用于苯丙酮尿症的mrna疗法

用于苯丙酮尿症的mrna疗法
【专利说明】用于苯丙酮尿症的MRNA疗法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2013年10月22日提交的美国临时申请系列No. 61/894,303的优先 权，其公开内容在此通过引用并入。
[0003] 序列表
[0004] 本说明书引用了序列表(于2014年10月22日以电子方式提交为名称为"2006685-0692_SL. txt"的.txt文件）。该.txt文件于2014年10月20日生成，并且大小为18，455字节。 该序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0005] 背景
[0006] 苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性代谢性遗传病，其特征在于，肝酶苯丙氨酸 羟化酶(PAH)的基因突变，导致其无功能。PAH是将氨基酸苯丙氨酸(Phe)代谢成氨基酸酪氨 酸所必需的。当PAH活性降低时，苯丙氨酸积累，并被转化成苯丙酮酸(也称为苯丙酮）。如果 不进行治疗，PKU可导致精神迟缓、癫痫和其它严重的医学问题。目前，没有用于该疾病的疗 法，并且护理标准通过饮食管理来进行，尽量减少含大量蛋白的食物。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明除了其它方面还提供了用于基于mRNA疗法来有效治疗苯丙酮尿症(PKU)的 方法和组合物。本发明部分地基于使用PKU疾病模型的成功的动物研究。例如，如在下文实 施例部分中更详细描述的，施用封装于脂质体内的编码人PAH蛋白的mRNA导致血清、肝以及 其它体内临床相关组织中的高效的蛋白质产生。更重要并且令人意想不到的是，用PAH mRNA治疗PAH敲除小鼠（一种PKU疾病模型）可在给药六小时内有效地将苯丙氨酸水平降低 至野生型水平。因此，本发明人已经显示本文所述的mRNA疗法可高效治疗PKU。
[0009] 在一个方面，本发明提供了治疗PKU的方法，包括以使PKU的至少一个症状或特征 在强度、严重程度或频率上降低或延迟发作的有效剂量和施用间隔施用包含编码苯丙氨酸 羟化酶(PAH)的mRNA的组合物至需要治疗的受试者。
[0010]在另一个方面，本发明提供了用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的组合物，包含封装于脂 质体内的有效剂量量的编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的mRNA。
[0011] 在一些实施方案中，所述mRNA封装于脂质体内。在一些实施方案中，合适的脂质体 包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和 一种或多种PEG-修饰的脂质。
[0012] 在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质选自由以下组成的组:C12-200、 MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑的）、HGT5000、HGT5001、D0DAC、DDAB、 DM0BA、D0carbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、 HGT4003及其组合。
[0013] 在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质包括式I-cl-a的化合物：
[0014]
[0015] 或其药学上可接受的盐，其中：
[0016] 每个R2独立地为氢或Ci-3烷基；
[0017] 每个q独立地为2至6;
[0018] 每个R '独立地为氢或&-3烷基；
[0019] 并且每个Rl独立地为C8-12烷基。
[0020]在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质包括CKK-E12:
[0021]
[0022]在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱 (DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油 (D0PG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷 脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马 来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆 蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-0_单甲基PE、16-0-二 甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其混合物。
[0023]在一些实施方案中，所述一种或多种基于胆固醇的脂质选自胆固醇、聚乙二醇化 的胆固醇和DC-Chol (N，N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇）、1，4-双（3-N-油酰基氨基-丙 基)哌嗪。
[0024]在一些实施方案中，所述脂质体还包含一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方 案中，所述一种或多种PEG修饰的脂质包括共价附接至具有C6-C2q长度的烷基链的脂质的最 多5kDa长的聚（乙二）醇链。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是衍生的神经酰胺，例如N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰（甲氧基聚乙二醇)-2000]。在一些实施方案中，PEG修饰的或聚 乙二醇化的脂质是聚乙二醇化的胆固醇或二肉豆蔻酰基甘油(DMG) -PEG-2K。
