使皮肤增白的方法和组合物的制作方法

专利名称：使皮肤增白的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及用于在对象皮肤上局部使用的脱色素或皮肤增白组合物，以及其使用方法。
人的皮肤颜色是由在所谓黑素细胞的独特细胞种群中进行的一系列复杂的细胞过程引起的。黑素细胞位于表皮下层，其作用是合成保护身体不受紫外线辐射损害的棕色素、黑色素。黑色素沉积于黑素体中，黑素体据发现是黑素细胞中的泡囊。黑素体被从黑素细胞中挤出并且被角化细胞携带到皮肤表面，该角化细胞将含黑色素的黑素体内在化。皮肤观察到的颜色暗度与黑素细胞合成并转移给角化细胞的黑色素的量成比例。在很多情况中，人们期望减少或抑制黑素生成，例如，使皮肤增白，以消除“老年斑”、着色斑，或者减少活性过度的黑素细胞。
本发明的目的是提供用于皮肤局部使用以抑制黑素生成从而使皮肤增白的方法和组合物。
在优选的方案中，本发明包括含一定量活性剂的物质的组合物，其中所说的活性剂中含有对降低人黑素细胞中黑色素含量有效的育亨宾或其有效的衍生物、立体异构体或盐。该组合物还包含有效量的、能够在体内条件下将育亨宾或其立体异构体、衍生物或盐给药于含黑素细胞皮肤层的药用局部载体。活性剂可以是作为天然提取物的形式提供，例如育亨宾(Yohimbe)树皮的提取物。
本发明还包括用于降低色素沉淀或促进对象皮肤增白的方法。用脱色素组合物处理对象的皮肤，所说的组合物含有对降低人黑素细胞中黑色素含量有效的育亨宾、和上述的药用局部载体。本申请的方法还可以包括防晒组合物，以便至少部分地防护对象的皮肤不受紫外线辐射。
附图简介

图1显示了育亨宾对黑素细胞中酪氨酸酶活性的剂量应答效果。
图2显示了游离基质的育亨宾对黑素细胞中酪氨酸酶活性的剂量应答效果。
图3显示了育亨宾和育亨宾立体异构体萝芙素(rauwolscine)对黑素细胞中酪氨酸酶活性的对比效果。
图4A和4B是计算机产生的图象，图4C显示了育亨宾对人皮肤培养物的增白效果。以下将图4A、4B和4C称为“图4”。
图5显示了从培养物介质中除去育亨宾后，人黑素细胞的细胞培养物中酪氨酸酶活性的回收率。
图6显示了α2-拮抗剂BU224和efaroxan对另一种人黑素细胞的细胞培养物中酪氨酸酶活性的影响。
图7显示了酚妥拉明和育亨宾立体异构体柯楠次碱对另一种人黑素细胞的细胞培养物中酪氨酸酶活性的影响。
图8A和8B是计算机产生的图象，图8C显示了天然育亨宾树皮提取物对人皮肤培养物的脱色素效果。以下，图8A、8B和8C称作“图8”。
图9是计算机产生的图象，显示了给猪的皮肤使用育亨宾组合物的脱色素效果。
图10显示了图9中被处理皮肤区域的反射率值。
图11显示了育亨宾渗透过人皮肤切除部分的渗透率。
本发明涉及用于降低对象皮肤中黑素生成的组合物和方法。这里所说的“对象”是指哺乳动物，更优选是人。
本发明包括含有有效量的一种或多种育亨宾或能够降低黑素细胞(优选人黑素细胞，更优选人直露皮肤的黑素细胞)中黑色素量的活性剂(以下称作“黑色素减少剂”，如α2-对抗剂)的组合物。黑色素减少剂可以据信是降低皮肤内黑色素产生量的任何各种方式起作用，例如通过降低黑素细胞中的CAMP(环状AMP)或起CAMP作用的CAMP衍生物；通过促进磷酸二酯酶；或者通过降低酪氨酸酶活性。如上所述，本发明还包括对本发明有效的α2-拮抗剂，其中黑素细胞的黑素生成性被抑制从而导致皮肤增白。
因此，正是本申请人独到地发现了育亨宾、和某些其它活性剂(如某些α2受体-对抗剂)对降低黑素细胞中黑色素生成有效，从而降低皮肤色素沉淀使皮肤增白，以下将作进一步描述。
