专利名称：一种治疗苯酮尿症的药物及其制造方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物及其制造方法与应用，特别是涉及一种治疗苯酮尿症的药物及其制造方法与应用。
苯酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常见的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病。由于苯丙氨酸羟化酶基因突变，造成肝脏PAH酶活降低或缺如，不能将苯丙氨酸羟化为酪氨酸，致使苯丙氨酸及其不正常代谢物蓄存体内。这些不正常的产物主要是苯丙氨酸在转氨酶的作用下脱氨基转变为苯丙酮酸，后者经氧化作用形成正羟苯乙酸、苯乙酸、苯乳酸。这些不正常的代谢产物蓄积在血、脑脊液和各种组织中，给脑组织细胞造成不可逆转的损伤，并从尿中大量排出，患者尿液有特殊臭味，即苯丙酮酸尿。PKU临床上的主要表现是智力低下，癫痫发作和色素减少。
目前，世界各国均主要采用饮食疗法治疗PKU，即常年坚持给予患者低苯丙氨酸特制奶粉，严格限制其饮食直至其智力发育基本成熟，即十七、八岁。但由于苯丙氨酸是必须氨基酸，不能从饮食中完全除去，需要根据年龄、个体进行调节，成本非常高，不仅增加了病人家庭的负担，而且病人由于常年不能吃正常的饮食而非常痛苦；也极少有坚持此饮食疗法长达十几年者。
苯丙氨酸脱氨酶是植物及酵母中特有的酶，能够将苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，因此曾有报道将其用于苯酮尿症治疗的研究。但是从植物中提取苯丙氨酸脱氨酶成本非常高，而且该酶不稳定，给应用造成了很多不可逾越的障碍。
一种治疗苯酮尿症的药物，它的活性成份是能够表达活性苯丙氨酸脱氨酶的人肠道正常菌。
所述人肠道正常菌为乳酸杆菌，双歧杆菌或乳球菌。
所述苯丙氨酸脱氨酶基因来自于伞形花科植物、禾本科植物或红酵母，其中优选的品种为欧芹、水稻或红酵母。
所述能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的人肠道正常菌可以采用以下方法获得1)人工合成具有限制性内切酶粘性末端的编码苯丙氨酸脱氨酶的DNA片段；2)将上述DNA片段与表达载体相连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆。
也可以采用以下方法获得1)从植物或红酵母的总RNA反转录得到苯丙氨酸脱氨酶的cDNA；2)将苯丙氨酸脱氨酶的cDNA与表达载体连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆。
本发明的第二个目的是提供一种生产上述治疗苯酮尿症的药物的方法。
在本发明中，生产治疗苯酮尿症的药物的方法有两种，其中，第一种方法包括以下步骤1)人工合成具有限制性内切酶粘性末端的编码苯丙氨酸脱氨酶的DNA片段；2)将上述DNA片段与表达载体相连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆；5)将阳性克隆大量繁殖，纯化；6)加入医学上可接受的药用载体，得到治疗苯酮尿症的药物。
第二种方法包括以下步骤1)从植物或红酵母的总RNA反转录得到苯丙氨酸脱氨酶的cDNA；2)将苯丙氨酸脱氨酶的cDNA与表达载体连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆；5)将阳性克隆大量繁殖，纯化；6)加入医学上可接受的药用载体，得到治疗苯酮尿症的药物。
为了应用方便，本发明的药物中还可以加有医学上可接受的载体和辅剂。本发明药物的剂型为口服制剂，可以根据不同的需要，制成肠溶胶囊、片剂、粉剂或液体剂型。
本发明药物的用量根据患者的体重进行调整，一般每次为0.5-5活性单位，从新生儿筛查确定为PKU起服用，最好坚持每天饭前后立即服用直到十七岁，PKU孕妇亦应服用。
本发明巧妙地利用了植物和微生物中苯丙氨酸脱氨酶能够将苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸的特性，创造性地将编码苯丙氨酸脱氨酶的基因导入到人肠道本身固有的有益菌中，使其在病人的小肠中进行表达，等于在病人的小肠内设了一个“小药厂”，就地生产苯丙氨酸脱氨酶，就地利用它来将食物消化液中尚没有被吸收的苯丙氨酸脱氨，变成肉桂酸，从而可以有效降低苯丙氨酸的水平，达到治疗PKU之目的。
患者在服用本发明药物的同时，可以与常人一样吃正常的饮食，一方面能够保证患者营养的全面性，另一方面也避免了“饮食疗法”给患者带来的精神上和生活上的压力和痛苦，提高其生活质量本发明的药物生产工艺简单、成本低，能够为广大患者接受。同时，本发明的药物在安全性方面具有切实有效的保障，首先，外源基因只是在有益肠道菌中表达，不进入人体组织细胞，不会对人本身的基因组产生影响，也不会诱发和激活癌基因；同时，为了确保万无一失，本发明导入到载体上的苯丙氨酸脱氨酶基因不采用抗抗生素的基因片段作为标记，保证服用者不会因为服用了本发明的药物而对抗生素产生抗药性。本发明的药物除了可用来治疗苯酮尿症以外，还可以作为催化剂，利用肉桂酸和氨为原料生产苯丙氨酸。
