醇氧化的能力，因此可降低冠状动脉疾病的危险性，因为氧化的LDL胆固醇明显地与动脉粥样硬化阶段有关。
例如根据一项荷兰的研究，从营养物中类黄酮的日摄取量在0-30mg间变化。在芬兰人中进行的研究之中，注意到类黄酮显示出不大的抗心脏和血管疾病的发病的保护效能，但是另一方面类黄酮摄取量的差异相当小，总的数量大约为每天2-6mg。在一项于荷兰进行的研究中，注意到从营养中可得的黄酮醇与黄烷醇和心脏与血管疾病引起的死亡案例呈反比关系。还注意到黄酮醇与黄酮的摄取量和心脏梗塞的危险性呈反比关系。更进一步知道类黄酮对于炎症和免疫反应以及许多其他细胞功能具有效用。某些类黄酮和许多别的酚天然化合物能够防止或提高细胞对钙的摄取，这一点在稍后出现的表1中也得到了证明。
钙离子通道阻断药物在心脏与血管疾病如心脏缺氧引起的胸痛的治疗，和心肌梗死、动脉粥样硬化与高血压的治疗中起着重要的作用。这些药物通过防止钙离子向细胞的流入而作用于钙离子通道，从而扩大了冠状动脉和降低了血管的外周阻力，这样心脏的负担就减少了。为了找到从自然界中分离出的化合物的钙离子通道阻断效应，钙离子通道阻断剂的大规模使用例如导致了筛选程序的发展。作为研究中的筛选介质，如来源于大鼠(GH4C1)脑下垂体后叶的肿瘤的连续细胞系得到了应用，还使用了膜片钳技术，在该技术中可以每次检查一个细胞中单独的钙离子通道。作为研究的结果，已经发现了具有钙离子通道阻断或激活效用的天然存在的化合物和提取物。这些化合物是在源于植物的简单酚、香豆素、类黄酮和富含所述化合物的提取物中发现的。这些化合物中的一些具有可与维拉帕米相比的阻断效用，而一些化合物具有提高钙离子向细胞的流入的趋向。
本发明涉及有效的源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物以及包含它们的组合物，其有益于衣原体感染的治疗和预防，本发明也涉及源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物以及包含它们的组合物在衣原体感染的治疗和预防中的用途。
根据本发明的源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物的特征，和根据本发明的包含它们的组合物的特征，以及它们在衣原体感染的治疗和预防中的用途出现于专利权利要求中；它们在药剂或有益于健康的食品的生产中的用途也出现于其中，这些药剂和食品有益于衣原体感染的治疗和预防。
令人惊讶的是发现有些源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和含有该源于植物的化合物的植物提取物、组分与部分组分具有类抗生素的强的抗衣原体效用。根据本发明，源于植物的酚类化合物是从莽草酸经过生物合成途径形成的酚类化合物、经过乙酸-丙二酸途径形成的酚类化合物和作为两个途径联合的结果而形成的酚类化合物。这些化合物(如简单的aromates、酚、香豆素、木聚素、木素和类黄酮)是从植物界产品，例如水果和蔬菜，尤其是柑橘类水果、蔬菜、浆果、洋葱、茶叶、红酒等等之中获得的。
源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和含有它们的提取物、组分与部分组分可以就这样使用，或者将它们混和使用，可选地与大蒜中所含的硫化合物如alliicine或alliicine的衍生物联合使用。
优选的源于植物的天然酚类化合物为类黄酮，以及甲苯与丙苯衍生物、酚酸、三萜、香豆素与儿茶素(cathecin)和含有它们的提取物与部分组分，以及含有简单酚、类黄酮、它们的衍生物、多酚、二萜酚与二萜醌的组分，以及除去了鞣酸与二萜组分的组分。优选的化合物还为相应的合成化合物及其衍生物和药物上可用的盐、酯与上面提到的化合物的衍生物。