更具体地说，本发明涉及一种组合物，以及使用该组合物的方法，该组合物对抑制人皮肤的黑素生成是有效的。所说的组合物包含有效量的、能够减少人黑素细胞中黑色素含量的育亨宾。这里所说的“育亨宾”包括同样对抑制黑素生成有效的育亨宾的立体异构体、盐和衍生物。其实例是萝芙素(α-育亨宾)、异-育亨宾、和柯楠次碱(柯楠质)。
所说的育亨宾或其它活性剂可以占组合物的约0.01μM-约1mM，或组合物的约10-4-约10wt％。更优选，活性剂占组合物的约10-4-约2wt％。更优选，活性剂育亨宾占组合物的约10-3-约1.0wt％。在本发明的一个方案中，育亨宾或育亨宾衍生物或立体异构体可以作为育亨宾(Coryuanthe johimbe，或相关树种)树皮的提取物、或已知含适当量育亨宾或所说衍生物或立体异构体的任何其它天然来源(如萝芙藤根)的提取物来提供。制备这种提取物的方法为本领域技术人员公知的，并且可以通过将树皮在乙醇中匀化，然后匀浆除去悬浮的颗粒来制备。然后，可以将上清液与局部使用载体混合。下面将更详细地描述提取方法。
组合物还包含用于抑制紫外线诱导黑素生成的防晒剂。这种防晒剂为本领域技术人员所公知的。如上所述，组合物包含能够在体内条件下将活性剂给药于含黑素细胞的皮肤层的药用局部载体。
黑色素减少剂(即活性剂)以任何有效量存在于本发明的组合物中。黑色素减少剂的“有效量”是引起对象被处理区域的黑色素降低的量。其中，该量可以随黑色素减少剂和载体的特性、对象皮肤的颜色和状况、以及需要的脱色素程度(即增白程度)而变化。
本发明物质的组合物优选直接涂敷于需要皮肤增白的个体的皮肤上。处理的区域可以是对象的整个皮肤或仅是需要增白或脱色素的区域。组合物的涂敷必须周期性重复进行，以便保持皮肤的增白状况。
如上所述，本发明物质的组合物优选还包含有效量的、能够在体内条件下将黑色素减少剂给药于黑素细胞皮肤层的药用局部载体。载体可以包括任何的溶液、悬浮液、乳液、或任何其它能够在体内条件下将活性剂给药于黑素细胞皮肤层的形式。这里所说的“能够给药于”是指载体应当有助于活性剂穿过角质层和所谓黑素细胞表皮的连续细胞层，并且/或者有助于活性剂达到含黑素细胞的细胞层。优选，载体应当基本上不与活性剂互相作用，以便活性剂可以如所说地发挥其作用。
载体的特性和数量取决于本发明组合物中所用的黑色素减少剂的特性。然而，在大部分情况中，载体占组合物的约50-约99wt％。优选载体中含有醇。或者，载体可以是脂质体或水合的脂质片状相，例如本领域技术人员所公知的。
载体的优选配方含有醇(如甲醇、乙醇或异丙醇)、和增稠剂如丙二醇、聚乙二醇(PEG)或卡波醇(Carbopol)以及渗透促进剂，如transcutol。
不含活性剂的优选载体配方的具体实例为(1)30％丙二醇(PG)70％乙醇(2)30％PG1.0-2.5％油酸或油醇乙醇(QS)(3)10-25％乙氧基二甘醇0-2.5％油酸或油醇0-5％羟丙基纤维素乙醇(QS)；(4)10-50％甲基吡咯烷酮0-20％乙氧基二甘醇0-2.5％油酸或油醇0-5％羟丙基纤维素乙醇(QS)；其它配方见表1和2。其中每个配方中都显示含有育亨宾，但应当理解这些配方可以代之以包含所述的对增白皮肤有效的任何化合物，或其组合。
表1-含育亨宾的皮肤增白膏配方制剂
表2-含育亨宾的皮肤增白膏和凝胶配方制剂