[0025] 在一些实施方案中，所述脂质体包含cKK-E12、D0PE、胆固醇和DMG-PEG2K。
[0026] 在一些实施方案中，所述阳离子脂质（例如CKK-E12)构成按摩尔比计约30-60% (例如，约30-55%、约30-50%、约30-45%、约30-40%、约35-50%、约35-45%或约35-40% ) 的所述脂质体。在一些实施方案中，所述阳离子脂质（例如CKK-E12)构成按摩尔比计约 30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%或约60%的所述脂质体。
[0027]在一些实施方案中，阳离子脂质（例如CKK-E12)与非阳离子脂质（例如DOPE)与基 于胆固醇的脂质（例如胆固醇)与聚乙二醇化的脂质（例如DMG-PEG2K)的比率可分别介于约 30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，阳离子脂质（例如CKK-E12)与非阳离子 脂质（例如DOPE)与基于胆固醇的脂质（例如胆固醇)与聚乙二醇化的脂质（例如DMG-PEG2K) 的比率分别为约40:30: 20:10。在一些实施方案中，阳离子脂质（例如CKK-E12)与非阳离子 脂质（例如DOPE)与基于胆固醇的脂质（例如胆固醇)与聚乙二醇化的脂质（例如DMG-PEG2K) 的比率分别为约40 :30:25:5。在一些实施方案中，阳离子脂质（例如冰1(412)与非阳离子脂 质（例如DOPE)与基于胆固醇的脂质（例如胆固醇）与聚乙二醇化的脂质（例如DMG-PEG2K)的 比率分别为约40 :32:25:3。在一些实施方案中，阳离子脂质（例如〇1?412)与非阳离子脂质 (例如DOPE)与基于胆固醇的脂质(例如胆固醇)与聚乙二醇化的脂质(例如DMG-PEG2K)的比 率为约 50:25:20:5。
[0028] 在一些实施方案中，脂质体的尺寸由所述脂质体颗粒的最大直径的长度确定。在 一些实施方案中，合适的脂质体具有小于约500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、150nm、 10〇]1111、75111]1或5〇111]1的尺寸。在一些实施方案中，合适脂质体具有小于约100nm、90nm、80nm、 70nm或60nm的尺寸。
[0029] 在一些实施方案中，提供的组合物经静脉内施用。在一些实施方案中，提供的组合 物经由肺递送来施用。在某些实施方案中，肺递送通过气溶胶化、吸入、雾化或滴注来进行。 在一些实施方案中，提供的组合物被配制成可吸颗粒、可雾化脂质或可吸入干粉。
[0030] 在一些实施方案中，提供的组合物每天施用一次、每周施用一次、每两周施用一 次，每月施用两次、每月施用一次。在一些实施方案中，提供的组合物每7天施用一次、每10 天施用一次、每14天施用一次，每28天施用一次或每30天施用一次。
[0031] 在一些实施方案中，所述mRNA以约0.1mg-5.0mg/体重kg的剂量范围施用，例如约 0.1-4.5、0.1-4.0、0.1-3.5、0.1-3.0、0.1-2.5、0.1-2.0、0.卜1.5、0.卜1.0、0.卜0.5、0.卜 0·3、0·3 _5·0、0·3_4·5、0·3_4·0、0·3_3·5、0·3 _3·0、0·3_2·5、0·3_2·0、0·3_1·5、0·3 _1·0、 0·3-0·5、0·5-5·0、0·5-4·5、0·5 -4·0、0·5-3·5、0·5-3·0、0·5-2·5、0·5 -2·0、0·5-1.5或0.5-I.Omg/体重kg。在一些实施方案中，所述mRNA以以下剂量或小于以下剂量施用:约5.0、4.5、 4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、或0· lmg/体重kg。
[0032]在一些实施方案中，PAH蛋白的表达可在肝、肾、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴 结、皮肤和/或脑脊液中检出。
[0033] 在一些实施方案中，施用所提供的组合物导致肝中约100ng/mg、约200ng/mg、约 300ng/mg、约400ng/mg、约 500ng/mg、约 600ng/mg、约 700ng/mg、约 800ng/mg、约900ng/mg、约 1000ng/mg、约1200ng/mg或约1400ng/mg或以上的总蛋白的PAH蛋白表达水平。
[0034] 在一些实施方案中，在施用后6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和/或72小时， 所述PAH蛋白的表达是可检出的。在一些实施方案中，在施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天 和/或7天，所述PAH蛋白的表达是可检出的。在一些实施方案中，在施用后1周、2周、3周和/ 或4周，所述PAH蛋白的表达是可检出的。在一些实施方案中，在施用后一月，所述PAH蛋白的 表达是可检出的。
[0035] 在一些实施方案中，施用提供的组合物导致升高的血清PAH蛋白水平。在一些实施 方案中，施用提供组合物导致血清PAH蛋白水平比治疗前的基线PAH蛋白水平提高至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95%。