优选的化合物及其提取物为具有大于等于30％的抗衣原体效用(抑制包涵体的形成)的物质，特别优选的化合物为具有大于等于90％的抗衣原体效用的物质，这些在实施例中有详细说明。下面列有几组优选的化合物和提取物-黄酮类，例如芹黄素、藤黄菌素、黄酮-黄酮醇类，例如栎精、鼠李黄素、桑色素-黄烷酮类(Flavonones)，例如柚皮苷-异黄酮类，例如染料木黄酮-甲苯衍生的化合物，例如甲基棓酸、丙基棓酸、辛基棓酸、十二烷基棓酸、异丙基棓酸-丙苯衍生的化合物，例如-像繖形酮、莨菪亭、甲氧基补骨脂素、花椒毒素和香豆素的香豆素类-像(-)-表棓儿茶素(epigallocatechin)、(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素棓酸的黄烷-3-醇类-合成化合物，例如类黄酮和像香豆素106、2′-甲氧基-α-萘并(naphto)-黄酮、6，2′-二甲氧基黄酮，6-甲基香豆素、α-萘并黄酮、鱼藤酮(rotanone)、7-二乙基-氨基-3-噻吩甲酰基香豆素的香豆素类-天然植物提取物，例如欧薄荷(Mentha longifolia)、龙脑薄荷(Mentha arvensis)、大花鼬瓣花(Galeopsis speciosa)、撒尔维亚(Salvia officinalis)、麝香草(Thymus vulgaris)、小酸模(Rumexacetocella)、玫瑰(Rosa rugosa)、兔儿尾苗(Veronica longifolia)、多刺紫草(Symphytum asperum)、北艾(Artemisia vularis)、铃兰(Convallaria majalis)、夏栎(Quercus robur)、野胡萝卜(Daucuscarota)、草莓(Fragaria iinumae)、甘蓝(Brassica oleracea)、欧洲油菜(Brassica napus)、紫苜蓿(Medicago sativa)、甜橙(Citrussinensis)、Phloem flour、黑果越桔(Vaccihum myrtillus)的提取物源于植物的酚类化合物和含有它们的提取物与部分组分可以方便地通过使用任何用于提取和分离物质的传统技术从天然植物或它们的局部获得。茎(braces)、根或叶经过合适的水蒸馏和浸渍或只经过水蒸馏以获得所需的提取物，其可以进一步用任何本领域中熟练的技术人员所熟知的传统纯化技术来进行纯化。相应的合成化合物或它们的衍生物通常为商业上可获得的物质，或者它们可以通过用任何所知的合成方法进行制备。
在下面的表1中，提供了某些优选的根据本发明的源于植物的酚类化合物、化合物对于钙离子向细胞内流入的影响、抗氧化剂效用和化学结构。
在下面的图解A、B、C、D和E中给出了出现于表1中的化合物的化学结构。图解A给出的是黄酮类、黄酮醇类，图解B给出的是黄烷酮类，图解C给出的是异黄酮类，图解D给出的是甲苯衍生物，图解E给出的是丙苯衍生物。取代基R1-7参见表1中给出的各自的官能基团。 表1化合物(20μg/ml)R1R2R3R4R5R6R7对Ca2+摄取 S.E.MMwIC50[moles L-1]的影响[％]抗DPPH黄酮(结构A)芹黄素aOH H OH HH OH H -29.3 4.0 270.2 ＞3.70×10-3藤黄菌素aOH H OH OH H OH H -51.4 7.7 286.2 1.20×10-5金合欢素aOCH3H OH HH OH H -1.39 1.9 284.3 ＞3.52×10-3黄酮aH H H HH H H -63.5 3.0 222.2 ＞4.50×10-3牡荆碱aOH H OH HGluOH H -2.12 5.1 432.4 n.d.牡荆碱-2″-O-鼠李糖苷aOH H OH HGluRha OH H -14.6 0.3 587.5 n.d.