专利名称：含有转录dna结合位点的环状哑铃状诱饵寡脱氧核苷酸(cdodn)的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗领域，具体而言，涉及新的诱饵寡脱氧核苷酸及其用途。
背景技术：
用于降低转录因子的反式活性(trans-activity)的双链寡脱氧核苷酸(ODN或“诱饵”)是基因治疗和对基因产物进行功能性研究的新的有吸引力的策略。一些不同的双链DNA结构，包括未修饰的寡核苷酸双链体、ab-anomeric oligonucleotide、硫代磷酸酯寡核苷酸双链体、和哑铃状寡核苷酸，已经被引入作为转录因子的诱饵(见Scholer HR和Gruss P.，Cell1984；36403-411；Cereghini S等，Genes Dev 1988；2957-974；BerkowitzLA等，Mol Cell Biol 1989；94272-4281；Tanaka H等，Nucleic Acids Res1994；223069-3074；Bielinska A等，Science 1990250997-1000；CluselC等，Nucleic Acids Res 1993213405-3411Lim CS等，NucleicAcids Res1997；25575-581；Hosoya T等，FEBS Lett 1999461136-140；Mann MJ和Dzau VJ J.Clin.Invest.20001061071-1075)。
转染双链顺式元件诱饵ODN引起转录激活因子与同一序列的内源性顺式元件隔离，继而抑制基因表达(见Bielinska A等，1990见上；Morishita R等1998见上；以及Sawa Y，Morishita R，Suzuki K.，Circulation1997；96II-280-11-285)。
此外，已经发现，施用抗NF-KB，c-myb，c-myc，cdc2，cdk2，E2F和CRE的反义或诱饵寡核苷酸，可分别降低恶病质(cachexia)(Kawamura I等，Gene Ther.1999691-97)、实验性再狭窄的体外细胞增殖和内膜增厚(intimal thickening)(见Simons M等，Nature 1992；35967-73；MorishitaR等，J Clin Invest 1994931458-1464Morishita R等，Proc Natl Acad SciUSA 1993908474-8478Morishita R等，1995见上Morishita R等，NatMed 1997；3894-899Kaneda Y和Morishita R，Jpn J Clin Pathol 19974599-105Tomita等，Am.J.Physiol.1998；275F278-F284；Maeshima Y等，J.Clin.Invest.19981012589-2597；Akimoto M等，Exp Eye Res.199867395-401；Mann MJ等，Lancet，19993541493-1498；Mann和Dzau 2000见上Kawauchi M等，Circ.Res.2000871063-1068；Mangi AA和DzauVJ，Ann Med 200133153-155；Ehsan A等，J Thorac Cardiovasc Surg2001；121714-722；Kawauchi M等，Transplant.Proc.200133451McCarthy M，Lancet，20013581703)、抑制增殖性胆管炎(Yoshida M等，J.Surg.Res.200210295-101)以及降低肿瘤生长并在癌症模型中诱导凋亡(Park YG等，J.Biol.Chem.19992741573-80Cho-Chung YS等，Mol.Cell.Biochem.200021229-34Alper O等，Mol.Cell.Biochem.200121855-63)。
未修饰的寡核苷酸ODN的主要局限性在于易于被血清和细胞中的核酸酶降解。为解决此问题，研发了带有例如硫代磷酸酯和甲基磷酸酯的修饰的连键的寡核苷酸。不过，这些修饰的ODN存在一些问题，例如RNase H不敏感、水解的修饰的核苷酸可能进入细胞DNA、缺乏基于ODN的基因治疗的序列特异性结合效应、以及免疫活化(见Moon IJ等，J BiolChem.20002754647-4653；Hosoya T等，FEBS Letters 1999461136-140；Khaled Z等，Nucleic Acids Res 1996；24737-775Gao WY等，Mol Pharmacol 1992；41223-229；Brown DA等，J Biol Chem 1994；26926801-26805；和Burgess TL等，Proc Natl Acad Sci USA 1995924051-4055)。
最近，诱饵已经被提议用于治疗与转录因子相关的疾病或病症，包括新内膜形成。新内膜形成源自血管平滑肌细胞(VSMC)的过度增殖及其自中膜向内膜的迁移，这些是发生动脉硬化和再狭窄的重要步骤，而再狭窄是经皮腔内冠状动脉血管成形术(percutaneous transluminalcoronary angioplasty，PTCA)后的常见问题(见Currier JW，和Faxon DP.，J Am Coll Cardiol 199525516-520；Clowes AW等，Lab Invest 198349208-215；Liu MW等，Circulation 1989791374-1387；Ross R.，Nature.1990362801-809；以及Pauletto P等，Clin Sci.199487467-479)。
