专利名称：分离型医疗材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用了具有活体适合性的透明质酸酯的衍生物的关节病症治疗用的注入剂。
背景技术：
透明质酸是由β-D-N-乙酰氨基葡糖和β-D-葡糖醛酸相互结合而成的直链状的高分子多糖。人们公知透明质酸除分布于哺乳动物的结缔组织中，另外还存在于鸡冠、连锁球菌的夹膜等处。鸡冠、脐带等可用作提取材料，也可从连锁球菌的培养物来调制精制物。
人们公知天然产的透明质酸的分子量具有多分散性，无种群和脏器特异，在移植或注入活体时，也显示良好的活体适应性。
关节液被供给活体关节的关节软骨作为营养，同时它还具有其它种类液体不具有的良好的润滑功能和抗冲击功能，而关节液中主要成分之一，透明质酸对该良好的粘弹性功能起到了至关重要的作用。人们还公知，透明质酸的分子量是几百万-1千万的高分子量。
通常，从变形性关节病症、慢性关节风湿病等各种关节病症患者的关节液中的透明质酸浓度和分子量的分析结果看，人们确认关节病症患者的关节液与正常的关节液相比，其浓度、分子量都趋向于偏低，人们认为它与关节液的润滑作用、关节软骨表面保护作用的降低所引起的运动功能障碍和疼痛症状的发生有着密切联系。
作为这些关节病症中的变形性膝关节病症的有效治疗手段，采用将透明质酸溶液注入疾患关节部位的方法，作为该膝关节治疗剂的具体例，可例举アルツ(生化学工业公司制，平均分子量为90万)、Hyalgan(Fidia公司制造，平均分子量＜50万)以及本发明者基于高分子量的治疗剂有望能获得更良好的效果的思路，开发出也适合于慢性关节风湿病的スベニ一ル(アベンテイスファ一マ公司/中外制药公司/电气化学工业公司制造，平均分子量为190万)。
此外，还开发了含有通过化学交联透明质酸，高分子化而改良了粘弹性的、交联透明质酸凝胶的Synvisc(ジエンザイム公司制造)。该交联透明质酸凝胶是通过交联剂二乙烯基砜对透明质酸进行化学交联而成的透明质酸凝胶，称为海兰(ハイラン)。海兰和交联海兰而成的凝胶的生成法在美国专利第4713448号中有详细记载。将透明质酸作为基础物质的单一和混合凝胶在美国专利第4582865号和第4605691号中有记载。
采用这些关节制剂的治疗必须是每周3-5次直接对患者的关节进行注射，从减轻患者和医务人员的负担的角度看，希望减少注射次数。
关于含自交联透明质酸的关节治疗剂的技术也在WO97/49412中有记载。其目的是利用交联透明质酸来控制粘弹性的性质以及关节内的滞留性。还公开了通过均匀混合自交联的透明质酸和透明质酸的水溶液以控制粘弹性的技术。还概念性地显示了在关节腔内自交联透明质酸水解，可制得天然的透明质酸的容器(reservoirs)。
关节液的pH约为7.3-7.6。(日本生化学学会编，生化学手册I，东京化学同人，1979，p1569)记录了关节腔内所注射的关节治疗剂的pH与关节液的pH有很大差别的情况下，成为引起刺激性和疼痛的原因。为此，将アルツ或スベニ一ル的pH调整到以7.4为中心的范围内。
为了减轻医疗机构的调整投药时的负担、防止细菌污染和异物混入等，对关节治疗剂，在出售形式上从瓶剂到预充式注射器(预充式シリンジ)的这类盒剂，产生了很大变化。从瓶剂，特别是将高粘度的透明质酸制剂抽入注射筒内的时间长，抽入量的偏差也大。用盒剂不仅能减轻医疗机构投药调整的负担，而且可容易且更加均匀地注入设定液量，是医疗上有益的剂形。
本发明者在深入研究透明质酸的酯衍生物、特别是自交联透明质酸的性质的过程中，发现该酯衍生物在中性区域内不具有足够的稳定性。投入活体的医疗材料被制剂化成生理条件的中性区域，但是如果按照该条件，在将透明质酸的酯衍生物用作医疗材料时，则在流通过程等中可能不能经受长期保存。