藤黄菌素-7-葡萄糖苷aOH H OGluOH H OH H -16.3 1.3 448.4 1.07×10-5藤黄菌素-3′，7-葡萄糖苷aOH H OGluOglu H OH H -14.6 3.3 610.5 nd黄酮醇(结构A)栎精aOH OH OH OH H OH H +54.1 6.9 302.2 1.07×10-5鼠李黄素aOH OH OCH3OH H OH H +6.63 0.8 316.3 1.21×10-5异鼠李黄素aOH OH OH OCH3H OH H +52.4 2.3 316.3 1.81×10-5桑色素aOH OH OH H HOH OH +48.0 5.9 302.2 2.39×10-5栎苷aOH ORhaOH OH H OH H +20.1 0.6 448.4 1.29×10-5芸香苷aOH ORutOH OH H OH H -3.88 6.0 610.5 1.02×10-5黄烷酮(结构B)柚皮素aOH OH H HOH - - -56.3 5.6 272.3 ＞3.67×10-3柚皮苷aOH ORhaGlu H HOH - - +6.5 7.5 580.5 7.30×10-3异黄酮(结构C)大豆黄素aH OH OH H- - - -26.2 1.2 254.2 ＞3.93×10-3染料木黄酮aH OH OH OH - - - -54.6 1.7 270.2 ＞3.70×10-3大豆苷aH OGluOH H -- - - +7.6 5.9 416.4 n.d.染料木苷aH OGluOH OH - - - -3.39 5.9 432.4 n.d.表1(续)化合物(20μg/ml) R1R2R3R4R5R6R7对Ca2+摄取 S.E.M MwIC50[moles L-1]甲苯 的影响(％) 抗DPPH(结构D)苯甲酸dOH H H H --- -9.82 1.9122.1 ＞8.19×10-3五倍子酸dOH OH OHOH --- -5.33 1.3170.12.15×10-5丁香酸aOH OCH3OHOCH3--- -10.9 4.0198.23.26×10-5甲基棓酸bOCH3OH OHOH --- -21.2 6.4184.15.09×10-6丙基棓酸cO(CH2)2CH3OH OHOH --- -37.9 4.1212.21.33×10-5辛基棓酸cO(CH2)7CH3OH OHOH --- -92.2 7.8282.31.70×10-5十二烷基棓酸cO(CH2)11CH3OH OHOH --- -40.4 6.8338.41.54×10-5丙苯(结构E)咖啡酸aOH - - - --- +9.71 2.4180.22.14×10-5阿魏酸bOCH3- - - --- +9.23 2.1194.24.43×10-5化合物提供者aRoth，Germany；bSigma，MO，USA；cFluka，Switzerland；dE.Merck，GermanyMw 化合物的分子量(g/moles)糖部分的缩写 Glu＝葡萄糖，OGlu＝葡萄糖苷，ORha＝鼠李糖苷，ORut＝芸香糖苷，OGluRha＝葡萄糖鼠李糖苷，ORhaGlu＝鼠李糖葡萄糖苷n.d. 不确定的在实施例1-4中研究了源于植物的酚类化合物栎精、桑色素、鼠李黄素和辛基棓酸对于肺炎衣原体和砂眼衣原体的抗衣原体效用。所有的这些化合物于0.5-50μg的浓度时抑制了肺炎衣原体的生长，当使用预处理的宿主细胞时栎精、桑色素和鼠李黄素尤其显示出对砂眼衣原体的效用。因而用于治疗和预防肺炎衣原体感染的优选的化合物为例如从天然物质中分离得到的酚类化合物栎精、桑色素、鼠李黄素和辛基棓酸，用于治疗和预防砂眼衣原体感染的优选的化合物依次为栎精、桑色素和鼠李黄素以及含有它们的提取物与部分组分。
在实施例5中，同样也研究了其他源于植物的酚类化合物、某些合成的类黄酮与香豆素以及源于植物的酚类化合物与大蒜的混和物在使用50μg的浓度时的抗衣原体效用，其显示出不平常的抑制效能。相应地，也研究了大蒜中含有的alliicine对肺炎衣原体的抗衣原体效用，并得到了相似的结果。