已经有一些试验来研究用药物制剂降低PTCA后再狭窄的发生率和速度，但结果并不满意。在过去的10年中，集中于抑制VSMC增殖的反基因治疗(anti-gene therapy)已经成为一种降低PTCA后再狭窄的潜在的有吸引力的策略(见Simons M等，Nature 199235967-73；Morishita R等，J Clin Invest 1994931458-1464Morishita R等，Proc Natl Acad SciUSA 1993908474-8478；Morishita R等，Proc Natl Acad Sci USA 1995925855-5859Morishita R等，Nat Med 19973894-899；Morishita R等，Pharm.Ther.200191105-114，Motokuni A等，Nippon Rinsho 20015943-52)。
既往的研究已经发现，细胞外信号调节激酶(ERK)以及c-Jun氨基端激酶(JNK)，两者均属于有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族，在球囊损伤后迅速发生瞬时活化(见Ohashi N等，Arterioscler ThrombVasc Biol.2000202521-2526；Koyama H等，Circ Res.199882713-721；Hu Y等，Arterioscler Thromb Vasc Biol.1997；172808-2816以及PylesJM等，Circ Res.199781904-910)。
发生球囊损伤后受损血管壁内的ERK2和JNK1活性迅速升高，并在损伤后5分钟达到高水平。曾观察到ERK2激酶活性在发生损伤随后的7天的动脉壁以及随后的14天的新内膜内存在持续的升高(Hu Y等，1997见上；和Izumi Y等，Circ Res.2001；881120-1126)。
已知JNK和ERK将转移到细胞核内，并激活c-Jun和c-Fos，后两者经二聚体化形成转录因子复合体AP-1。AP-1与大量基因所具有的特异性DNA结合，这些基因涉及多种范围的细胞增殖反应例如细胞外基质产生(见Karin M.，J Biol Chem.199527016483-16486；以及Whitmarch AJ和Davis RJ.，J Mol Med.199674589-607)、凋亡(Le-Niculescu H等，Mol.Cell.Biol.199919751-763；Taimor G等，FASEB J.2001152518-2520)、血管重塑(Morishita R等，Biochem Biophys Res Commun1998243361-367Lauth M.等，J Mol Med 200078441-450；Wagner AH等，Mol.Pharm.2000581333-1340；Cattaruzza M.等，J.Biol.Chem.200127636999-37003)、COX-2介导的炎症(Adderley，SR和Fitzgerald DJ，J.Biol.Chem 19992745038-5046；von Knethen A等，Mol.Biol.Cell 199910361-372；von Knethen A等，J.Immunology 19991632858-2866；Subbaramaiah K等，J.Biol.Chem.200127612449-12448)以及产生1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)(Ahn JD.等，Diabetologia 200144713-720)、TGF-β(Jin G和Howe PH，J.Biol.Chem.199727226620-26626)和IL-6(Viedt C等，FASEB J 2000142370-2372)。
这些结果提示AP-1结合可能参与了应答于血管损伤的血管平滑肌细胞的增殖。不过，尚不知道抑制AP-1结合是否会预防新内膜形成。
近来的报道还显示，可与细胞周期蛋白A、cdk2和pRB形成复合体并激活和磷酸化这些细胞周期调节基因的转录因子E2F，对于细胞生长和增殖过程是至关重要的(见Pagano M等EMBO J 199211961-971Pardee AB.Proc Natl Acad Sci USA 1974711286-1290；Weintraub SJ等Nature 1992；358259-261Pagano MG等Science 1992；2551144-1147；以及Rosenblatt J等Proc Natl Acad Sci USA 1992892824-2828)。
转录因子核因子-κB(NFκB)在协调一些细胞因子和粘附分子基因的反式激活中起到了关键的作用，而这些基因可能参与了缺血和再灌注后的心肌损伤。特异于NFκB的诱饵已经被用于体内结合这些转录因子并阻断介导心肌梗死的基因的激活，因此可为心肌梗死提供有效的治疗(Morishita R.等，Nat Med 1997 Aug；3(8)894-9)。
尽管已经成功使用诱饵以治疗一些与转录因子相关的疾病和病症，但上述未修饰的寡核苷酸ODN的主要局限性，即易于被血清和细胞内的核酸酶降解，显著降低了诱饵在治疗和预防此类疾病和病症中的效力。