所述的制剂可以很多方式局部使用，以达到活性剂渗透过皮肤使皮肤增白。物质的组合物优选为可以用水擦敷在皮肤上的凝胶、露液或溶液形式。也可接受其它施用方式，如气溶喷雾或使用涂药瓶。一般来说，制剂可以按0.3-1ml/5-50cm2的剂量施用。制剂的施用频率为每1-2、2-6、6-8、8-12小时施用于所需增白的区域。这里所说的剂量是指皮肤施用制剂的量和次数。制剂中可以包含成膜剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮或聚甲基吡咯烷酮。此外，可以使用允许组合物在角质层中积累的渗透促进剂(如transcutol(乙氧基二甘醇))。组合物还可以包含表皮剥离剂，如用于增强表皮细胞更新的水杨酸。其它表皮剥离剂包括α羟基和β羟基酸，以及其它本领域技术人员已知的物质，如水果酸。
其它成分也可以包含在本发明的组合物中。当存在渗透促进剂时，其优选占溶剂混合物的约0.5-25wt％，更优选占1.0-20wt％。Transcutol是优选的渗透促进剂，但其它已知的促进剂如阿综(月桂氮酮)、硫代羟乙酸钙、链烷烃羧酸、脂质体、极性脂质、二甲基甲酰胺、N甲基-2-吡咯烷酮、油酸、油醇、癸基甲基亚砜和丙二醇也能够使用，并且可以占制剂的一部分。其它可能的渗透促进剂包括月桂醇、癸二酸二丁酯、二乙二醇油酸酯、癸二酸二乙酯、琥珀酸二乙酯、癸二酸二异丙酯、己二酸二辛酯、壬二酸二辛酯、癸二酸二辛酯、乙酸乙酯、甘油一月桂酸酯、甘油一油酸酯、异硬脂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、蔗糖一月桂酸酯、蔗糖一油酸酯、乳酸、月桂酸、亚油酸、亚麻酸、11-十八碳烯酸、Eo-2-油基醚、Eo-5-油基醚、Eo-10-油基醚、N-甲基-2-吡咯烷酮、吡咯烷酮/羧酸结合物、乙醇、聚乙二醇、吐温20和吐温80。
组合物还可以包含一种或多种在角质层之层状液晶结构中起增加无序作用的助水溶物质，由此增加经皮转移性。这种助水溶物质的实例是异丙醇、丙二醇和二甲苯磺酸钠。
申请人还注意到制剂中可以包含有效的皮肤增白剂的组合。
本发明的组合物还可以包含其它化妆品和治疗可接受的含其它溶剂的载体或赋形剂、增湿剂、湿润剂、油、乳化剂、增稠剂、稀释剂、表面活性剂、香料、防腐剂、抗氧化剂、维生素和矿物质。
下面将要通过联系以下实施例中的某些优选的实施方案来描述本发明，以便可以更完整地理解和领会本发明的目的，但并非要将本发明局限于这些特定的实施方案。相反，其意图是要覆盖包括在由以下权利要求书定义的本发明范围之内的所有替换、改进和等效变化。因此，以下包括优选实施方案的实施例起举例说明本发明实践的作用，可以理解所示的具体内容是通过示例的方式，并且仅是出于举例讨论本发明优选实施方案的目的，并且这些具体内容是在假设配制工艺以及本发明原理和概念方面的描述据信是最有用和容易理解的情况下作出的。
方法器官培养系统使用人的器官培养物来效仿人的体内皮肤，并且对本发明的组合物和方法作充分的评价和研究。本发明的人器官培养物使用有活力的包皮。“有活力”是指经过外科割除后的包皮基本上没有形态变化。活力可以由通过组织化学染色和/或二羟苯基丙氨酸反应测定的染色组织超微结构的变化来确定，该技术允许监测组织超微结构中的任何变化。
包皮可以由通过标准外科手术割除男性新生儿的包皮来获得。外科割除后，优选将包皮通过真皮内注射以下所述的介质制备成器官培养物。该过程使粘膜膨胀，并且允许除去膜从而允许足够的营养物经真皮流入包皮中。
包皮包括正常情况下被暴置于环境的表皮，和与表皮相对的真皮。经过手术割除和器官培养物制备后，正常情况下通过身体供应营养物的真皮暴露在环境中。为保持表皮的活力，营养物介质通过真皮向包皮提供营养物质，如以下所述。