因此，为了解决如下问题，即特别在使由上述透明质酸的酯衍生物制得的医疗材料制剂化时，透明质酸的酯衍生物在中性pH区域内不稳定的问题，本发明者对稳定提供该酯衍生物的方法进行了深入研究。其结果发现该酯衍生物在pH为4.5-6.5的弱酸性区域条件下，稳定性提高。因此，在提供将透明质酸的酯衍生物作为成分的医疗材料时，考虑形成如下这种形态的制剂，即在弱酸性的透明质酸的酯衍生物的分散水溶液以及中和剂溶液、还包括中和剂溶液中溶解有透明质酸的情况，以分离状态进行填充，形成两者不同的pH条件，在治疗时能够混合注入，从而最终能够在生理中性pH条件下给药的制剂，并据此完成本发明。
发明内容
本发明的由如下的要点组成
1.分离型医疗材料，其特征在于，它由缓冲至pH为4.5-6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的(A)液，以及具有将与该(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8范围内的缓冲能的水溶液的(B)液构成，(A)液和(B)液在给药时混合投入，但给药前保持分离的状态。
2.根据上述1所述的分离型医疗材料，其特征在于，(A)液的透明质酸酯衍生物是自交联的透明质酸。
3.根据上述1或2所述的分离型医疗材料，其特征在于，(A)液含有透明质酸酯衍生物的水溶液的透明质酸酯衍生物的浓度在1-20质量％的范围内。
4.根据上述1、2或3所述的分离型医疗材料，其特征在于，具有将与(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8的范围内的缓冲能的水溶液的(B)液是溶解了透明质酸的水溶液。
5.根据上述1-4中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，还含有医药品或可医药性相容的润滑剂。
6.根据上述5所述的分离型医疗材料，其特征在于，在缓冲至pH为4.5-6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的(A)液中溶解或分散有医药品或可医药性相容的润滑剂。
7.根据上述5或6所述的分离型医疗材料，其特征在于，在(A)液的透明质酸酯衍生物中溶解或分散有医药品或可医药性相容的润滑剂。
8.根据上述5-7中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，在具有将与(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8范围内的缓冲能的水溶液的(B)液中，溶解或分散有医药品或可医药性相容的润滑剂。
9.根据上述5-8中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，可医药性相容的润滑剂是磷脂质。
10.根据上述1-9中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，它是在注射器以分离的状态填充(A)液和(B)液的关节注入型医疗材料。
11.关节疾病用的医疗材料的给药方法，其特征在于，在将要给药前，将构成上述1-10中任一项的分离型医疗材料的(A)液和(B)液混合成混合液，并将该混合液注入患者的关节以实施给药。
图1是本发明的分离型医疗材料的一实施例的、填充到预充式注射器中的样品的示意图。
符号的说明1前端部密封用部件2橡胶档块3圆筒4柱塞杆(A)凝胶悬浮液(B)透明质酸具体实施方式
以下详细说明本发明。
用在本发明的透明质酸，不问其来源，可用从动物组织提取的透明质酸，也可使用通过发酵法所制得的透明质酸。
用在发酵法中的菌株较好是如下能高产率并稳定生产透明质酸的变异菌株，如从自然界分离出的粪类链球菌类等具有透明质酸生产能力的微生物；或者是日本特许公开公报昭63-123392号中所记载的粪类链球菌·エクイFM-100(微工研菌寄第9027号)、日本特许公开公报平2-234689号中所记载的粪类链球菌·エクイFM-300(微工研菌寄第2319号)。使用采用上述变异菌株进行培养并精制而成的菌株。
