RNA以增强稳定性。mRNA的修饰可包括例如对RNA的核苷酸的修饰。因此，根据本发 明的修饰的mRNA可包括例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mRNA可由天 然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(修饰的核苷酸)合成，包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、 鸟嘌呤(G))或嘧啶（胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及作为嘌呤和嘧啶的修饰的 核苷酸类似物或衍生物，例如如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰 基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲 基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶（5-尿嘧啶）、二氢-尿嘧啶、2-硫 代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿 嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、 5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2_硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、 尿啼啶-5-氧基乙酸(V)、1_甲基-假尿啼啶、辫苷(queosine)、.β.-D-甘露糖基-辫苷、怀丁 氧苷(wybutoxosine)，以及氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟嘌 呤、5-甲基胞嘧啶和肌苷。这样的类似物的制备对本领域技术人员而言例如从以下文献已 知：美国专利No .4,373,071、美国专利No .4,401,796、美国专利No .4,415,732、美国专利 No .4,458,066、美国专利No .4,500,707、美国专利No .4,668,777、美国专利No .4,973,679、 美国专利No. 5,047,524、美国专利No. 5,132,418、美国专利No. 5,153,319、美国专利No. 5， 262，530和5，700，642，其公开内容通过引用整体并入。
[0150] 在一些实施方案中，mRNA(例如编码PAH的mRNA)可含有RNA骨架修饰。通常来说，骨 架修饰是其中包含于RNA中的核苷酸的骨架磷酸酯被化学修饰的修饰。示例性的骨架修饰 通常包括但不限于来自由以下组成的修饰：甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫 代磷酸酯(例如胞苷5硫代磷酸））、硼烷磷酸酯、带正电的胍鑰基团等，其意为磷酸 二酯键被其它阴离子、阳离子或中性基团替代。
[0151 ]在一些实施方案中，mRNA(例如编码PAH的mRNA)可含有糖修饰。典型的糖修饰是对 其含有的核苷酸的糖的化学修饰，其包括但不限于选自由以下组成的组的糖修饰:2'_脱 氧-2 ' -氟-寡核糖核苷酸(2 ' -氟-2 ' -脱氧胞苷5 ' -三磷酸、2 ' -氟-2 ' -脱氧尿苷5 ' -三磷酸）、 2 ' -脱氧_2 ' -脱胺-寡核糖核苷酸(2 ' -氨基-2 '脱氧胞苷5 ' -三磷酸、2 ' -氨基-2 ' -脱氧尿苷 5 ' -三磷酸）、2 ' -0-烷基寡核糖核苷酸、2 ' -脱氧-2 ' -C-烷基寡核糖核苷酸(2 ' -0-甲基胞苷 5'_三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸）、2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'_芳胞苷5'-三磷酸、2 ' -芳尿苷5 ' -三磷酸）或叠氮三磷酸酯（2 ' -叠氮-2 ' -脱氧胞苷5 ' -三磷酸、2 ' -叠 氮_2'_脱氧尿苷5'-三磷酸）。