营养物介质是保持包皮活力的任何组合物。优选，营养物介质具有诸如溶液、悬浮液或乳液的水相。介质的一部分可以商购获得，例如Iscove的改进Dulbecco培养基(IMDM)；Ham的营养混合物F-10培养基，最低基本培养基(MEM)、RPMI培养基1630或1640，Dulbecco的改进Eagle培养基(D-MEM)或培养基199，所有这些均为Grand Island的Gibco Laboratories(New York)和其它公司制造，其说明书引入这里作为参考。此外，介质还包含约10-约30％的马血清和约2-约10％的胎牛血清；这些血清例如可以从Logan的Hyclone Lab公司(Utah)购买到。如果需要，可以添加碱化剂，如碳酸氢钠，直至介质达到优选的pH，优选约生理学pH。还可以加入抗菌剂，如青霉素和/或链霉素来控制微生物。
如果在手术割除之后必需要经过转移，则要将包皮立即放在用营养物介质饱和的吸收载体上。为保持包皮的活力，在手术割除后将包皮在介质中处理约3-4小时。包皮在介质中的位置应当是真皮接触介质并且表皮基本上不接触到介质。
在所述的器官培养系统中处理包皮时，在观察包皮的整个期间保温培养器官培养系统，例如24-72小时。优选，每天更换介质，因为营养物可能随时间而被耗尽，并且保温造成介质组分降解。
在制备所述的人器官培养系统中，包皮是外科手术割除、制备和在如上所述的器官培养系统中处理的。在将包皮放入系统之前，应当先观测包皮，以确定所研究的生物学要素的量和/或状况，获得基准测量值。在用活性剂处理包皮之后，再次观测生物学要素，得到处理后测量值，与基准测量值比较。例如，如果研究包皮中酪氨酸酶的量，则在给包皮使用活性剂之前测定酪氨酸酶的量作为基准测量值。
如果包皮要用研究中的活性剂处理，可以将活性剂添加到营养物介质中，以便通过介质与包皮接触。或者，可以将活性剂直接放在包皮的表皮上。处理时间取决于所需的结果、研究中的活性剂的特性、包皮来源保持活力的时间以及其它因素。
在包皮用所研究的活性剂处理之后，可以按任何可测出包皮与未处理包皮观测和/或测试差异的方式来观测和/或测试包皮。例如，可以如这里所述的测定酪氨酸酶活性，并且与黑素生成的降低相联系；可以通过3H-胸腺嘧啶核苷摄取测定DNA合成的速率，并且与对照进行比较；或者通过测量[3H]亮氨酸(蛋白质)或[3H]尿嘧啶核苷(RNA)掺入到酸性起沉淀作用的物料中的速率，来测定蛋白质和/或RNA合成的增加或减少。或者，可以按非这里所述的通过显微镜评价处理后包皮的组织切片。
人包皮和器官培养物的制备在手术割除的时候，将人的包皮放在用无菌IMDM培养基(购自Irvine Scientific of Santa Ana(California)的Iscove改进Dulbecco培养基)饱和的无菌纱布上，以便从医院手术室转移至实验室。将组织用含500U/ml青霉素和500μg/ml链霉素的无菌IMDM培养基漂洗5分钟。于无菌条件下，在用剪子解剖粘膜和下层真皮使皮肤厚度相等之前，从真皮侧经真皮注射介质。然后将包皮切割成大约3mm×3mm的正方形，并且在-75℃下冷冻或者放入如下述的器官培养物中。
用补充20％马血清、5％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和3mg/ml碳酸氢钠的含谷氨酰胺的IMDM制备器官培养介质。血清得自Logand的Hyclone Lab.公司(Utah)。通过于6皿组织培养板(Falcon 3046)皿中将灭菌的滤器(AP20 025 00，微孔)放在灭菌的支持筛(25cm Swinnex滤器支持筛，微孔)上面，装备培养装置，其中将介质添加到皿中以便皮肤支持筛飘浮，并且滤器由下方吸收介质。将组织样品放在饱和滤器的顶部，真皮朝上，并且在37℃下于5％CO2增湿环境中保温。每天更换介质。获得的培养物在-75℃下冷冻。