在实施例6中，研究了天然植物提取物和食用植物提取物的抗衣原体效用，其显示出极好的抑制效能。
优选的化合物及提取物与组分为具有大于等于30％的抗衣原体效用(抑制包涵体的形成)的物质，特别优选的化合物为具有大于等于90％的抗衣原体效用的物质，这些在实施例中有详细说明。
根据本发明的化合物通常具有抗衣原体效用，另外也是抗氧化剂，并有着影响Ca2+摄取入细胞的作用。
辛基棓酸也是一种通常用作食物添加剂的化合物。
作为活性成分，源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物与组分以及它们的混和物可以定量以使其按苷元计算的日用量为25μg至3000mg。根据本发明，源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物与组分以及它们的混和物可以以胶囊、片剂、软膏、液体制剂或别的相应的本领域熟练的技术人员所知的形式制备成药物制剂。该制剂含有的活性成分按苷元计算的日用量为25μg至3000mg，优选地按单位药剂计算为25μg至500mg。
源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物与组分以及它们的混和物也可以就这样加入食品中，或者它们能够制成适用于食品的组合物，例如草药制剂、调味品、粒剂或相似物质，该组合物可以就这样使用，加入到与该产品相关的日常食物或也被称作促健康(pro-health)产品的有益健康的功能性食品，如速制食物、粥、色拉调料、饮料、奶制品、食用脂肪、冷冻产品、冻干食品、特制食品、马铃薯片(potato ship)、浸渍沙司等等中。源于植物的酚类化合物和相应的合成化合物与它们的衍生物可以以苷元的形式或糖苷的形式存在于根据本发明的组合物中。
根据本发明的源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物与组分以及它们的混和物作为化合物是安全的。根据本发明的组合物和制剂都可以用于急性衣原体感染的疗程，或者持续而有规律地与日常食物一起服用该组合物或制剂以便预防衣原体感染。因为慢性冠状动脉心脏病在相当程度上造成人员休养及在另一方面造成对国民经济的高额花费，所以使用根据本发明的源于植物的酚类化合物、相应的合成化合物与它们的衍生物和植物提取物与组分及它们的混和物以及使用包含它们的新组合物就可能在相当程度上预防和减缓心脏与血管疾病的增加和暴发，尤其是在危险人群中。根据本发明的组合物和制剂还可以用于急性砂眼衣原体感染的治疗和预防以及用于随后并发症如不育、宫外孕和宫颈癌的预防，还可用于其他衣原体相关的感染与并发症的治疗和预防。
本发明在下面的实施例中进行更详细地证明，但是本发明无论如何也不是只局限于这些实施例。在实施例中，描述了根据本发明的化合物和植物提取物对于肺炎衣原体与砂眼衣原体的直接的抗衣原体效用，以及化合物和提取物对于所用的宿主细胞(HL细胞、人的肺组织、标准二倍体细胞系)的毒性。
化合物 以DMSO为对照的抑制率(％)以DMSO为对照的抑制率(％)(浓度0.5μM)(预处理)*栎精 0 20桑色素0 100鼠李黄素 0 17OG0 0*宿主细胞和待研究的化合物于感染前一起培养一天。将1ml维持培养基中待研究的化合物按照和测试程序本身中一样的浓度加入到含有宿主细胞的24孔平板中。这样做的目的是为了研究化合物对于宿主细胞本身的可能的影响，该影响可能成为抑制感染的一个因素。测试程序按照测定方法中所描述的方式继续进行。
芹黄素100藤黄菌素 100黄酮 90牡荆碱3牡荆碱-2″-O-鼠李糖苷 11藤黄菌素-7-葡萄糖苷 23藤黄菌素-3′，7-葡萄糖苷 45栎精 90鼠李黄素 100异鼠李黄素70桑色素100栎苷 50芸香苷46柚皮素16柚皮苷66大豆黄素 51染料木黄酮60大豆苷0染料木苷 37矢车菊苷配质B130矢车菊苷配质B202.天然酚酸苯甲酸44五倍子酸 27丁香酸32咖啡酸78阿魏酸14甲基棓酸 100