用在本发明的透明质酸的分子量较好约为1×105-1×107道尔顿的范围内。只要是具有上述范围内的分子量的透明质酸，即使是由更高的分子量的物质进行水解处理等而制得的低分子量的透明质酸，也同样适合使用。
本发明所说的透明质酸还包括其碱金属盐，例如钠、钾、锂盐的概念。
作为透明质酸的酯衍生物及其制造方法，在EP 0216453B1中公开了以脂肪族、芳香族、芳基脂肪族(arylalip透明质酸tic)、环状脂肪族、多环系列的醇将一部分或全部的羧基进行酯化而成的透明质酸酯。另外，在EP 0341745B1中还公开了用同一的多糖链或者其它多糖链的醇基将一部分或全部的羧基酯化而成、自交联的透明质酸酯。以脂肪族、芳香族、芳基脂肪族、环状脂肪族、多环系列的多元醇将一部分或全部的羧基酯化、通过间隔链(スベ一サ一鎖)产生交联而成的透明质酸的交联化合物。另外，在WO95/25751中记载了与透明质酸或透明质酸的部分或全部的酯的琥珀酸的半酯。在WO99/10385中记载了将透明质酸的水溶液调整到酸性，冻结该水溶液，然后通过至少一次解冻所生成的自交联透明质酸凝胶。在WO01/57093中记载了不进行冻结而通过将透明质酸和酸性溶液混合并保持在该共存状态，使成为5质量％以上的浓度，而生成的自交联透明质酸。公开了通过将透明质酸进行酯衍生物化，与透明质酸的水溶液相比，提高了在活体内的滞留性。
将透明质酸的酯衍生物用作关节治疗剂时，从控制粘弹性的性质为目的看，酯交联后的透明质酸的酯衍生物较为理想。多元醇和透明质酸的羧基而成的酯、多元羧酸和透明质酸的羟基而成的酯、透明质酸的羧基和羟基间进行酯结合而成的自交联透明质酸都较为理想。在通过在关节腔内进行酯键的水解，即使在以形成天然的透明质酸的容器(reservoirs)为目的的情况下，也较好用酯交联而成的透明质酸，它以低酯化度大大改变在活体内的滞留性。
自交联透明质酸的安全性，由于自交联透明质酸的分解所放出的天然的透明质酸被生理学的代谢路径所代谢，具有高于通过其它的交联反应而制得的酯交联透明质酸的安全性。将透明质酸的酯衍生物用作关节治疗剂时，以形成天然的透明质酸的容器(reservoirs)为目的情况下，所放出的透明质酸自身的分子量大为好。人们公知透明质酸从关节腔内的代谢(移动)受到透明质酸自身的分子量的很大影响(CibaFoundation Symposium 143，The Biology of Hyaluronan，John Wiley&Sons，1989，p265)。
所放出的透明质酸的分子量在30万以下时，所放出的透明质酸由于快速从关节腔内代谢(移动)，所以关节治疗的效果可能会大大减退。
将透明质酸的酯衍生物用作关节治疗剂时，由于通过注射针注入到关节腔内，所以必须将透明质酸的酯衍生物分散在生理性可相容的介质内，形成为悬浮液。由于可通过在透明质酸的酯衍生物的制造工序、精制工序的在一阶段中，使用混合机或均化器那样的破碎机将透明质酸的酯衍生物进行破碎来调整的透明质酸的酯衍生物的分散粒子的粒径，控制关节治疗剂的物理化学性质和效果，所以可任意调整悬浮液。将透明质酸的酯衍生物分散在生理性可相容的介质后，利用均化器进行处理的话，可容易调整到0.05mm-2.0mm的分散粒径。
酯交联透明质酸在生理性可相容的介质中膨润形成凝胶。凝胶的平衡膨胀倍率可由酯交联透明质酸的交联度进行任意调整。例如，平衡膨胀倍率为100倍时，可生理性相容的介质中的透明质酸浓度为1.0质量％。平衡膨胀倍率为10倍时，可生理性相容介质中的透明质酸的浓度为10质量％。将酯交联透明质酸用作关节治疗剂时，以形成天然的透明质酸的容器(reservoirs)为目的的情况下，可生理性相容的介质中的透明质酸浓度高，在将注入关节腔内的容量恒定时，由于增大了注入关节腔内的透明质酸量，能够期待好的治疗效果。