对组织学研究(光学显微镜检查)，将新鲜组织的解冻样品和外植体封固在OCT化合物中(ICN Immuno Biologicals，Lisle，Illinois)并且通过液氮冷冻。将低温控制器的切片(6μm厚)于2％甲醛中40℃下固定2小时，然后用苏木紫或曙红染色或者进行多巴染色。多巴反应通过在0.1M磷酸钠缓冲剂中两次更换0.1％L-多巴溶液缓冲剂至pH7.4于37℃下培养4小时完成。
酪氨酸酶活性测定通过测定酶的酪氨酸羟化酶活性来确定人皮肤器官培养物中酪氨酸酶活性。试验测定[3H]酪氨酸转化成L-多巴期间3H2O的产生。将称重的皮肤制备物于0.3ml含0.01mM L-酪氨酸、5-6uCi/ml[3H]酪氨酸和0.1mM L-多巴与0.1M pH6.8磷酸盐缓冲剂的反应混合物在37℃下保温4小时。添加1ml的磷酸盐缓冲剂中止反应，涡旋搅拌试管，并且取出三份0.4ml的等分试样，并且与同体积的Norit SG活性炭(10％w/v，于0.1N HCl中)混合。在2000xg下离心10分钟，接着将上清液(0.5ml)放入闪烁小瓶中，加入闪烁流体，并且将小瓶装在装备有DPM处理器的TM Analytin 6895闪烁计数器中。
黑素细胞生物鉴定该研究中使用的正常的人黑素细胞株得自新生儿或2-6岁黑种人或白种人男性。人黑素细胞培养物在补充有10％马血清、5％胎牛血清(FBS)、32nM TPA(12-邻十四酰佛波醇-13-乙酸酯)、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)的Ham’s F-10营养培养基中生长。
为原位测定人黑素细胞培养物中的酪氨酸酶活性，测量酶的酪氨酸羟化酶活性。将细胞以2×105细胞/皿接种于60mm培养皿，并且让其过夜。然后更换含Ham’s F-10营养培养基+10％FBS+2μg/ml牛垂体浸膏(BPE)+2ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF)、补充有1μCi/ml[3H]酪氨酸(L-环-3，5-[3H]-酪氨酸，DuPont New England Nuclear)和前列腺素的生长介质，其中被指示。细胞在标示的介质中生成72小时，(除非另有说明)并且在此时，除去介质并且使用Pomerantz的木炭吸收法分析3H2O的存在。通过在0.1M磷酸钠缓冲剂(Ph6.8)中声处理细胞颗粒，然后在0.5ml含0.1mM酪氨酸、2μCi/ml[3H]酪氨酸、0.1mM L-多巴(二羟基苯丙氨酸)和0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟化物)反应混合物中37℃下保温50μl等分试样2小时，来测定细胞匀浆酪中的氨酸酶活性。通过添加1ml木炭(10％w/v，0.1N HCl中)中止反应。将样品离心，并且取出上清液测定所产生的3H2O的量。
通过将细胞颗粒在2ml的1N NaOH中37℃下保温48小时，然后在400nm下测定溶解的黑色素，来测定黑素细胞中黑色素的量。
结果图1-8显示了育亨宾、其立体异构体和很多其它化合物对黑素细胞和培养的包皮中的脱色素效果。黑素细胞和包皮如上培养。