丙基棓酸 100辛基棓酸 100十二烷基棓酸 1003.天然三萜白藜芦醇 544.天然香豆素和儿茶素莨菪亭 96甲氧基补骨脂素 100繖形酮 75花椒毒素 94香豆素 28(-)-表儿茶素棓酸 85(-)-表棓儿茶素 58(-)-表儿茶素 75(+)-儿茶素 765.合成的类黄酮和香豆素3-(α-丙酮基苄基)-4-羟基香豆素 0香豆素10263香豆素1061002′-甲氧基-α-萘并黄酮 1006，2′-二甲氧基黄酮 736-甲基香豆素 71α-萘并黄酮 92鱼藤酮 1007-二乙基氨基-3-噻吩甲酰基香豆素 1003-(2-苯并噁唑基(benzoxazoyl))繖形酮 28
香豆素30 503-苯甲酰苯并(F)香豆素 626，8-二溴香豆素-3-羧酸04-甲基-3-苯基香豆素 06.混和物辛基棓酸 100辛基棓酸1/10 53辛基棓酸1/100 17大蒜 26大蒜1/10 25大蒜1/100 19辛基棓酸50％+大蒜50％ 100辛基棓酸50％+大蒜50％1/10 47辛基棓酸50％+大蒜50％1/10034辛基棓酸50％+大蒜50％1/1000 6
下面显示的是经挑选的最具活性的天然植物提取物抗肺炎衣原体的结果，该结果从四种不同的评定计算而得。
下面显示的是经挑选的最具活性的食用植物提取物表现出对肺炎衣原体100％抑制的结果，该结果从四种不同的评定计算而得。
在有机地和正常地生长的植物之间没有观察到显著的活性上的差异。
在该研究中，认为显示出对肺炎衣原体包涵体(n＝4)100％抑制的植物提取物是有活性的。发现五种属于唇形科的植物具有特别的活性。不管提取的方法，经过水蒸馏和浸渍或只经过水蒸馏的撒尔维亚提取物具有抗肺炎衣原体的活性。
下面提供了所用微生物学方法的描述。1.HL细胞的培养和传代每隔3天进行HL细胞的传代培养。在感染前一天将宿主细胞接种。细胞经一次10ml的PBS漂洗，并通过胰蛋白酶消化(1∶10，1.5-2.0ml/瓶；在+37℃大约于层流柜中5分钟或于CO2中2分钟)而收获。细胞悬浮液稀释至大约每毫升营养培养基(RN)350000个细胞的水平。在+37℃条件下培养，每星期换1-2次RN培养基和CO2(5.0％)。HL细胞可以冷冻于液氮(1ml 7.5％FCS(RN)+1ml DMSO)中。2.衣原体的纯化EB(原体)＝衣原体具传染性的细胞外形式。在前一天，取出所需数量的被衣原体感染的HL细胞的悬浮液解冻。将细胞良好地悬浮，并在超声波床内保持总共2分钟[20秒的超声处理(振幅为24-25)和10秒的冷却，共进行6次]。细胞破裂了，而衣原体未被破坏。
悬浮液在1600rpm(550xg)离心10分钟，其中衣原体在上清液中(丢弃HL细胞残留物)。将上清液吸出，并在上清液中加入5ml PBS，然后悬浮并超声处理1分钟(10秒的超声处理-5秒的冷却，共进行6次)。
衣原体可以于-70℃冷冻储存。3.衣原体检验程序培养的HL细胞用肺炎衣原体EB′s感染。已经侵入细胞的EB′s转变成具代谢活性的网状体(RB)，该网状体经过二分裂在内体液泡或包涵体中分开。经过一段时间(大约72小时)，肺炎衣原体的RB′s浓缩成EB′s，在这之后包涵体破裂，宿主细胞破裂，EB′s释放出来。在该方法中目的是为了检验宿主细胞破碎前的包涵体。
HL细胞作为肺炎衣原体在体外条件下的宿主细胞。McCoy细胞通常作为砂眼衣原体在体外条件下的宿主细胞HL细胞和McCoy细胞的感染在感染前一天，宿主细胞于24孔平板上接种通过胰蛋白酶消化收获细胞，然后将它们悬浮于大约5ml营养液中并在Burker氏室中计数。每一个孔按照每孔250000-400000个细胞的浓度接种以便培养。如有必要，可在细胞加入小孔之前放上圆的盖玻片(直径13mm)用于染色。加入了营养液，以使体积为1ml/孔。第二天，用所要的细菌感染细胞。