市面上出售的膝关节治疗剂，例如アルツ或スベニ一ル等的透明质酸水溶液的透明质酸浓度为1.0质量％。所以在可生理性相容的介质中分散酯交联透明质酸的浓度小于1质量％时，不能期望获得好于市面出售产品的治疗效果。由于透明质酸分子自身具有对水的高亲和性，在可生理性相容的介质中分散酯交联透明质酸时，其透明质酸浓度高于20质量％会显著影响分散液的流动性，所以不实用。
在本发明中，缓冲至为pH为4.5-6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的(A)液，以及具有将与(A)液进行混合时的pH控制在6.8-7.8的范围内的缓冲能的水溶液的(B)液，在最终混合(A)液和(B)液时，是生理性相容的水性介质。生理性相容是指在将关节治疗剂注入到关节腔内时，水性介质自身不好的作用或副作用不会成为例如组织的膨润或收缩、炎症等的原因。生理性相容的水性介质通常是选自如下1种以上的低分子量物质的水溶液碱金属或碱土金属的氯化物、硫酸盐、磷酸盐或重碳酸盐之类的无机盐类，例如氯化钠、硫酸钠、氯化镁以及对应的钾、钙盐、乳酸钠、醋酸钠之类的有机酸盐；或者葡萄糖、甘露糖、多元醇之类的中性有机物质，例如，甘油、甘露醇等。低分子量成分的种类和量，考虑到最终混合(A)液和(B)液时，所形成的生理性相容的浸透压、pH、离子含量而进行选择。
缓冲至pH为4.5-6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的(A)液的缓冲成分，可由能缓冲为指定pH的生理性相容成分进行任意选择。例如有机酸盐较为适合，例如乙酸-乙酸钠、乳酸-乳酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠。透明质酸自身也是具有羧基的高分子电解质，也可有效利用透明质酸自身所具有的缓冲性。
具有将与(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8的范围内的缓冲能的水溶液的(B)液的缓冲成分，考虑到最终混合(A)液和(B)液时，所形成的生理性相容的浸透压、pH、离子含量的基础上，可从认可用作医药品添加物的物质中进行任意选择。例如在(A)液的缓冲成分是乙酸-乙酸钠时，如选择氢氧化钠作为(B)液的缓冲成分，在最终混合(A)液和(B)液时，生成乙酸钠。
具有将与(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8范围内的缓冲能的水溶液的(B)液是溶解了透明质酸的水溶液的情况下，还必须考虑到透明质酸本身是不稳定的物质。即使透明质酸以钠盐形式制成制剂被应用，但是透明质酸钠本身在水溶液的状态时也缺乏稳定性。透明质酸具有分子量越大，稳定性越差的性质。透明质酸钠的溶液是其稳定性受到pH的影响，在中性附近是比较稳定。为此，在该情况下，最好也将(B)液自身的pH控制在8.0以下，通过缓冲成分的浓度对缓冲能进行调整。作为将pH调整到8.0以下的缓冲成分，可用例如磷酸缓冲成分、硼酸缓冲成分、碳酸缓冲成分、有机物质缓冲成分。溶解的透明质酸的浓度，从作为关节治疗剂的有效性来看，最好是在0.5-2.0质量％的范围内。
在(A)液和溶解了透明质酸时的(B)液中都可添加可提高透明质酸自身稳定性的稳定剂。提高透明质酸自身稳定性的稳定剂，被记载在例如日本特许公开公报平8-104642号、日本特许公开公报平10-212303号、日本特许公开公报平11-302197号中。
因为稳定剂本身不受pH的限制，所以适合用例如含碘的还原剂或含硫的还原剂。透明质酸自身的稳定性有时受铁等重金属离子的影响较大，所以添加磷酸等的金属的惰性剂也是有效的。
下面对本发明的分离型医疗材料的实际的保存形态进行说明。
在将(A)液和(B)液分离进行保存的实际状态时，(A)液作为将透明质酸的酯衍生物破碎后分散在特定的水性介质中而成的悬浮液被填充在容器中。(B)液，为了不在保存时与(A)液混合，填充在另外的容器中或者同一容器内的不同隔断区域内。在作为医药品和医疗材料提供产品时，通常提供填充在注射器中的产品。例如两液分离型的预充式注射器等一致，最好利用这样的保存容器分别封入(A)液和(B)液。因此，通常液用注射器的突起部分的位置、橡胶栓位置等根据(A)液和(B)的封入量和容积比进行最佳位置的调整。为了提高(A)液和(B)液的混合性，可用装有静态搅拌器等的容器。