[0152] 在一些实施方案中，mRNA(例如编码PAH的mRNA)可含有核苷酸的碱基的修饰(碱基 修饰）。含有碱基修饰的修饰的核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。这样的碱基修饰的核苷酸 的例子包括但不限于2-氨基-6-氯嘌呤核苷5 三磷酸、2-氨基腺苷5 三磷酸、2-硫代胞苷 5 三磷酸、2-硫代尿苷5 三磷酸、4-硫代尿苷5 三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5 三磷酸、 5_氨基烯丙基尿苷5 三磷酸、5-溴胞苷5 三磷酸、5-溴尿苷5 三磷酸、5-碘胞苷5 三磷 酸、5-碘尿苷5 三磷酸、5-甲基胞苷5 三磷酸、5-甲基尿苷5 三磷酸、6-氮杂胞苷5 三 磷酸、6-氮杂尿苷5 三磷酸、6-氯嘌呤核苷5 三磷酸、7-脱氮腺苷5 三磷酸、7-脱氮鸟苷 5 三磷酸、8-氮杂腺苷5 三磷酸、8-叠氮腺苷5 三磷酸、苯并咪唑核苷5 三磷酸、Nl-甲 基腺苷5 三磷酸、Nl-甲基鸟苷5 三磷酸、N6-甲基腺苷5 三磷酸、06-甲基鸟苷5 三磷 酸、假尿苷5 三磷酸、嘌呤霉素5 三磷酸或黄苷5 三磷酸。
[0153] 通常来说，mRNA合成包括在N端(5'）末端加"帽"以及在C端(3'）末端加"尾"。帽的 存在对于提供对在大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性是重要的。"尾"的存在用于保护 mRNA不受核酸外切酶的降解。
[0154] 因此，在一些实施方案中，mRNA(例如编码PAH的mRNA)包含5'帽结构。5'帽通常按 如下方法添加:首先，RNA末端磷酸酶移除来自5 '核苷酸的末端磷酸根基团中的一个，留下 两个末端磷酸根;然后经由鸟苷酰基转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸根，产生5' 5'5三磷酸键；然后由甲基转移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的例子包括但不限于m7G (5,）ppp(5'（A，G(5'）ppp(5'）A和G(5'）ppp(5'）G。
[0155] 在一些实施方案中，mRNA(例如编码PAH的mRNA)包含3'多(A)尾结构。mRNA3'末端 上的多A尾通常包括约10至300个腺苷酸核苷酸（SEQ ID NO: 9)(例如，约10至200个腺苷酸 核苷酸、约10至150个腺苷酸核苷酸、约10至100个腺苷酸核苷酸、约20至70个腺苷酸核苷 酸，或约20至60个腺苷酸核苷酸）。在一些实施方案中，mRNA包含3'多（C)尾结构。mRNA3'末 端上的合适的多C尾通常包括约10至200个胞苷酸核苷酸(SEQ ID NO: 10)(例如，约10至150 个胞苷酸核苷酸、约10至100个胞苷酸核苷酸、约20至70个胞苷酸核苷酸、约20至60个胞苷 酸核苷酸，或约10至40个胞苷酸核苷酸）。可将多C尾添加至多A尾，或多C尾可替代多A尾。
[0156] 在一些实施方案中，mRNA包含5'和/或3'非翻译区。在一些实施方案中，5'非翻译 区包含影响mRNA稳定性或翻译的一个或多个元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5' 非翻译区可介于约50至500个核苷酸长。
[0157] 在一些实施方案中，3'非翻译区包含多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的定位 稳定性的蛋白结合位点或一个或多个针对miRNA的结合位点中的一种或多种。在一些实施 方案中，3'非翻译区可介于50至500个核苷酸长，或更长。
[0158] 帽结构
[0159] 在一些实施方案中，mRNA包含5 '帽结构。5 '帽通常按如下方法添加:首先，RNA末端 磷酸酶移除来自5'核苷酸的末端磷酸根基团中的一个，留下两个末端磷酸根;然后经由鸟 苷酰基转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸根，产生5 ' 5 ' 5三磷酸键;然后由甲基转 移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的例子包括但不限于m7G(5'）ppp(5'（A，G(5'）ppp(5'）A 和G(5'）ppp(5'）G。
[0160] 天然存在的帽结构包含经由三磷酸桥与第一个转录的核苷酸的5 '末端连接的7-甲基鸟苷，其导致m7G(5 '）ppp(5 '）N的二核苷酸帽，其中N是任何核苷酸。在体内，帽通过酶 促的方式添加。帽在核内添加，并且由酶鸟苷酰基转移酶催化。在转录起始后立即发生帽添 加至RNA的5'端末端。所述末端核苷酸通常是鸟苷，并且为与所有其它核苷酸相反的朝向， 艮P，G(5 '）ppp(5 '）GpNpNp。