[0036] 在一些实施方案中，施用提供的组合物导致血清中的苯丙氨酸水平比治疗前的基 线苯丙氨酸水平降低。在一些实施方案中，施用提供的组合物导致血清或血浆中的苯丙氨 酸水平降低至约1500ymol/L或更低、约lOOOymol/L或更低、约900ymol/L或更低、约800μ mol/L或更低、约700ymol/L或更低、约600ymol/L或更低、约500ymol/L或更低、约400ymol/L 或更低、约300ymol/L或更低、约200ymol/L或更低、约lOOymol/L或更低或者约50ymol/L或 更低。在一个具体实施方案中，当常规施用时，治疗有效的剂量导致血清或血浆中的苯丙氨 酸水平降低至约120ymol/L或更低。
[0037] 在一些实施方案中，施用所提供的组合物导致生物样品（例如，血清、血浆或尿样 品）中的苯丙氨酸水平比治疗前的基线苯丙氨酸水平降低至少约5%、至少约10%、至少约 15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约 50 %、至少约55 %、至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约 85%、至少约90或至少约95%。
[0038] 在一些实施方案中，所述编码PAH的mRNA是密码子优化的。在一些实施方案中，所 述密码子优化的mRNA包含SEQ ID NO: 3(与密码子优化的人PAH mRNA序列对应）。在一些实 施方案中，所述mRNA包含SEQ ID N0:4的5'UTR序列（与5'UTR序列X对应）。在一些实施方案 中，所述mRNA包含SEQ ID NO: 5的3'UTR序列（与3'UTR序列Y对应）。在一些实施方案中，所述 mRNA包含SEQ ID N0:6的3'UTR序列（与3'UTR序列Y对应）。在一些实施方案中，所述密码子 优化的mRNA包含SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8(与密码子优化的具有5'UTR和3'UTR序列的人 PAH mRNA序列对应）。
[0039] 在一些实施方案中，所述mRNA包含一个或多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中， 所述一个或多个修饰的核苷酸包括假尿苷、N-I-甲基-假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌 苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺 苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0( 6)-甲基鸟苷和/或2-硫代 胞苷。在一些实施方案中，所述mRNA是未修饰的。
[0040] 在具体实施方案中，本发明提供了用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的组合物，包含封装 于脂质体内的有效剂量量的编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID N0:3,并且进一步地其中所述脂质体包含阳离子或非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG 修饰的脂质。
[0041]在具体实施方案中，本发明提供了用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的组合物，包含封装 于脂质体内的有效剂量量的编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8,并且进一步地其中所述脂质体包含阳离子或非阳离子脂质、基于胆固 醇的脂质和PEG修饰的脂质。
[0042]本发明其它特征、目的和优点在接下来的详述、附图和权利要求书中较明显。然 而，应理解，详述、附图和权利要求书虽然表示本发明的实施方案，但是仅以说明而不是限 制的方式给出。本发明范围内的多种变化和修饰对本领域技术人员将是显而易见的。
[0043] 附图简述
[0044]附图仅用于说明而不是限制的目的。
[0045] 图1示出了用所提供的脂质体转染后的HEK293细胞中的示例性PAH蛋白水平。
[0046] 图2描绘了在施用后多个时间点检测的用提供的脂质纳米颗粒治疗的野生型小鼠 的肝中PAH蛋白水平的示例性图表。
[0047]图3描绘了在施用后6、12和24小时检测的用提供的脂质纳米颗粒治疗的PAH KO小 鼠的肝中与未治疗的野生型小鼠和未治疗的PAH KO小鼠相比的PAH蛋白水平的示例性图 表。
[0048]图4示出在用提供的脂质纳米颗粒治疗后6、12和24小时PAH KO小鼠中与未治疗的 野生型小鼠和未治疗的PAH KO小鼠相比的血清苯丙氨酸水平的示例性图表。
[0049] 图5A-5I描绘了对来自用1.0mg/kg hPAH mRNA负载的CKK-E12基脂质纳米颗粒治 疗后(A)30分钟，（B)3小时，（C)6小时，（0)12小时，化)24小时，$)48小时，（6)72小时或(!〇7 天的小鼠的肝组织中以及来自未治疗的小鼠（I)的肝组织中的人PAH mRNA的原位检测。 [0050]图6描绘了 用单剂0 · 25mg/kg、0 · 5mg/kg、0 · 75mg/kg或1 · Omg/kg hPAH mRNA负载的 CKK-E12基脂质纳米颗粒或盐水治疗的PAH敲除小鼠的肝中检测的人PAH蛋白水平的示例性 图表。
[0051 ]图7描绘了 用单剂0 · 25mg/kg、0 · 5mg/kg、0 · 75mg/kg或1 · Omg/kg hPAH mRNA负载的 CKK-E12基脂质纳米颗粒或盐水治疗前和治疗后的PAH敲除小鼠的血清中检测的苯丙氨酸 水平的示例性图表。