静态搅拌器可装配在两液分离型的预充式注射器的注射器的前端，也可装配在分别(A)液和(B)液进行填充的2个注射器的前端的混合部分。
在用于本发明的根据治疗用的医疗材料中还可含有医药品或医药性可相容的润滑剂。作为医药品，可添加麻醉剂、抗生素、类固醇性和非类固醇性的消炎药剂、生长抑素等荷尔蒙类的消炎药剂、表皮亲和性的维他命、IL-1和IL-6等的细胞素、细胞素受体、FGF等的增殖因子、抗风湿病药剂、抗过敏药剂、免疫抑制剂等医药上适合的活性药剂。
作为润滑剂，可适合用磷脂质。用于本发明的磷脂质，可用不管来源的物质，例如可用从动物组织提取的磷脂质，或者也可用人工合成而制得的磷脂质。磷脂质较好含有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘髓磷脂及其衍生物。特好是α-二棕榈酰基磷脂酰胆碱(α-DPPC)。该α-DPPC也可以是L体、D体或外消旋(DL)体混合物。
用于本发明的磷脂质的浓度较好为1-200mg/ml。若磷脂质浓度未满1mg/ml时，作为关节用医药品的效果低，若超过200mg/ml时，磷脂质的凝集增强，保存困难，操作变难，不理想。磷脂质由于是两亲媒性物质，为了保证透明质酸溶液中的稳定性等，可以进行核糖体化，但也可以不特别进行核糖体化，只使其悬浮。
用于本发明的关节治疗用的医疗材料中所添加的医药品或者可医药性相容的润滑剂，根据医药品或润滑剂的物理化学上的性质或者添加目的，可添加在(A)液或(B)液中的任意一种液体中，或者添加在两液中，可任意选择添加方式。同样也可添加在(A)液中的透明质酸的酯衍生物的分散粒子内，或者添加在分散介质中，或者添加到两者中进行任意添加。为了保持添加医药品的关节腔内的浓度一定，即在保持DDS效果的制剂设计时，在透明质酸的酯衍生物的分散粒子内最好添加所需的医药品或润滑剂。
作为本发明的分离型医疗材料提供的形态是填充在注射器的关节注入型医疗材料。
实施例以下，通过实施例对本发明进行更加详细说明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1通过冻结和解冻法进行透明质酸凝胶的制造的例子。
将透明质酸钠(电气化学工业会社制造分子量2×106道尔顿)溶解在蒸馏水中，调制成1质量％的透明质酸的水溶液。用1mol/l盐酸(和光纯药)将该水溶液的pH调整到pH为1.5。将15ml的透明质酸的酸性水溶液放入30ml的玻璃瓶中，并将其放入设定为-20℃的冷冻箱中。放置65小时后，在25℃下解冻。其结果是制得海绵状的透明质酸凝胶。
将该凝胶多次浸渍在100mmol/l的磷酸缓冲液(pH为6.8)，充分中和凝胶。然后用搅拌器将所得的海绵状的透明质酸凝胶打碎，制得凝胶破碎悬浮液。在3,000rpm、5分钟的条件下对其进行离心分离，分离凝胶成分，对该凝胶成分添加新的缓冲液，并重复5次这样的操作，将凝胶溶剂置换为5mmol/l磷酸缓冲生理食盐水。
通过以上方法制得以酸性冻结和解冻法制得的透明质酸凝胶悬浮液。
利用酸混合法制得透明质酸凝胶的制造例。
取出透明质酸钠(电气化学工业会社制造，分子量为2×106道尔顿)的粉末5g量，添加冰冷而成的15ml的1N硝酸(和光纯药)到该粉末中。在烧杯内将两者进行充分混合后，以放入乙烯基塑料袋的状态放入4℃的冷冻箱内，放置65小时。其结果是制得海绵状的透明质酸凝胶。将该凝胶多次浸渍在100mmol/l的磷酸缓冲液(pH为6.8)，充分中和凝胶。然后用搅拌器将所得的海绵状的透明质酸凝胶打碎，制得凝胶破碎悬浮液。在3,000rpm、5分钟的条件下对其进行离心分离，分离凝胶成分，对该凝胶成分添加新的缓冲液，并重复5次这样的操作，将凝胶溶剂置换为5mmol/l磷酸缓冲生理食盐水。利用以上方法，以酸混合法制得透明质酸凝胶悬浮液。