为了克服这些局限性，在体外研究中，通过用酶连接两个相同的分子开发出共价闭合的ODN，以避免核酸外切酶的活性。环状哑铃状寡核苷酸是通过采用酶性连接将3′和5′接合以使得寡核苷酸环化而制备的，并具有非毒性的未修饰的主链，类似于天然DNA，其增加了对核酸外切酶的稳定性，与化学修饰的线性寡核苷酸相比，环状哑铃状寡核苷酸被细胞摄入增加(见Chu BCF和Orgal L.，Nucleic Acids Res.1992205857-5858；以及Abe T等，FEBS Lett.199842591-96)。
不过，尚无报道显示此类共价闭合的ODN或环状哑铃状寡核苷酸可有效用于治疗或预防疾病或病症。
本发明要解决的问题因此，本发明的一个目的是提供用于治疗和预防与转录因子相关的疾病和病症的更为有效的手段(means)。
进一步地，本发明的一个目的是提供用于转染VSMC的手段，例如含有转录因子如AP-1的结合位点的诱饵ODN，所述手段能够使得诱饵有效结合AP-1，防止与细胞增殖反应相关的必需基因的反式激活，并由此抑制新内膜形成。
因此，本发明的另一个目的是提供具有环状哑铃状结构(CDODN)的新的AP-1诱饵ODN，以阐明AP-1活化在球囊损伤种的作用。具有环状哑铃状结构(CDODN)的AP-1诱饵ODN可使用日本血凝病毒(hemagglutinating virus of Japan，HVJ)-脂质体进行转染。在本发明中，我们评估了CDODN在体外和体内的稳定性和效力。在此，我们证实，AP-1活化在应答于损伤的VSMC增殖中具有至关重要的作用，且在造成球囊损伤之前，以所述的新CDODN转染大鼠动脉，几乎完全预防了球囊损伤的大鼠动脉内的新内膜形成。
本发明的另一个目的是针对血管成形术后再狭窄开发一种新的治疗策略，其包含在进行血管成形术之前、期间或之后，给患者施用有效量的CDODN AP-1诱饵或其他AP-1抑制化合物。
本发明的另一个目的是提供一种新的E2F诱饵，其通过共价闭合两个相同的寡分子而制备，以避免核酸外切酶的消化。我们研究了这种环状哑铃状E2F诱饵(CD-E2F)的稳定性及其对必需的细胞周期调节基因的反式激活的序列特异性抑制作用以及对VSMC增殖和新内膜形成的抑制作用。
本发明的另一个目的是开发一种针对血管成形术后再狭窄的新的治疗策略，其包含在血管成形术之前、期间或之后，给患者施用有效量的CD-E2F诱饵。
发明内容
本发明提供了一种包含两个环结构和一个茎结构的环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其中所述茎结构包含能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。本发明进一步提供了一种包含所述CDODN的药物组合物。所述药物组合物可用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症。本发明还提供了一种用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症的方法，包含给患者施用治疗有效量的一种包含两个环结构和一个茎结构的CDODN，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
优选地，所述转录因子可选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets和CRE。优选地，NF-KB诱饵可包含序列5′-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3′(Seq ID No.9)(NF-KB诱饵)；STAT-1诱饵可包含序列5’-GATCTAGGGATTTCCGGGAAATGAAGCT-3′(Seq.ID No.10)(STAT-1诱饵)；GATA-3诱饵可包含序列5’-AGCTTGAGATAGAGCT-3′(Seq.ID No.11)(GATA-3诱饵)；STAT-5诱饵可包含序列5’-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAAATCTAT-3′(Seq.ID No.12)(STAT-6诱饵)；AP-1诱饵可包含序列5’-AGCTTGTGAGTCAGAAGCT-3′(Seq.ID No.13)或5′-TGACTCA-3′(AP-1诱饵)ets诱饵可包含序列5’-AATTCACCGGAAGTATTCGA-3′(Seq.ID No.14)(Ets诱饵)；CRE诱饵可包含序列5’-TGACGTCA-3′(CRE诱饵)；以及E2F诱饵可包含序列5’-TTTCGCGC-3′(E2F诱饵)。
血管平滑肌细胞过度增殖和新内膜形成是发生动脉硬化和经皮腔内血管成形术后再狭窄的关键步骤。为了显示针对AP-1的CDODN在治疗或预防此疾病或病症中的功效，进行了以下研究以验证我们的假设，即转录因子AP-1在这些过程中具有重要的作用，并开发出一种针对血管成形术后再狭窄的新的治疗策略。总体而言，我们的结果显示，AP-1活化对于介导应答于血管损伤的平滑肌细胞增殖是至关重要的。因此，本发明提供了一种用于预防引起再狭窄的平滑肌细胞增殖的新策略。
我们开发了一种具有环状哑铃状结构(CDODN)的新的AP-1诱饵ODN，其可避免被核酸外切酶破坏。这种新型的AP-1诱饵ODN较硫代磷酸酯线性诱饵ODN(PSODN)更加稳定，在存在核酸外切酶III或血清的情况下温育时，可大大保护其结构的完整性。转染AP-1诱饵ODN强烈抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。AP-1诱饵ODN还抑制高糖以及血清诱导的PCNA和细胞周期蛋白A基因的转录表达。与体外实验结果相一致，采用日本血凝病毒(HVJ)-脂质体方法施用AP-1诱饵ODN在体内完全抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后的新内膜形成。与常规的PSODN相比，CDODN在体外和体内能够更加有效地抑制平滑肌细胞的增殖。与PSODN相比，大约半量的CDODN便足以在体外以及体内取得与之相似的对血管平滑肌细胞的生长抑制作用。此外，出乎预料的是，CDODN结合AP-1的序列特异性较常规的PSODN高10倍以上。