图1显示了在McX-TPA介质中培养72小时之后，育亨宾HCl对黑种人黑素细胞(细胞株B415)中酪氨酸酶活性的影响。结果说明了剂量应答，其中100μM育亨宾HCl强烈抑制了黑种人黑素细胞中的黑素生成，而该效果逐渐降低，直至到1μM浓度下，抑制效果实质上消失。
图2显示了制备成游离基质的育亨宾(溶解于乙醇)各批次在100μM浓度下的相同抑制效果。抑制程度与图1所示的类似。
图3显示了使用育亨宾立体异构体萝芙素(α-育亨宾)在白种人黑素细胞(细胞株W422)中保温72小时后的类似抑制效果，抑制程度类似。
图4显示了像素图和如上所述用育亨宾(100μM)和不用育亨宾(对照)在生长介质中保温24小时培养的黑种人包皮的组织玻片照片。用育亨宾处理的皮肤明显比未处理的包皮着色密度低。关于相对像素值，对照包皮比用育亨宾处理的包皮大约暗5倍。
图5显示了黑种人黑素细胞(细胞株B417)中的回收结果。给育亨宾(100μM)处理的黑素细胞供应不含育亨宾的营养介质、48小时内，处理过的黑素细胞的黑色素产生回到与暴置于不含育亨宾介质的黑素细胞相同的水平。结果说明育亨宾的效果是可逆的，并且育亨宾必须重复使用才保持抑制效果。
图6显示了两种有效α2-拮抗剂BU224和efaroxan对处理72小时的白种人黑素细胞(细胞株W442)的抑制效果。BU224和efaroxan在100μM下抑制黑素生成。
图7显示了α2-对抗剂酚妥拉明和育亨宾立体异构体柯楠次碱对处理72小时的白种人黑素细胞(细胞株W442)的抑制效果。酚妥拉明和柯楠次碱在100μM下抑制黑素生成。
图8显示了像素图和如上所述培养的黑种人包皮的组织玻片照片，其中培养物用和不用含育亨宾的育亨宾树皮提取物(提取过程如下所述)保温24小时。用含育亨宾的育亨宾树皮提取物处理的皮肤明显比乙醇对照样着色密度低。关于相对密度，对照包皮比用提取物处理的包皮大约暗4倍。
对猪皮肤的体内效果测试局部用育亨宾制品对活Yucatan猪无伤皮肤的增白效果。
在对象的皮肤上使用100μl量的育亨宾制品和对照样(赋形剂中不含育亨宾)，每天两次，共两周。在第一次使用对照或育亨宾组合物之前，用UV光照射每个区域，以刺激黑素生成。两周后，用育亨宾加赋形剂处理的辐射区域(图9，区域B)，其色素明显少于仅用赋形剂处理的辐射区域(图9，区域A)，反映了育亨宾阻断黑色素的生成。图10是显示单独用赋形剂和用赋形剂加育亨宾之间的反射值差异的图。反射值越高表明着色越少、反射皮肤越多。也就是说，着色皮肤的反射值低于未着色的皮肤。反射值越低表明越暗、反射皮肤越少。图9的处理区域A在用UV辐射后反射值降低，说明本质上着色。另一方面，图9的区域B，用育亨宾处理，在UV辐射之后反射值仅略微下降，说明因辐射引起的着色被抑制。这些结果表明育亨宾对猪皮肤具有增白作用。
对人皮肤的体内效果对两位三十岁男性测试局部育亨宾制剂的无伤皮肤增白效果，该男性背部具有很多相适当间隔的着色部位(“咖啡色和奶油色”着色斑)。每位对象选两种类型的皮肤。给对象施用大约50μl剂量的育亨宾制剂以及其对照(不含育亨宾的赋形剂)，每天两次施用三周(周末除外)。10天后，目视可见用育亨宾加赋形剂处理的着色斑皮肤增白效果比仅用赋形剂处理的区域强。没有制剂(含或不含活性组分，育亨宾)造成处理区域刺激。使用载体赋形剂151B(表1)和YoP(表2)的育亨宾制剂看来产生了最佳的增白效果。
该小型试验证实了育亨宾使人无伤皮肤增白的效果，以及证明了育亨宾可以透过上层皮肤，并且是有效的而没有不安全的副作用。