用下面的加速试验对由以上方法制得的透明质酸凝胶的pH稳定性进行评价。在评价中，采用了凝胶悬浮液，该凝胶悬浮液是将悬浮于pH4、pH5、pH6、pH7的乙酸缓冲生理食盐水和磷酸缓冲生理食盐水的透明质酸浓度调整为1质量％。
将10ml的凝胶悬浮液放入15ml的塑料试管内，将其放置在60℃的温浴上，每隔2小时后进行取样。对于取样液，首先以12,000rpm、5分钟的离心条件除去凝胶成分，其后以0.22μ的过滤器进行过滤，完全将凝胶除去。对此进行GPC分析和比色分析，求出透明质酸浓度。该上清液中的透明质酸浓度是溶解有凝胶的浓度，所以从与初始浓度的比来求出残留的凝胶的比例和溶解有凝胶的比例(两者的和相当于100％)。通过以上方法调查各取样时间的残留的凝胶的比例。其结果显示在表1中。
表1
从表1可知溶解后25小时，调整到pH为7的凝胶悬浮液的凝胶残留率为75％，调整到pH为6的凝胶悬浮液的残留率为84％，而将pH调整到4的凝胶悬浮液的残留率为88％。另外，pH为5时，有95％的凝胶残留，pH为5的附近的低pH一侧，凝胶具有保存稳定性。
实施例2
将透明质酸钠(电气化学工业会社制造分子量2×106道尔顿)溶解在蒸馏水中，调制成1质量％的透明质酸的水溶液。用1mol/l盐酸(和光纯药)将该水溶液的pH调整到pH为1.5。将100ml的透明质酸的酸性水溶液放入200ml的玻璃瓶中，并将其放入设定为-20℃的冷冻箱中。放置14天后，在25℃下解冻。其结果是制得海绵状的透明质酸凝胶。
将该凝胶多次浸渍在100mmol/l的磷酸缓冲液(pH为6.8)，充分中和凝胶。然后用搅拌器将所得的海绵状的透明质酸凝胶打碎，制得凝胶破碎悬浮液在3,000rpm、5分钟的条件下对其进行离心分离，分离凝胶成分，给凝胶成分提供1升的蒸馏水，搅拌下洗净。重复5次进行凝胶成分的分离和洗净，完全除去中和剂的磷酸缓冲成分。用生理的食盐水将透明质酸浓度调整到5质量％，添加盐酸将其的pH调整到5.0，形成(A)液。调制0.01N的氢氧化钠水溶液，作为(B)液。
在10ml的pH调整为上述的5.0的(A)液中添加1.6ml的上述(B)液，充分混合。混合后的水溶液的pH为7.4。
实施例3将透明质酸钠(电气化学工业会社制造分子量2×106道尔顿)溶解在以20mM的磷酸缓冲液将pH缓冲到8.0的生理的食盐水中，作为(B)液。在2.0ml的实施例2制得的(A)液中添加8.0ml的上述调制好的(B)液，并进行充分混合。混合后的水溶液的pH为7.4。
实施例4将透明质酸钠(电气化学工业会社制造分子量2×106道尔顿)溶解在以20mM的硼酸缓冲液将pH缓冲到8.0的生理的食盐水中，作为(B)液。在2.0ml的实施例2制得的(A)液中添加8.0ml的上述调制好的(B)液，并进行充分混合。混合后的水溶液的pH为7.4。
实施例5通过冻结和解冻法制造含透明质酸凝胶的分离型医疗材料的制造例。
将透明质酸钠(电气化学工业会社制造分子量2×106道尔顿)溶解在蒸馏水中，调制成1质量％的透明质酸的水溶液。用1mol/l盐酸(和光纯药)将该水溶液的pH调整到pH为1.5。将15ml的透明质酸的酸性水溶液放入30ml的玻璃瓶中，并将其放入设定为-20℃的冷冻箱中。
放置65小时后，在25℃下解冻。制得海绵状的透明质酸凝胶。将该凝胶多次浸渍在100mmol/l的磷酸缓冲液(pH为6.8)，充分中和凝胶。
然后，用杯状混合机(12,000rmp，2分钟)将制得的海绵状的透明质酸凝胶破碎，制得凝胶破碎悬浮液。在3,000rpm、5分钟的条件下对其进行离心分离，分离凝胶成分。对该凝胶成分添加新的缓冲液，重复5次这样的操作，将凝胶溶剂置换为pH为5的5mmol/l乙酸缓冲生理食盐水。