因此，本发明说明，采用更加稳定的针对AP-1的CDODN和高效的HVJ-脂质体输送方法，为预防人类血管成形术后再狭窄提供了一种新的治疗策略。
此外，本发明涉及转录因子E2F，其在参与细胞周期调节的一些基因的反式激活中具有关键的作用。已往的研究的显示，转染相应于E2F结合结构域的顺式元件双链寡脱氧核苷酸(诱饵)，能够抑制损伤血管的血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和新内膜增生。在本研究中，我们开发了具有环状哑铃状结构的新的E2F诱饵(CD-E2F)，并比较了该CD-E2F与常规的硫代磷酸酯化的E2F诱饵(PS-E2F)的效果。我们发现CD-E2F更加稳定，在存在核酸酶或血清的情况下温育时，可大大保护其结构的完整性。与PS-E2F相比，CDE2F更强地抑制高糖以及血清诱导的细胞周期调节基因的转录表达。与PS-E2F相比，转染CD-E2F能够在体内更加有效地抑制VSMC增殖以及新内膜形成。与PS-E2F相比，剂量降低40-50％的CD-E2F便足以取得与之相似的在体外对VSMC的生长抑制作用以及在体内对新内膜形成的抑制作用。此外，出乎预料的是，CD-E2F对E2F的序列特异性较PS-E2F高10倍以上。
总之，我们的结果显示，CD-E2F在抑制VSMC增殖，例如在治疗血管成形术后再狭窄以及研究转录调控方面，是较常规的E2F诱饵更加有价值的基因治疗剂。
解决问题的手段本发明提供了1.一种环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，包含两个环结构和一个茎结构，其中所述茎结构包含一种能够结合一种转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
2.第1项的CDODN，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
3.第1项的CDODN，其包含通过酶性连接而共价连接的两个相同的茎环结构。
4.第1项的CDODN，其不含有任何化学修饰的核苷酸。
5.第1项的CDODN，其茎结构额外包含能够结合两种或更多的转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
6.第1项的CDODN，所述转录因子是AP-1。
7.第6项的CDODN，其中所述能够结合AP-1的DNA结合结构域的核苷酸序列是5′-TGACTCA-3′。
8.第6项的CDODN，其中每一个所述相同的茎环结构具有SEQ ID.NO.3的序列。
9.第6项的CDODN，其茎结构额外包含一种能够结合另一种转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
10.第6项的CDODN，经体外竞争结合分析测定，其具有的AP-1序列特异性比具有SEQ ID.NO.4的序列的硫代磷酸酯化的寡核苷酸高大约5倍。
11.第1项的CDODN，其中所述转录因子是E2F。
12.第11项的CDODN，其中所述能够结合E2F的DNA结合结构域的核苷酸序列是5′-TTTCGCGC-3′。
13.第11项的CDODN，其中每一个所述相同的茎环结构具有SEQID.NO.6的序列。
14.第11项的CDODN，经体外竞争结合分析测定，其具有的E2F序列特异性比具有SEQ ID.NO.7的序列的硫代磷酸酯化的寡核苷酸高大约5倍。
15.第1项的CDODN，其中所述转录因子是NFκB。
16.一种治疗或预防个体的与一种转录因子相关的疾病或病症的方法，其包含给该个体施用治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN，其中所述茎结构包含一种能够结合该转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
17.第16项的方法，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
18.第16项的方法，其中的药用可接受的载体是HVJ-脂质体组合物。
19.第16项的方法，其中所述转录因子是AP-1。
20.第18项的方法，其中所述与转录因子相关的疾病或病症包含个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
21.第19项的方法，其中所述CDODN的量足以预防个体发生再狭窄。
22.第20项的方法，其中所述化合物在血管损伤之前施用。
23.第16项的方法，其中所述转录因子是E2F。
24.第23项的方法，其中所述疾病或病症包含个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
25.第23项的方法，其中所述治疗有效量的CDODN有效预防个体发生再狭窄。
26.第24项的方法，其中所述CDODN在血管损伤之后施用。
27.第16项的方法，其中所述转录因子是NFκB。
28.第16项的方法，其中所述疾病或病症包含炎症性肠病。
29.一种用于治疗或预防个体的与一种转录因子相关的疾病或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN以及药用可接受的载体，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