将用于感染的含有衣原体颗粒的溶液彻底混和。吸去旧的营养液。在感染之前将储存于-70℃的接种物稀释至大约103的IFU浓度，以使24孔平板上溶液的体积至少为200μl/孔。通过1小时于1600rpm(550xg)的离心，细胞受到感染。吸去营养培养基，并换成含有环己酰胺(cyclohexamide)及所研究化合物(DMSO浓度0.2％)的维持培养基，体积为1ml/孔。细胞于+35℃在含5％CO2的气体中培养。将受到肺炎衣原体感染的细胞培养3天。2-3天后，移去维持培养基并将细胞用1ml PBS洗涤一次。向小孔中加入200μl SPG用于进一步的感染，再用吸管头收集并转移到试管中。这些按照上面的同样方法去感染新细胞，以便测试对感染性的抑制(chlamydiasidic效用)。衣原体染色将留在盖玻片上用于染色的营养培养基吸出。受感染的细胞在盖玻片上用甲醇固定10分钟。将盖玻片从孔中移出，然后以含有细胞的那面朝下的方式转移到于潮湿的室中在Parafilm上合适的结合有荧光素的单克隆抗体上。盖玻片于+37℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次和用水洗涤一次。最后将它干燥。将盖玻片以含有细胞的那面朝下的方式放在含有固定剂(例如封固剂)的载玻片上。当在荧光显微镜下观察时，受到衣原体感染的细胞培养物样品显示出在红色的复染色背景下的包涵体特有的苹果绿色荧光。化学药品和试剂RN＝FCS营养培养基100ml RPMI 1640(Sigma)，已加入了3.5％L-谷氨酰胺和10mg链霉素(最终浓度为20μg/ml)，7.5ml FCS。制备好的溶液储存于+8℃。
维持培养基加入了50μg环己酰胺(最终浓度为0.5μg/ml)的100ml FCS营养培养基。制备好的溶液储存于+8℃。
PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，Gibco)，pH7.4SPG＝蔗糖0.2M(37.5g)，KH2PO43.8mM(0.26g)，Na2HPO4·2H2O 6.7mM(0.61g)，谷氨酸(C5H9NO4)5mM(0.36g)混和入500ml milli-Q水中。经灭菌后储存于-20℃。
FCS，胎牛血清(Gibco，Scotland)于56℃失活30分钟，然后过滤并储存于-70℃。
权利要求
1.用于衣原体感染的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于该组合物含有源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物，或者所述化合物的混和物，可选的为与来源于大蒜的硫化合物的混和物。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物的抗衣原体效用大于或等于30％，优选地其抗衣原体效用大于或等于90％，其中抗衣原体效用以实施例中所定义的对于包涵体形成的抑制来显示。
3.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于源于植物的酚类化合物是经过生物合成途径从莽草酸形成的酚类化合物、经过生物化学乙酸-丙二酸途径形成的酚类化合物或作为两个途径联合的结果而形成的酚类化合物，或者含有它的提取物或组分或部分组分，或者含有简单酚、类黄酮、它们的衍生物、多酚、二萜酚与二萜醌的组分，或者已经从组分中除去了鞣酸与二萜组分的组分。
4.根据权利要求1-3中任何一项的组合物，其特征在于源于植物的酚类化合物为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异类黄酮、甲苯衍生化合物或丙苯衍生化合物，相应的合成化合物或其衍生物为合成类黄酮或合成香豆素。