将悬浮于乙酸缓冲生理食盐水形成2质量％的浓度的透明质酸凝胶悬浮液(pH为5.0)的(A)液，以及溶解于磷酸缓冲生理食盐水(pH7.5)形成1质量％的浓度的透明质酸(电气化学工业会社制造)溶液的(B)液，以(A)∶(B)＝2∶8分别填充到トツプ公司的预充式注射器(G类)。即，如图1所示那样，将0.6ml的(A)液的透明质酸凝胶悬浮液填充在注射口侧的隔离区(A)内，将2.4ml的(B)液的透明质酸溶液填充在柱塞杆一侧的隔离区(B)内。
实施例6利用酸混合法制得含透明质酸凝胶的分离型医疗材料的制造例。
取出透明质酸钠(电气化学工业会社制造，分子量为2×106道尔顿)的粉末5g量，添加预先经过冰冷的15ml的1mol/l硝酸(和光纯药)到该粉末中。在烧杯内将两者进行充分混合后，以放入乙烯基塑料袋的状态放入4℃的冷冻箱内，放置65小时。其结果是制得海绵状的透明质酸凝胶。将该凝胶多次浸渍在100mmol/l的磷酸缓冲液(pH为6.8)，充分中和凝胶。
然后用杯状混合机(12,000rpm、2分钟)将制得的海绵状的透明质酸凝胶破碎，制得凝胶破碎悬浮液。在3,000rpm、5分钟的条件下对其进行离心分离，分离凝胶成分。对该凝胶成分添加新的缓冲液，重复5次这样的操作，将凝胶溶剂置换为pH为5的5mmol/l乙酸缓冲生理食盐水。
将悬浮于乙酸缓冲生理食盐水形成2质量％的浓度的透明质酸凝胶悬浮液(pH为5.0)的(A)液，以及溶解于磷酸缓冲生理食盐水(pH7.5)形成1质量％的浓度的透明质酸(电气化学工业会社制造)溶液的(B)液，以(A)∶(B)＝2∶8分别填充到トツプ公司的预充式注射器(G类)。即，如图1所示那样，将0.6ml的(A)液的透明质酸凝胶悬浮液填充在注射口侧的隔离区(A)内，将2.4ml的(B)液的透明质酸溶液填充在柱塞杆一侧的隔离区(B)内。
比较例1非分离型的透明质酸和透明质酸凝胶的混合医疗材料的调制将悬浮于乙酸缓冲生理食盐水形成2质量％的浓度的透明质酸凝胶悬浮液(pH为5.0)的(A)液，以及溶解于磷酸缓冲生理食盐水(pH7.5)形成1质量％的浓度的透明质酸(电气化学工业会社制造)溶液的(B)液，以(A)∶(B)＝2∶8进行混合后，注入テルモ公司的注射器(SS-02S2138)中。
实施例7透明质酸制剂中的透明质酸凝胶稳定性将实施例2和比较例1调制好的注射器保存在60℃的恒温槽内。在各个时间段后取出，进行采样。首先以12,000rpm、5分钟的离心条件除去取样液的凝胶成分，其后以0.22μ的过滤器进行过滤，完全将凝胶除去。对此进行GPC分析和比色分析，求出透明质酸浓度。该上清液中的透明质酸浓度，因溶解了凝胶的浓度部分增加，所以从与初始浓度的比来求出残留的凝胶的比例和溶解有凝胶的比例(两者的和相当于100％)。通过以上方法调查各取样时间的残留的凝胶的比例。其结果显示在表2中。
表2
从表2可知在60℃下保存，25小时后的、均匀混合的比较例1中，凝胶只残留开始时的64％，对此，实施例1的分离状态的凝胶残留率是开始时的94％，特别高。为此，分离保存可提高凝胶的稳定性。
实施例8透明质酸制剂在活体内的贮留性为了评价作为膝关节制剂的有效性，对实施例5制得的透明质酸凝胶和透明质酸溶液的分离型医疗材料在兔子膝关节内的贮留性进行了试验。试验以如下顺序进行在3个月大的兔子(KbsNZW雄)的左膝注射0.25ml的透明质酸凝胶和透明质酸溶液的混合液(透明质酸凝胶悬浮液∶透明质酸溶液＝2∶8)。给药1天和3天后，向耳静脉内注射戊巴比妥钠对该动物进行麻醉后，放血使其致死。其后切断注射了透明质酸的一条腿，从背面切开膝关节，用生理食盐水对腔内进行清洗，回收膝关节腔内的贮留液。对没有注射透明质酸的那一条腿也同样回收。将所得的关节腔内的贮留液的pH调整到碱性一侧，完全分解残留的透明质酸凝胶后，用GPC分析对全部的透明质酸的量进行定量。以从没有注射透明质酸的那一个膝盖回收的贮留液的透明质酸量进行空白补正，得到给药1天和3天后的透明质酸的回收率。
其结果是给药后经过1天的透明质酸的回收率为80％，给药后经过3天后的透明质酸的回收率为50％。