30.第29项的药物组合物，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
31.第29项的药物组合物，其中所述药用可接受的载体是HVJ-脂质体组合物。
32.第29项的药物组合物，其中所述转录因子是AP-1。
33.第29项的药物组合物，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
34.第29项的药物组合物，其中所述CDODN的量足以预防个体发生再狭窄。
35.第29项的药物组合物，其中所述转录因子是E2F。
36.第35项的药物组合物，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
37.第36项的药物组合物，其中所述治疗有效量的CDODN有效预防个体发生再狭窄。
38.第29项的药物组合物，其中所述转录因子是NFκB。
39.第29项的药物组合物，其中所述疾病或病症包含炎症性肠病。
40.治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN在制备一种用于治疗或预防个体的与一种转录因子相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
41.第40项的用途，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
42.第40项的用途，其中所述药物的形式为HVJ-脂质体组合物。
43.第40项的用途，其中所述转录因子是AP-1。
44.第43项的用途，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
45.第43项的用途，其中所述CDODN的量足以预防个体发生再狭窄。
46.第40项的用途，其中所述转录因子是E2F。
47.第46项的用途，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
48.第40项的用途，其中所述治疗有效量的CDODN有效预防个体发生再狭窄。
49.第40项的用途，其中所述转录因子是NFκB。
50.第46项的用途，其中所述疾病或病症包含炎症性肠病。
在另一方面，本发明进一步提供了一种用于治疗与AP-1相关的疾病或病症的方法，包含给患者施用治疗有效量的一种化合物以及药用可接受的载体，所述化合物能够抑制AP-1对有丝分裂原激活的蛋白激酶基因的反式激活。
此外，本发明提供了一种预防个体在血管损伤后发生血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生的方法，包含给患者施用治疗有效量的一种化合物以及药用可接受的载体，所述化合物能够抑制AP-1对有丝分裂原激活的蛋白激酶基因的反式激活。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可抑制AP-1与所述基因的启动子相结合的能力。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可以是一种抗体或核酸或核酸类似物。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可竞争性抑制AP-1与所述启动子的结合。
在本发明的一个优选实施方案中，所述化合物是一种包含两个环结构和一个茎结构的环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其中所述茎结构包含一种能够结合AP-1的DNA结合结构域的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，CDODN的量可足以预防个体的再狭窄。
在本发明的一个实施方案中，所述药用可接受的载体可以是HVJ-脂质体组合物。
在另一方面，本发明提供了一种用于预防个体在血管损伤后发生血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生的药物组合物，包含一种治疗有效量的一种化合物以及药用可接受的载体，所述化合物能够抑制AP-1对有丝分裂原激活的蛋白激酶基因的反式激活。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可抑制AP-1与所述基因的启动子结合的能力。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可以是抗体或核酸或核酸类似物。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可竞争性抑制AP-1与所述启动子的结合。
在本发明的一个优选实施方案中，所述化合物可以是一种包含两个环结构和一个茎结构的环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其中所述茎结构包含一种核苷酸序列能够结合AP-1的DNA结合结构域。
在本发明的一个实施方案中，CDODN的量可足以预防个体的再狭窄。
在本发明的一个实施方案中，所述药用可接受的载体可以是HVJ-脂质体组合物。
在另一方面，本发明提供了治疗有效量的一种化合物在制备一种用于预防个体在血管损伤后发生血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生的药物中的用途，所述化合物能够抑制AP-1对有丝分裂原激活的蛋白激酶基因的反式激活。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物抑制AP-1与所述基因的启动子结合的能力。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物是抗体或核酸或核酸类似物。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物竞争性抑制AP-1与所述启动子的结合。