[0052] 图8描绘了每周一次用0.5mg/kg或1.0mg/kg hPAH mRNA负载的CKK-E12基脂质纳 米颗粒治疗一个月或隔周一次用I.〇mg/kg hPAH mRNA负载的CKK-E12基脂质纳米颗粒治疗 一个月或用盐水治疗的PAH敲除小鼠的肝中检测的人PAH蛋白水平的示例性图表。
[0053] 图9描绘了每周一次用0.5mg/kg或1.0mg/kg hPAH mRNA负载的CKK-E12基脂质纳 米颗粒治疗前和治疗一个月后或者隔周一次用I.〇mg/kg hPAH mRNA负载的CKK-E12基脂质 纳米颗粒治疗前和治疗一个月后或者用盐水治疗前和治疗后的PAH敲除小鼠的血清中检测 的苯丙氨酸水平的示例性图表。
[0054]发明详述 [0055] 定义
[0056]为了使本发明更容易理解，接下来首先定义一些术语。以下术语或其它术语的其 它定义记载于整个说明书中。本文引用的用于描述本发明的背景以及提供关于其实施的另 外的细节的出版物或其它参考材料通过引用并入本文。
[0057] 烷基：如本文所用，"烷基"是指具有1至15个碳原子的直链或支化饱和烃基团 (uC1- 15烷基"）。在一些实施方案中，烷基具有1至3个碳原子（"&―3烷基"3烷基基团的例 子包括甲基(C 1)、乙基(C2)、正丙基(C3)和异丙基(C3)。在一些实施方案中，烷基具有8至12 个碳原子（"C 8-12烷基"）。(：8-12烷基基团的例子包括而不限于正辛基(C 8)、正壬基(C9)、正癸 基(ClQ)、正十一烷基（Cll)、正十二烷基（Cl2)等。如缀"正（正）是指未支化的烷基基团。例 如，正C 8烷基是指-(CH2 )7CH3，正C1Q烷基是指-(CH2)9CH 3等。
[0058] 氨基酸:如本文所用，术语"氨基酸"就其最广含义，是指可掺入于多肽链内的任何 化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构出.(：(!1)(1〇-⑶0H。在一些实 施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸;在一些 实施方案中，氨基酸是d-氨基酸;在一些实施方案中，氨基酸是1-氨基酸。"标准氨基酸"是 指天然存在的肽中通常存在的二十种标准1-氨基酸中的任一种。"非标准氨基酸"是指除了 标准氨基酸外的任何氨基酸，无论其是通过合成制备还是得自天然来源。如本文所用，"合 成氨基酸"涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或代替 物。氨基酸，包括肽中的羧基-和/或氨基-端的氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护 基团和/或用可改变肽的循环半衰期而不有害地影响其活性的其它化学基团替换来修饰。 氨基酸可参与二硫键。氨基酸可包含一个或多个翻译后修饰，例如与一个或多个化学实体 (例如，甲基基团、乙酸根集团、乙酰基团、磷酸根基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸 根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语"氨基酸"与 "氨基酸残基"可互换使用，并且可指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。其是指游离氨基酸 还是指肽的残基将从使用该术语的上下文显而易见。
[0059] 动物：如本文所用，术语"动物"是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，"动 物"是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，"动物"是指处于任何发育阶段的非人 动物。在某些实施方案中，所述非人动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、 狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪）。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟 类、爬行类、两栖类、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传 工程化的动物和/或克隆。
[0000] 约(approximately)或约(about):如本文所用，当应用于一个或多个目标值时，术 语"约(approximately)"或"约(about)"是指与所记载的参考值相似的值。在某些实施方案 中，除非另有说明或另外从上下文(该数将超过可能值的100%时除外）显著，否则术语"约 (approximately)"或"约(about)"是指以任一方向（大于或小于参考值)落在所记载的参考 值的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、 6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值内的值的范围。
[0061] 生物学活性:如本文所用，短语"生物学活性"是指具有生物学系统活性并且特别 是生物体活性的任何试剂的性质。例如，当施用于生物体时对该生物体具有生物学作用的 试剂被认为是具有生物学活性的。
[0062] 递送:如本文所用，术语"递送"涵盖局部递送和全身递送二者。例如，mRNA的递送 涵盖其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质表达并保留于所述靶组织内的情形(也称 为"局部分布"或"局部递送"），以及其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质表达并分 泌至患者的循环系统(例如血清）中并且被系统性分布以及由其它组织溶解的情形(也成为 "全身分布"或