育亨宾的皮肤渗透性使用本领域技术人员熟悉的标准Franz型立式渗滤池育亨宾(参见T.Franz，经皮吸收(Percutaneous Absorption)“有关体外数据”，J.Invest.Dermatol.，64190-195，1975)分析育亨宾对人的切除皮肤的渗透性。所用的标准Franz渗滤池具有15mm孔口，7.0ml体积，并且装备Hansen Helix搅拌器。使用在含0.05％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水中的10％二甘醇一乙基醚作为受体相，将切除的人皮肤装入渗滤池中。通过胸部复位术从个体中在24小时的手术内获得人皮肤，并且用解剖刀除去皮下组织，将组织仔细切成5×15cm切片，避免角质层被皮下脂肪污染。将各5×15cm切片放在无菌Whirl-PAKTM包中，并且在湿冰上存储，直至放入流动机中(最多转移时间2小时)。在进行皮肤体外渗透研究的当天，用冷冻机中取出一片5×15cm切片。如果皮肤不使用则冷冻储藏不超过6个月。解冻后，将皮肤漂洗，用织物轻拍干，并且装入Franz渗滤池。通过反相HPLC(UV检测)分析受体溶液的育亨宾。在研究开始，给皮肤表面涂敷70μl剂量，并且将渗滤池封盖。24和48小时之后分析渗透剂样品。
Franz渗滤池实验的结果见图11。其中横坐标表示育亨宾的公知制剂和百分比。纵坐标表示各制剂渗透过皮肤的育亨宾总纳摩尔数。24小时后的渗透范围为大约60-350纳摩尔，48小时后的渗透范围为95-515纳摩尔。该结果证明当育亨宾与适宜的赋形剂配置时，育亨宾可以显著量地渗透过人的皮肤。
育亨宾树皮提取方法将10g育亨宾树皮(可商购获得，例如，得自Gaia Herb公司或其它商业来源)在咖啡磨中20秒研磨，以便将树皮碎成细沉淀。然后加入100ml水。将混合物在250ml Erlwnmeyer烧杯中室温下搅拌，然后5000xg离心20分钟。丢弃上清液，将含育亨宾的沉淀物再悬浮于100ml乙醇中。将该混合物简单地声处理，然后室温下搅拌5小时，以便从树皮中进一步提取育亨宾。搅拌后，将混合物再次离心并且保留上清液。抛弃颗粒。在氮气条件下蒸发乙醇上清液，直至体积被浓缩至16ml。由此在乙醇溶液中获得大约100微摩尔浓度的育亨宾。提取物中育亨宾的浓度取决于树皮源和所用的技术。
本领域技术人员可以理解，上述的提取方法仅是适用于获得育亨宾提取物的众多方法中的一种，所有这些方法均属于本发明的保护范围。
数据显示育亨宾及其各种衍生物和立体异构体以及某些α2-拮抗剂对降低人黑素细胞中的酪氨酸酶活性、由此抑制黑素生成使皮肤增白是有效的。
在不背离本发明实质和范围的前提下，根据所述的各种组合物的构成和操作或根据所述方法的步骤或步骤顺序，可以作出很多改变。本发明的范围由以下权利要求定义。
权利要求
1.用于使皮肤增白的组合物，该组合物包含含一定量对抑制皮肤黑素细胞中黑素生成有效的育亨宾或其有效衍生物、立体异构体或盐的活性剂；和能有效将活性剂给药于含黑素细胞的表皮层的化妆品或药品可接受的赋形剂或载体。
2.权利要求1的组合物，其中活性剂包含育亨宾、萝芙素、异-育亨宾、柯楠次碱或异-育亨宾中的至少一种。
3.权利要求1或2的组合物，其中活性剂以天然提取物的形式提供。
4.权利要求3的组合物，其中天然提取物是育亨宾树皮的提取物。
5.权利要求1-4任一项的组合物，其中载体或赋形剂包含醇。
6.权利要求1-5任一项的组合物，其中载体或赋形剂包含渗透促进剂。
7.权利要求1-6任一项的组合物，其中提取物占组合物的0.01-80wt％。
8.权利要求1-7任一项的组合物，其中活性剂占组合物的0.01-约5wt％。
9.权利要求1-8任一项的组合物，其中载体或赋形剂包含剥离剂。