图1显示了AP-1诱饵ODN的结构和分子稳定性。[A]AP-1诱饵ODN的结构。CDODN是由两个共价连接的相同的茎环分子产生的。因此，CDODN在其茎区包含两个AP-1结合位点。[B]在存在核酸外切酶III(左侧)、S1核酸酶(左侧)或血清(右侧)的情况下的诱饵ODN的稳定性测试。ExoIII；以核酸外切酶III处理的诱饵ODN，S1；以S1核酸酶处理的诱饵ODN，CS；小牛血清，D；CDODN，P；PSODN，L；连接前的退火形式的CDODN。
图2显示了CDODN对AP-1的DNA结合活性的影响。[A]竞争性分析。在存在不同浓度的未标记寡核苷酸的情况下，标记的探针与AP-1蛋白形成AP-1复合体。[B]以AP-1诱饵ODN转染的VSMC的凝胶迁移分析的典型实例。本实验重复5次。NG；以正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，HG；以高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，诱饵ODN；以100nmol/l AP-1诱饵ODN转染的VSMC，P；PSODN，D；CDODN，M；错配AP-1诱饵ODN。EMSA的结果定量表示为5次独立实验的平均值±SEM。*p＜0.001，相对于NG，_p＜0.01，相对于HG，§p＜0.001，相对于NG+10％血清， 相对于HG+10％血清。
图3显示了CDODN对平滑肌细胞基因表达的影响。[A]细胞在平滑肌细胞内高葡萄糖条件下以诱饵ODN和细胞周期蛋白A启动子的连续缺失或突变构建体进行共转染。*p＜0.001，相对于pCA-266/+205，_p＜0.001，相对于pCA-133/+205。[B]和[C]细胞以诱饵ODN和质粒AP1(PMA)-TALuc(B)或pCA-266/+205(C)进行共转染。诱饵ODN的活性由其下调萤光素酶活性的能力反映。数值为6次独立实验的经标化的β-半乳糖苷酶活性的平均值±SEM。*p＜0.01，相对于NG，_p＜0.01，相对于HG+10％血清，_p＜0.001，相对于HG+10％血清。D，代表性Northern印迹分析。细胞周期蛋白A(上方)和PCNA(下方)的基因表达通过RASMC(左侧)或HVSMC(右侧)的northern印迹测定。
N；以正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，H；以高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，诱饵ODN；以100nmol/l AP-1诱饵ODN转染的VSMC，P；PSODN，D；CDODN，M；错配AP-1诱饵ODN。
图4显示了CDODN在HVSMC(A)和RASMC(B)中对细胞增殖的抑制作用。增殖活性为6次测定的平均值±SEM。CDODN在HVSMC(C)和RASMC(D)中对细胞迁移的作用。计数了滤膜下表面的4个随机选取的高倍(x400)视野的平均细胞数。进行了4次独立实验，每个实验一式三份进行。迁移活性为平均值±SEM。
N；以正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，H；以高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，诱饵ODN；以100nmol/l AP-1诱饵ODN转染的VSMC，P；PSODN，D；CDODN，M；错配AP-1诱饵ODN。*p＜0.01，相对于NG，_p＜0.05，相对于HG+10％血清，_p＜0.01，相对于HG+10％血清。
图5显示了AP-1诱饵ODN对大鼠颈动脉球囊损伤后的新内膜形成的作用。(A)+(B)左侧颈总动脉的荧光显微镜仅用FITC-标记的ODN处理(A)，或以FITC-标记的ODN和HVJ-AVE脂质体处理(B)；(C)-(G)左侧颈总动脉的横切面对照大鼠(C)，球囊损伤后14天(D)，(E)-(G)-球囊损伤后14天采用HVJ-AVE脂质体方法以MODN处理(E)，以PSODN处理(F)，以及以CDODN处理(G)。(H)以含有AP-1诱饵ODN的HVJ-脂质体转染组的左侧颈动脉的内膜/中膜区的平均比值。短棒代表各个实验动物组的球囊损伤后的颈总动脉的新内膜/中膜比(n＝10)。数值为平均值±SEM。*p＜0.01，相对于球囊损伤的动脉，_p＜0.05，相对于PSODN处理的动脉。
图6显示了CDODN处理时间点对损伤的颈动脉的新内膜形成的抑制作用。(A)-(E)左侧颈总动脉的横切面对照大鼠(A)，球囊损伤后14天(B)，以HVJ-AVE脂质体方法的MODN预处理(pre-treatment)(C)，CDODN预处理(D)，CDODN后处理(post-treatment)(E)。(F)以含有AP-1诱饵ODN的HVJ-脂质体转染组的左侧颈动脉的内膜/中膜区的平均比值。短棒代表各个实验动物组的球囊损伤后的颈总动脉的新内膜/中膜比值(n＝10)。数值为平均值±SEM。*p＜0.005，相对于球囊损伤的动脉，_p＜0.01，相对于以CDODN预处理的动脉，_p＜0.01，相对于以CDODN后处理的动脉。