[0161] 用于通过体外转录的产生的mRNA的常用帽是!1176(5'）？?？(5'）6，其已经被用作以 T7或SP6RNA聚合酶体外转录中的二核苷酸帽，从而得到在其5'末端具有帽结构的RNA。用于 体外合成加帽mRNA的主要方法使用预先形成的m 7G(5'）ppp(5'）G( "m7GpppG"）形式的二核苷 酸作为转录的引发剂。
[0162] 迄今为止，体外翻译实验使用的通常的合成二核苷酸帽形式是抗反向帽类似物 ("ARCA"）或修饰的ARCA，其一般是其中2 '或3 'OH基团被-OCH3替代的修饰的帽类似物。
[0163] 另外的帽类似物包括但不限于选自由以下组成的组的化学结构：m7GpppG、 11176口口口六、111 76口口口(：；未甲基化的帽类似物（例如6口口口6);二甲基化的帽类似物（例如111 2， 7GpppG)、三甲基化的帽类似物（例如m2'2'7GpppG)、二甲基化的对称帽类似物（例如 m 7Gpppm7G)或抗反向帽类似物（例如ARCA;m7'2 QmeGpppG、m72 dGpppG、m7'3 QmeGpppG、m7'3 dGpppG和它们的四磷酸酯衍生物）（参见例如，Jemielity，J·等，"Novel 'anti-reverse' cap analogs with superior translational properties"，RNA，9:1108-1122(2003))〇
[0164] 在一些实施方案中，合适的帽是7-甲基鸟苷酸（"m7G"），其经由三磷酸桥与第一个 转录的核苷酸的5 '末端连接，产生m7G (5 '）ppp (5 '）N，其中N是任何核苷酸。本发明的一些实 施方案中采用的m7G帽的优选实施方案是m7G (5 '）ppp (5 '）G。
[0??5]在一些实施方案中，所述帽是CapO结构。CapO结构缺乏核糖与碱基1和2连接的2'-0-甲基残基。在一些实施方案中，所述帽是Capl结构。Capl结构具有碱基2处的2甲基残 基。在一些实施方案中，所述帽是Cap2结构。Cap2结构具有与碱基2和3二者连接的2甲 基残基。
[0166] 多种m7G帽类似物是本领域已知的，其中许多是市售的。这些包含上文描述 m7GpppG，以及ARCA 3'-OCH3和2'-OCH3帽类似物（Jemielity，J.等，RNA，9:1108-1122 (2003))。本发明的一些实施方案中使用的另外帽类似物包括N7-苄基化二核苷四磷酸类似 物(Grudzien ,E ·等，RNA, 10 :1479-1487(2004)中描述）、硫代磷酸酯帽类似物(Grudzien-Nogalska,E.等，RNA, 13 :1745-1755(2007)中描述）以及美国专利No .8,093,367和8,304, 529中描述的帽类似物(包括生物素化的帽类似物），通过引用并入本文。
[0167] 尾结构
[0168] 通常来说，"尾"的存在用于保护mRNA不受核酸外切酶的降解。多A尾被认为稳定天 然信使和合成的正义RNA。因此，在某些实施方案中，可添加长的多A尾至mRNA分子从而使该 RNA更稳定。可使用多种领域已知的技术来添加多A尾。例如，可使用多A聚合酶添加长的多A 尾至合成或体外转录的RNA(Yokoe等Nature Biotechnology · 1996; 14:1252-1256)。转录载 体还可编码长多A尾。此外，可通过直接从PCR产物转录来添加多A尾。还可用RNA连接酶将多 A连接至正义RNA的3'末端（参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual第二版， Sambrook,Fritsch和Maniatis编（Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991版））。