10.用于使皮肤增白的组合物，该组合物包含含一定量对抑制皮肤黑素细胞中黑素生成有效的α2-受体拮抗剂的活性剂；和能有效将活性剂给药于含黑素细胞的表皮层的化妆品或药品可接受的赋形剂或载体。
11.权利要求10的组合物，其中载体或赋形剂包含醇。
12.权利要求11或12的组合物，其中载体或赋形剂包含渗透促进剂。
13.权利要求10-12任一项的组合物，其中活性剂占组合物的0.01-约5wt％。
14.增白皮肤的方法，该方法包括提供含活性剂的组合物，其中该组合物含有对抑制皮肤黑素细胞中黑素生成有效的育亨宾或其有效衍生物、立体异构体或盐的活性剂；并且给表皮局部施用足够量的组合物，使至少部分抑制表皮中黑素生成。
15.权利要求14的方法，其中在提供组合物的步骤，组合物包含育亨宾、萝芙素、异-育亨宾、柯楠次碱或异-育亨宾中的至少一种。
16.权利要求14或15的方法，其中组合物包含能有效将活性剂给药于含黑素细胞的表皮层的化妆品或药品可接受的赋形剂或载体。
17.权利要求14-17任一项的方法，其中组合物包括天然提取物。
18.权利要求17的方法，其中天然提取物是育亨宾树皮的提取物。
19.权利要求14-18任一项的方法，其中载体或赋形剂包含醇。
20.权利要求14-19任一项的方法，其中载体或赋形剂包含渗透促进剂。
21.权利要求14-20任一项的方法，其中以重量百分数表达，所说的提取物以组合物总重量计0.01-80wt％的浓度施用。
22.权利要求14-21任一项的方法，其中以重量百分数表达，活性剂的浓度为组合物总重量计的0.01-约5wt％。
23.权利要求14-22任一项的方法，其中载体或赋形剂包含剥离剂。
24.增白皮肤的方法，该方法包括提供含活性剂的组合物，其中该组合物含有对抑制皮肤黑素细胞中黑素生成有效的育亨宾树皮的提取物；并且给表皮局部施用足够量的组合物，使至少部分抑制表皮中黑素生成。
25.权利要求24的方法，其中组合物还包含能有效将活性剂给药于含黑素细胞的表皮层的化妆品或药品可接受的赋形剂或载体。
26.权利要求24-25任一项的方法，其中载体或赋形剂包含醇。
27.权利要求24-26任一项的方法，其中组合物包含渗透促进剂。
28.权利要求24-27任一项的方法，其中以重量百分数表达，所说的提取物以组合物总重量计0.01-80wt％的浓度施用。
29.权利要求24-28任一项的方法，其中载体或赋形剂包含剥离剂。
30.增白皮肤的方法，该方法包括提供含活性剂的组合物，其中该组合物含有对抑制皮肤黑素细胞中黑素生成有效的α2-受体拮抗剂；并且给表皮局部施用足够量的组合物，使至少部分抑制表皮中黑素生成
31.权利要求30的方法，其中活性剂占组合物的0.01-约5wt％。
32.权利要求30-31中任一项的方法，其中载体或赋形剂包含醇。
33.权利要求30-32中任一项的方法，其中载体或赋形剂还包含渗透促进剂。
34.权利要求30-33任一项的方法，其中组合物包含剥离剂
35.一种用于使皮肤增白的组合物，该组合物包含对抑制黑素生成有效的活性剂。
36.权利要求35的组合物，还包含赋形剂或载体。
37.一种增白皮肤的方法，包括给皮肤施用组合物，其中组合物包含对抑制黑素生成有效的活性剂。
全文摘要
本发明提供用于给皮肤局部使用育亨宾或其衍生物或立体异构体、或有效α
文档编号A61K8/96GK1515242SQ0210257
公开日2004年7月28日 申请日期1998年7月17日 优先权日1997年9月25日
发明者B·B·富勒, B B 富勒 申请人:俄克拉何马大学董事会