图7A显示了动脉提取物中的AP-1结合活性的分析。以来自损伤后各个指定时间点的颈动脉的细胞的核提取物进行凝胶迁移分析(n＝10)。球囊损伤前(CDODN预处理(Pre-treated CDODN))或后(CDODN后处理(Post-treated CDODN))，将20μl的含有CDODN的HVJ-脂质体复合体与血管腔在室温温育10min。图7B显示了球囊损伤后的大鼠颈动脉内PCNA的表达。对照血管的PCNA染色(1)，球囊损伤的血管(2)，以MODN预处理的动脉(3)，以CDODN预处理的动脉(4)，和以CDODN后处理的动脉(5)。PCNA阳性细胞为棕黑色。所有图均放大400倍。
图8显示了E2F诱饵的结构和分子稳定性。[A]由共价连接的两个相同的茎环组成的E2F诱饵以形成CD-E2F分子的结构。CD-E2F在其茎区域由两个E2F的结合位点组成。[B]诱饵在存在核酸外切酶III(左侧)、S1核酸酶(左侧)、或血清(右侧)的情况下的稳定性。缩写ExoIII；以核酸外切酶III处理的诱饵，S1；以S1核酸酶处理的诱饵，CS；小牛血清，D；CD-E2F，P；PS-E2F，以及L；连接前的退火形式的CD-E2F。
图9显示了CD-E2F对E2F的DNA结合活性的影响。[A]在存在不同浓度的未标记的ODN的情况下，标记的探针与E2F蛋白形成的E2F复合体的量。[B]显示了以E2F诱饵转染的VSMC的凝胶迁移分析的典型实例。实验重复6次。缩写NG；正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)，HG；高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)，诱饵ODN；以100nmol/l E2F诱饵转染的VSMC，P；PS-E2F，D；CD-E2F，和MM-E2F。EMSA结果表示为5次独立实验的平均值±SEM。统计学显著性为*p＜0.001，相对于NG，_p＜0.01，相对于HG+10％血清，_p＜0.05，相对于PS-E2F。
图10显示了CD-E2F对平滑肌细胞的细胞周期相关性基因启动子活性的影响。(A)VSMC在高葡萄糖条件下以诱饵和细胞周期蛋白A启动子的连续缺失或突变构建体进行共转染。统计学显著性为*p＜0.01，相对于pCA-266/+205，_p＜0.01，相对于pCA-133/+205。VSMC以诱饵和质粒pCA-266/+205(B)或[E2F]x4-Luc(C)共转染。诱饵的活性由其下调萤光素酶活性的能力反映。数值表示为对β-半乳糖苷酶活性进行标化后的5次独立实验的平均值±SEM。统计学显著性为*p＜0.01，相对于NG，#p＜0.01，相对于HG+10％血清，##p＜0.05，相对于PS-E2F。
缩写N以正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，H；以高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，诱饵ODN；以100nmol/lE2F诱饵转染的VSMC。P；PS-E2F，DCD-E2F，M；M-E2F。
图11显示了CD-E2F对VSMC基因表达的影响。(A)代表性的Northern印迹分析。RASMC(B和D)或HVSMC(C和E)中细胞周期蛋白A(B和C)和PCNA(D和E)的基因表达以密度计分析定量。
缩写N；以正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，H；以高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，诱饵ODN；以100nmol/lE2F诱饵转染的VSMC，P；PS-E2F，D；CD-E2F，M；M-E2F。数值表示为5次独立实验的平均值±SEM。统计学显著性为*p＜0.01，相对于NG，#p＜0.001，相对于HG+10％血清，##p＜0.05，相对于PS-E2F。
图12显示了CD-E2F对HVSMC(A)和RASMC(B)的细胞增殖的抑制作用。增殖活性为6次测定的平均值±SEM。诱饵转染进入平滑肌细胞。转染后2-3天，以WST细胞计数试剂盒检测细胞增殖指数。统计学显著性为*p＜0.01，相对于NG，#p＜0.01，相对于HG+10％血清，以及##p＜0.05，相对于PS-E2F。
缩写N以正常葡萄糖(5.5mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，H以高葡萄糖(25mmol/l D-葡萄糖)培养的VSMC，诱饵ODN；以100nmol/lE2F诱饵转染的VSMC，P；PS-E2F，D；CD-E2F，M；M-E2F。
图13显示了E2F诱饵对大鼠颈动脉球囊损伤后出现新内膜形成的影响。其显示了仅以FITC-标记的ODN(A)或以FITC-标记的ODN和HVJ-脂质体(B)处理的左侧颈总动脉的荧光显微镜图片。对照大鼠的左侧颈总动脉的横切面(C)，球囊损伤后14天的对照大鼠的左侧颈总动脉的横切面(D)，采用HVJ-脂质体方法以PS-E2F处理的球囊损伤后14天的横切面(E)，以HVJ-脂质体方法和CD-E2F处理(F)，或以HVJ-脂质体方法和M-E2F处理(G)。所示为以含有E2F诱饵的HVJ-脂质体转染组的左侧颈动脉的内膜/中膜区的平均比值(H)。短棒代表各个实验动物组球囊损伤后的颈总动脉的新内膜/中膜比值(n＝10)。数值表示为平均值±SEM，统计学显著性为*p＜0.01，相对于球囊损伤的动脉，#p＜0.05，相对于PS-E2F处理的动脉。原始放大倍数为100X(A和B)以及25X(C-G)。比例尺为200μm。
图14显示了球囊损伤后大鼠颈动脉内PCNA的表达。PCNA染色，对照血管(A)，球囊损伤的血管(B)，以M-E2F处理的动脉(C)。以PS-E2F处理的动脉(D)，以CD-E2F处理的动脉(E)。PCNA阳性细胞为棕黑色。所有图的以200X放大。比例尺代表50μm。