[0169] 在一些实施方案中，mRNA包含3'多(A)尾结构。通常来说，多A尾的长度可为至少约 10、50、100、200、300、400至少500个核苷酸（SEQIDN0:ll)。在一些实施方案中，mRNA3'末 端上的多A尾通常包括约10至300个腺苷酸核苷酸（SEQ ID NO: 9)(例如，约10至200个腺苷 酸核苷酸、约10至150个腺苷酸核苷酸、约10至100个腺苷酸核苷酸、约20至70个腺苷酸核苷 酸，或约20至60个腺苷酸核苷酸）。在一些实施方案中，mRNA包含3'多(C)尾结构。mRNA 3'末 端上的合适的多C尾通常包括约10至200个胞苷酸核苷酸(SEQ ID NO: 10)(例如，约10至150 个胞苷酸核苷酸、约10至100个胞苷酸核苷酸、约20至70个胞苷酸核苷酸、约20至60个胞苷 酸核苷酸，或约10至40个胞苷酸核苷酸）。可将多C尾添加至多A尾，或多C尾可替代多A尾。
[0170] 在一些实施方案中，调节多A或多C尾的长度以控制本发明的修饰的正义mRNA分子 的稳定性，并从而控制蛋白质的转录。例如，因为多A尾的长度可影响正义mRNA分子的半衰 期，所以可调节多A尾的长度以改变该mRNA对核酸酶抗性的水平，并由此控制靶细胞中多核 苷酸表达和/或多肽产生的时程。
[0171] 5'和3'非翻译区
[0172] 在一些实施方案中，mRNA包含5 '和/或3 '非翻译区。在一些实施方案中，5 '非翻译 区包含影响mRNA稳定性或翻译的一个或多个元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5' 非翻译区可介于约50至500个核苷酸长。
[0173] 在一些实施方案中，3'非翻译区包含多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的定位 稳定性的蛋白结合位点或一个或多个miRNA的结合位点中的一种或多种。在一些实施方案 中，3'非翻译区可介于50至500个核苷酸长，或更长。
[0174] 示例性的3 '和/或5 ' UTR序列可从稳定的mRNA分子（例如，球蛋白、肌动蛋白、 GATOH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)衍生，以提高该正义mRNA分子的稳定性。例如，5' UTR序列可包含CMV立即早期I(IEl)基因的部分序列或其片段，以提高该多核苷酸的核酸酶 抗性和/或提高多核苷酸的半衰期。还设想了将编码人生长激素(hGH)的序列或其片段包含 于多核苷酸(例如mRNA)的3'末端或非翻译区，以进一步稳定化所述多核苷酸。一般而言，这 些修饰改进了所述多核苷酸相对于它们的未修饰同类物的稳定性和/或药代动力学性能 (例如半衰期），并且包括例如进行的提高这样的多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性的修 饰。
[0175] 脂质体的形成
[0176] 用于在本发明的脂质体运输媒介物可通过本领域当前已知的多种技术来制备。用 于提供的组合物的脂质体可通过本领域当前已知的多种技术来制备。例如，多层囊(MLV)可 根据常规技术来制备，例如通过将所选脂质溶解于合适的溶剂中然后蒸发溶剂以在器皿的 内壁上留下薄膜，或者通过喷雾干燥，由此将选择的脂质沉积于合适容器或器皿的内壁上。 然后可将水相添加该器皿中，进行涡旋运动，导致形成MLV。然后可通过对所述多层囊进行 均质化、超声处理或挤出形成单层囊(ULV)。此外，可通过去污剂去除技术来形成单层囊。
[0177] 在某些实施方案中，提供的组合物包含脂质体，其中mRNA与脂质体的两个表面结 合并且封装于该相同的脂质体内。例如，在制备本发明的组合物期期间，阳离子脂质体可通 过静电相互作用与mRNA缔合。
[0178] 在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包含封装于脂质体中的mRNA。在一些 实施方案中，可将所述一种或多种mRNA种类封装于同一脂质体中。在一些实施方案中，可将 所述一种或多种mRNA种类封装于不同脂质体中。在一些实施方案中，将所述mRNA封装于一 种或多种脂质体中，这些脂质体的脂质组成、脂质组分的摩尔比、尺寸、电荷(ζ电势）、靶向 配体和/或其组合不同。在一些实施方案中，所述一种或多种脂质体可具有不同的阳离子脂 质、中性脂质、PEG修饰的脂质和/或其组合的组成。在一些实施方案中，所述一种或多种脂 质体可具有不同的用于制造该脂质体的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG修饰的脂质的 摩尔比。