6、培养得到的乳酸杆菌纯化后用pH8.0的0.1mol/L磷酸缓冲液培养基制成液体口服制剂。
7、口服液中苯丙氨酸脱氨酶的鉴定将上述得到的液体口服制剂细胞破碎后聚丙烯凝胶电泳，得到一条约77KD的蛋白质带，经测序证实N端的前15个氨基酸残基正确，证实该蛋白确为苯丙氨酸脱氨酶。
实施例2、从水稻基因组DNA钓出苯丙氨酸脱氨酶基因的方法制备本基因工程药物1、根据水稻苯丙氨酸脱氨酶编码基因的核苷酸序列(Eiichi Minami，YoshiyukiTanaka，Nucleotide sequence of the gene for phenylalanine ammonia-lyase of rice and itsdeduced amino acid sequence，Biochem.et Biopgys.Acta 1171321--322 1993)，用实施例1的引物，以水稻基因组DNA为模板，用PCR技术合成苯丙氨酸脱氨酶基因；2、用EcoRV/Bgl II酶切得到的DNA片段，得到具有粘性末端的苯丙氨酸脱氨酶DNA；3、用EcoRV/Bgl II酶切载体质粒pNZ8149并将苯丙氨酸脱氨酶DNA与其连接；4、用上述重组质粒转化感受态的双歧杆菌；5、筛选被转化双歧杆菌中的阳性克隆，并进行大规模培养；6、培养得到的双歧杆菌冷冻干燥后制成肠溶胶囊。
7、口服肠溶胶囊中苯丙氨酸脱氨酶的鉴定在含苯丙氨酸溶液中加入上述制得的口服肠溶胶囊，用HPLC监测反应液的变化，结果表明，苯丙氨酸在本发明药物的作用下，被脱氨变成了肉桂酸。
实施例3、本发明治疗苯酮尿症药物的药效学鉴定给诱导成功的苯酮尿症模型大鼠饲喂本发明实施例1中得到的制剂，用量为20ml/公斤体重/只大鼠，观查结果表明，服药后大鼠血液及尿液中的苯丙酮酸水平较对照组下降，接近正常水平，两组有显著性差异(P≤0.01)。
权利要求
1.一种治疗苯酮尿症的药物，它的活性成份是表达活性苯丙氨酸脱氨酶的人肠道正常菌。
2.根据权利要求1所述的治疗苯酮尿症的药物，其特征在于所述人肠道正常菌为乳酸杆菌，双歧杆菌或乳球菌。
3.根据权利要求1所述的治疗苯酮尿症的药物，其特征在于所述苯丙氨酸脱氨酶基因来自于伞形花科植物、禾本科植物或红酵母。
4.根据权利要求1所述的治疗苯酮尿症的药物，其特征在于所述植物为欧芹、水稻或红酵母。
5.根据权利要求1或2或3所述的治疗苯酮尿症的药物，其特征在于所述表达活性苯丙氨酸脱氨酶的人肠道正常菌是采用以下方法获得的1)合成具有限制性内切酶粘性末端的编码苯丙氨酸脱氨酶的DNA片段；2)将上述DNA片段与表达载体相连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆。
6.根据权利要求1或2或3所述的治疗苯酮尿症的药物，其特征在于所述表达活性苯丙氨酸脱氨酶的人肠道正常菌是采用以下方法获得的1)从植物或红酵母的总RNA反转录PCR得到苯丙氨酸脱氨酶的cDNA；2)将苯丙氨酸脱氨酶的cDNA与载体连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆。
7.一种生产权利要求1所述治疗苯酮尿症药物的方法，包括以下步骤1)合成具有限制性内切酶粘性末端的编码苯丙氨酸脱氨酶的DNA片段；2)将上述DNA片段与载体相连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆；5)将阳性克隆大量繁殖，纯化；6)加入医学上可接受的药用载体，得到治疗苯酮尿症的药物。
8.一种生产权利要求1所述治疗苯酮尿症药物的方法，包括以下步骤1)从植物或红酵母的总RNA反转录PCR得到苯丙氨酸脱氨酶的cDNA；2)将苯丙氨酸脱氨酶的cDNA与表达载体连接；3)转化感受态的人肠道正常菌；4)筛选阳性克隆；5)将阳性克隆大量繁殖，纯化；6)加入医学上可接受的药用载体，得到治疗苯酮尿症的药物。
9.权利要求1所述的药物作为以肉桂酸和氨为原料生产苯丙氨酸的催化剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种治疗苯酮尿症的药物及其制造方法与应用，目的是提供一种治疗苯酮尿症的药物，它的活性成份是表达活性苯丙氨酸脱氨酶的人肠道正常菌。所述人肠道正常菌为乳酸杆菌，双歧杆菌或乳球菌。所述苯丙氨酸脱氨酶基因来自于伞形花科植物、禾本科植物或红酵母，其中优选的品种为欧芹、水稻或红酵母。本发明的药物生产工艺简单、成本低，能够为广大患者接受。本发明的药物除了可用来治疗苯酮尿症以外，还可以作为催化剂，利用肉桂酸和氨为原料生产苯丙氨酸。
文档编号A61K38/43GK1451435SQ0211721
公开日2003年10月29日 申请日期2002年4月17日 优先权日2002年4月17日
发明者刘敬忠 申请人:首都医科大学附属北京朝阳医院