因此可知给药后经过1天和3天后，分别注射入关节腔内的透明质酸有残留，显示了关节制剂的有用性。
工业上利用的可能性通过本发明，在将弱酸性的透明质酸的酯衍生物的分散水溶液及其中和剂溶液、还包括中和剂溶液中溶解有透明质酸的情况下，以分离状态进行保存，形成两者具有不同pH的条件，就能形成保存稳定性好的状态。
可提供预先以分离的状态进行保存，在治疗时进行混合，最终可在生理的中性pH条件下进行给药的制剂。
通过本发明可保证透明质酸的酯衍生物的保存稳定性并同时避免关节治疗剂注射时的刺激性和疼痛，提供透明质酸的酯衍生物作为关节治疗剂。
权利要求
1.分离型医疗材料，其特征在于，它由缓冲至pH为4.5-6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的(A)液，以及具有将与该(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8范围内的缓冲能的水溶液的(B)液构成，(A)液和(B)液在给药时混合投入，但给药前以分离的状态进行保存。
2.根据权利要求1所述的分离型医疗材料，其特征在于，(A)液的透明质酸酯衍生物是自交联的透明质酸。
3.根据权利要求1或2所述的分离型医疗材料，其特征在于，(A)液的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的透明质酸酯衍生物的浓度在1-20质量％的范围内。
4.根据权利要求1、2或3所述的分离型医疗材料，其特征在于，具有将与(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8的范围内的缓冲能的水溶液的(B)液是溶解了透明质酸的水溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，还含有医药品或可医药性相容的润滑剂。
6.根据权利要求5所述的分离型医疗材料，其特征在于，在缓冲至pH为4.5-6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液的(A)液中溶解或分散有医药品或可医药性相容的润滑剂。
7.根据权利要求5或6所述的分离型医疗材料，其特征在于，在(A)液的透明质酸酯衍生物中溶解或分散有医药品或可医药性相容的润滑剂。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，在具有将与(A)液混合时的pH控制在6.8-7.8范围内的缓冲能的水溶液的(B)液中，溶解或分散有医药品或可医药性相容的润滑剂。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，可医药性相容的润滑剂是磷脂质。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离型医疗材料，其特征在于，它是在注射器以分离的状态填充(A)液和(B)液的关节注入型医疗材料。
11.关节疾病用的医疗材料的给药方法，其特征在于，在将要给药前，将构成权利要求1-10中任一项的分离型医疗材料的(A)液和(B)液混合成混合液，并将该混合液注入患者的关节，实施给药。
全文摘要
本发明提供一种含有透明质酸酯衍生物的分离型医疗材料，它具有好的透明质酸酯衍生物的保存稳定性，能避免注射关节治疗剂时的刺激性和疼痛。它是以(A)液和(B)液分离的状态进行保存的分离型医疗材料，上述的(A)液是缓冲至pH为4.5－6.5的含有透明质酸酯衍生物的水溶液；上述的(B)液是具有将与该(A)液混合时的pH控制在6.8－7.8范围内的缓冲能的水溶液。
文档编号A61K31/728GK1649604SQ0282946
公开日2005年8月3日 申请日期2002年8月16日 优先权日2002年8月16日
发明者宫田喜明, 姬田康一, 桥本正道, 梅田俊彦, 三好照三 申请人:电气化学工业株式会社