[0179]将所需的mRNA掺入脂质体的过程常常被称为"负载"。示例性的方法在Lasic等， FEBS Lett. ,312:255-258,1992中有描述，其通过引用并入本文。掺入脂质体的核酸可完全 或部分地的定位于脂质体的内部空间中、脂质体的双层膜内或与脂质体膜的外表面缔合。 将核酸掺入脂质体在本文中还被称为"封装"，其中核酸被完全包含于脂质体的内部空间 内。将mRNA掺入运输媒介物例如脂质体中的目的常常是为了使核酸免于可含降解核酸的酶 或化学物质和/或可引起核酸快速排出的系统或受体的环境。因此，在一些实施方案中，合 适的递送媒介物能够增强包含于其中的mRNA的稳定性，和/或促进mRNA递送至靶细胞或组 织。
[0180] 脂质体尺寸
[0181] 根据本发明的合适的脂质体可被制成多种尺寸。在一些实施方案中，提供脂质体 可被制成小于以前已知的封装mRNA的脂质体。在一些实施方案中，脂质体的尺寸减小与更 高效地递送mRNA有关。合适的脂质体尺寸的选择可考虑靶细胞或组织的部位，以及在某种 程度上考虑该脂质体将被制备的用途。
[0182] 在一些实施方案中，选择合适的脂质体尺寸以促进由所述mRNA编码的PKU蛋白的 全身分布。在一些实施方案中，可需要限制所述mRNA转染至某些细胞或组织。例如，对于靶 肝细胞，可使脂质体形成成一定尺寸以使其尺寸小于肝中内皮层内衬肝窦状隙的穿孔;在 这样的情况下，所述脂质体可容易地穿过这样的内皮穿孔到达靶肝细胞。
[0183] 可选地或此外，可使脂质体形成一定，以使所述脂质体的尺寸具有限制或明显避 免分布到某些细胞或组织中的的足够直径。例如，可使脂质体形成一定尺寸以使其尺寸大 于内皮层内衬肝窦状隙的穿孔，从而限制所述脂质体分布至肝细胞。
[0184] 在一些实施方案中，脂质体的尺寸由所述脂质体颗粒的最大直径的长度确定。在 一些实施方案中，合适的脂质体具有不大于约250nm(例如不大于约225nm、200nm、175nm、 15〇111]1、125111]1、10〇111]1、75111]1或5〇111]1)的尺寸。在一些实施方案中，合适的脂质体具有范围介于 约 10-250nm(例如，范围介于约 10-225nm、10-200nm、10-175nm、10-150nm、10-125nm、10-10011111、10-7511111或10-5011111)的尺寸。在一些实施方案中，合适的脂质体具有范围介于约100-250nm(例如，范围介于约 100-225nm、100-200nm、100-175nm、100-150nm)的尺寸。在一些实 施方案中，合适的脂质体具有范围介于约IO-IOOnm(例如，范围介于约10-90nm、10-80nm、 10_70nm、10_60nm 或 10_5nm)的尺寸。
[0185] 多种本领域已知的可选方法可用于使脂质体类群形成尺寸。一种这样的形成尺寸 的方法在通过引用并入本文的美国专利No.4,737,323中有描述。通过浴超声处理或探针超 声处理对脂质体混悬液进行超声处理，导致尺寸渐渐减小至小于约0.05微米直径的小ULV。 均质化是依靠对剪切能使大脂质体片段化为小脂质体的另一种方法。在典型的均质化方法 中，使MLV再循环通过标准乳剂均质机直至观察到选择的脂质体尺寸，通常介于约0.1至0.5 微米之间。所述脂质体的尺寸可通过如在Bloomfield ,Ann .Rev .Biophys .Bioeng ·，10:421-150(1981)中描述的通过引用并入本文的准电子光散射(QELS)来确定。平均脂质体直径可 通过对形成的脂质体进行超声处理来减小。可将间歇性超声处理循环与QELS评估相间进 行，以引导充分的脂质体合成。
[0186] 药物组合物
[0187] 为了促进mRNA体内表达，可将递送媒介物例如脂质体与一种或多种额外的核酸、 载体、靶向配体或稳定化试剂组合配制，或配制于将其与合适的赋形剂混合的药理组合物 中。用于配制和施用药物的技术可见于〃Remington ' s Pharmaceutical Sciences，〃Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，最新版。
[0188] 提供的脂质体封装的或脂质体结合的mRNA、和包含所述mRNA的组合物可根据现行 的医学实践来施用和给药，将受试者的临床症状、施用的部位和方法、施用的时间表、受试 者的年龄、性别、体重和其它与本领域普通临床医生有关的其它因素纳入考虑。用于本文目 的的"有效量"可通过如实验临床研究、药理学、临床和医疗领域的普通技术人员已知的相 关考虑来确定。在一些实施方案中，所施用的量可有效实现症状和其它被本领域技术人员 选择为疾病进展、衰退或改善的合适度量的指标的至少一些稳定、改善或消除。例如，合适 的量和给药方案是引起至少暂时产生蛋白质(例如酶)的方案。
[0189] 合适的施用...