5.根据权利要求1-4中任何一项的组合物，其特征在于提取物或组分或部分组分为天然植物提取物或食用植物提取物。
6.根据权利要求1-5中任何一项的组合物，其特征在于提取物或组分或部分组分为欧薄荷、龙脑薄荷、大花鼬瓣花、撒尔维亚、麝香草、小酸模、玫瑰、兔儿尾苗、多刺紫草、北艾、铃兰、夏栎、野胡萝卜、草莓、甘蓝、欧洲油菜、紫苜蓿、甜橙、Phloem flour或黑果越桔的提取物。
7.根据权利要求1-6中任何一项的组合物，其特征在于该组合物含有选自芹黄素、藤黄菌素、黄酮、栎精、鼠李黄素、桑色素、染料木黄酮、甲基棓酸、丙基棓酸、辛基棓酸、十二烷基棓酸、异丙基棓酸、繖形酮、莨菪亭、甲氧基补骨脂素、花椒毒素、香豆素、(-)-表棓儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素棓酸的源于植物的酚类化合物，或者选自香豆素106、2′-甲氧基-α-萘并黄酮、6，2′-二甲氧基黄酮，6-甲基香豆素、α-萘并黄酮、鱼藤酮和7-二乙基-氨基-3-噻吩甲酰基香豆素的相应的合成化合物或其衍生物。
8.根据权利要求1-7中任何一项的组合物，其特征在于该组合物当感染的原因是肺炎衣原体时含有栎精、桑色素、鼠李黄素、辛基棓酸，当感染的原因是砂眼衣原体时含有栎精、桑色素、鼠李黄素。
9.根据权利要求1-8中任何一项的组合物，其特征在于该组合物含有按苷元计算的以苷元或糖苷形式存在的25μg至3000mg源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物。
10.促健康组合物，其特征在于该组合物含有源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物，或者所述化合物的混和物，可选的为与来源于大蒜的硫化合物的混和物。
11.根据权利要求10的促健康组合物，其特征在于源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物的抗衣原体效用大于或等于30％，优选地其抗衣原体效用大于或等于90％，其中抗衣原体效用以实施例中所定义的对于包涵体形成的抑制来显示。
12.根据权利要求10或11的促健康组合物，其特征在于源于植物的酚类化合物为经过生物合成途径从莽草酸形成的酚类化合物、经过生物化学乙酸-丙二酸途径形成的酚类化合物或作为两个途径联合的结果而形成的酚类化合物，或者含有它的提取物或组分或部分组分，或者含有简单酚、类黄酮、它们的衍生物、多酚、二萜酚与二萜醌的组分，或者已经从组分中除去了鞣酸与二萜组分的组分。
13.根据权利要求10-12中任何一项的促健康组合物，其特征在于源于植物的酚类化合物为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异类黄酮、甲苯衍生化合物或丙苯衍生化合物，相应的合成化合物或其衍生物为合成类黄酮或合成香豆素。
14.根据权利要求10-13中任何一项的促健康组合物，其特征在于提取物或组分或部分组分为天然植物提取物或食用植物提取物。
15.根据权利要求10-14中任何一项的促健康组合物，其特征在于提取物或组分或部分组分为欧薄荷、龙脑薄荷、大花鼬瓣花、撒尔维亚、麝香草、小酸模、玫瑰、兔儿尾苗、多刺紫草、北艾、铃兰、夏栎、野胡萝卜、草莓、甘蓝、欧洲油菜、紫苜蓿、甜橙、Phloem flour或黑果越桔的提取物。
16.根据权利要求10-15中任何一项的促健康组合物，其特征在于该组合物含有选自芹黄素、藤黄菌素、黄酮、栎精、鼠李黄素、桑色素、染料木黄酮、甲基棓酸、丙基棓酸、辛基棓酸、十二烷基棓酸、异丙基棓酸、繖形酮、莨菪亭、甲氧基补骨脂素、花椒毒素、香豆素、(-)-表棓儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素棓酸的源于植物的酚类化合物，或者选自香豆素106、2′-甲氧基-α-萘并黄酮、6，2′-二甲氧基黄酮，6-甲基香豆素、α-萘并黄酮、鱼藤酮和7-二乙基-氨基-3-噻吩甲酰基香豆素的相应的合成化合物或其衍生物。
17.根据权利要求10-16中任何一项的促健康组合物，其特征在于该组合物当感染的原因是肺炎衣原体时含有栎精、桑色素、鼠李黄素、辛基棓酸，当感染的原因是砂眼衣原体时含有栎精、桑色素、鼠李黄素。
18.根据权利要求10-17中任何一项的促健康组合物在食品的制备中或就这样加入到日常食物中的用途。
19.源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物，或者所述化合物的混和物，可选的为与来源于大蒜的硫化合物的混和物，在用于衣原体感染的治疗和/或预防的药剂生产中的用途。
20.根据权利要求19的用途，其特征在于源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物的抗衣原体效用大于或等于30％，优选地其抗衣原体效用大于或等于90％，其中抗衣原体效用以实施例中所定义的对于包涵体形成的抑制来显示。
21.根据权利要求19或20的用途，其特征在于源于植物的酚类化合物为经过生物合成途径从莽草酸形成的酚类化合物、经过生物化学乙酸-丙二酸途径形成的酚类化合物或作为两个途径联合的结果而形成的酚类化合物，或者含有它的提取物或组分或部分组分，或者含有简单酚、类黄酮、它们的衍生物、多酚、二萜酚与二萜醌的组分，或者已经从组分中除去了鞣酸与二萜组分的组分。
22.根据权利要求19-21中任何一项的用途，其特征在于源于植物的酚类化合物为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异类黄酮、甲苯衍生化合物或丙苯衍生化合物，相应的合成化合物或衍生物为合成类黄酮或香豆素。
23.根据权利要求19-22中任何一项的用途，其特征在于提取物或组分或部分组分为天然植物提取物或食用植物提取物。
24.根据权利要求19-23中任何一项的用途，其特征在于提取物或组分或部分组分为欧薄荷、龙脑薄荷、大花鼬瓣花、撒尔维亚、麝香草、小酸模、玫瑰、兔儿尾苗、多刺紫草、北艾、铃兰、夏栎、野胡萝卜、草莓、甘蓝、欧洲油菜、紫苜蓿、甜橙、Phloem flour或黑果越桔的提取物。
25.根据权利要求19-24中任何一项的用途，其特征在于源于植物的酚类化合物选自芹黄素、藤黄菌素、黄酮、栎精、鼠李黄素、桑色素、染料木黄酮、甲基棓酸、丙基棓酸、辛基棓酸、十二烷基棓酸、异丙基棓酸、繖形酮、莨菪亭、甲氧基补骨脂素、花椒毒素、香豆素、(-)-表棓儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素棓酸，相应的合成化合物或其衍生物选自香豆素106、2′-甲氧基-α-萘并黄酮、6，2′-二甲氧基黄酮，6-甲基香豆素、α-萘并黄酮、鱼藤酮和7-二乙基-氨基-3-噻吩甲酰基香豆素。
26.根据权利要求19-25中任何一项的用途，其特征在于当感染的原因是肺炎衣原体时使用栎精、桑色素、鼠李黄素或辛基棓酸，当感染的原因是砂眼衣原体时使用栎精、桑色素或鼠李黄素。
27.根据权利要求19-26中任何一项的用途，其特征在于按苷元计算的25μg至3000mg源于植物的酚类化合物或含有它的提取物或组分或部分组分，或者相应的合成化合物或其合成衍生物以苷元或糖苷的形式使用。
全文摘要
本发明涉及用于治疗和/或预防衣原体感染的天然与合成的化合物、植物提取物和包含它们的组合物以及这些物质的混和物。医药制剂、食物添加组合物和功能性食品可以从源于植物的酚类化合物与合成化合物和植物提取物中制备。
文档编号A61K31/704GK1454093SQ01815396
公开日2003年11月5日 申请日期2001年8月16日 优先权日2000年8月17日
发明者H·沃莱拉, P·沃莱拉, R·希尔图南, M·莱诺南, P·塞库 申请人:公牛控制公司