具体实施例方式
应当理解的是，说明书全文中使用的单数形式的冠词(如英文中的″a″、″an″、″the″等；及其在德文中的形式″ein″、″der″、″das″、″die″等；法文中的形式″un″、″une″、″la″、″le″等；其他语言中的冠词、形容词或任何其他的等价形式等)，除非另有说明，均包括其复数形式。还应该理解的是，除非另有说明，这些术语均具有其在本领域中的通用定义。
除非另有说明，实施本发明将采用本领域已知的常规的蛋白质化学、病毒免疫学、分子生物学以及重组DNA技术等方法。这些技术在文献中有详细描述，例如见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)；和F.M.Ausubel等CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates & WileyInterscience New York。
除非另有说明，说明书中的这些术语均采用其在本领域中的相同含义。为方便起见，在此集中了一些说明书、实施例以及所附权利要求书中使用的术语。
术语“动物”在此指哺乳动物。优选地，哺乳动物可以是灵长类，例如人。与此类似，以本发明的方法进行处理的“患者”或“个体”可以是人或非人类动物。优选地，该个体或患者是人。
术语“诱饵”或“诱饵化合物”是指一种化合物，其模拟转录因子例如AP-1或E2F所结合的染色体位点，或模拟由转录因子例如AP-1、E2F等所控制的基因的染色体位点，所述位点与转录调节因子结合(在此称为“靶结合位点”)，由此该化合物与染色体结合位点竞争结合所述转录因子。
在此，“哑铃状诱饵”或“CDODN”是指一种具有一个双链茎区域和两个环结构的环状寡核苷酸。所述茎区域包含一种作为诱饵的序列。优选地，CDODN由两个相同的茎-环结构连接而成。
术语“ED50”是指药物产生其最大反应或效应的50％所需的剂量。术语“LD50”是指药物在其处理群体长达到50％致死所需的剂量。
本发明的化合物(例如诱饵)或组合物的“有效量”，就本发明的方法而言，是指有效治疗或预防与EF-2或AP-1相关的疾病或病症的量。本发明的化合物(例如诱饵)或组合物的“治疗有效量”或“药物学有效量”，就本发明的方法而言，是指足以产生所需的药理学效应(例如减轻、治愈所治疗的疾病或病症或延缓其发病)的量。所施用的量取决于多种因素，包括所治疗的个体或所治疗的疾病或病症，且优选地，该量应当是优化的以便在达到所需的效应同时不产生明显的不良反应。该量可由本领域人员所确定。本发明的化合物或组合物的“有效量”、“治疗有效量”或“药物学有效量”可通过ED50和/或LD50而确定。治疗指数(therapeuticindex)是指治疗效应与毒性效应之间的剂量比，且可由ED50/LD50比表示。药物组合物的治疗指数越高，越能产生优选的效应。为确定ED50和LD50，可采用细胞培养分析和动物实验，由此得到的数据可用于推断人类所用的剂量范围。优选地，本发明产生很小的或不产生毒性效应。该剂量取决于施用形式、个体的敏感性、施用途径等等。
术语“器官”是指两或多种组织层，所述组织层维持一些形式的细胞-细胞和/或细胞-基质的相互作用以形成一种微结构。术语“组织”是指一组或一层相似的特化的细胞，其共同行使某种特殊的功能。
术语“异源的(heterologous)”用于指核酸时，说明该核酸包含两种或更多种亚序列，所述亚序列在天然条件下不存在该相同的关系。例如，所述核酸典型地经重组产生，具有来自无关基因的两种或更多序列以生成一种具有新的功能的核酸。例如，在一个实施方案中，所述核酸具有来自一种基因的启动子以指导来自一种不同基因的编码序列的表达。因此，就该编码序列而言，所述启动子是异源的。
术语“相同性”，就两种核酸或多肽序列而言，是指当两序列的比对达到最大的对应程度时，两序列中相同的残基。当采用序列相同性百分数来描述蛋白或多肽时，已知不相同的残基位置通常是因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸取代，因此分子的功能特性不会改变。如果序列因保守取代而不同，应上调序列相同性百分比以根据取代的保守性质进行校正。用于这种调整的手段是本领域人员已知的。典型地包括将保守取代按照一个部分错配而不是一个完全错配记分，由此增大序列相同性百分比。因此，例如，如果一个相同的氨基酸记为1分而一个非保守取代记为0分，那么保守取代的分值介于0到1之间。对保守取代的记分计算方法是，例如，依照Meyers和Miller，Computer Applic.Biol.Sci.，411-17(1988)的算法，例如运行PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA)程序中的算法。
序列比对的方法是本领域已知的。可通过以下方法进行最佳的序列比对Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)Adv.Appl.Math.2482；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(1970)J.Mol.Biol.48443Pearson和Lipman的相似性搜寻方法(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444；计算机运行这些算法(包括但不限于CLUSTAL in the PC/Geneprogram by Intelligenetics，Mountain View，Calif.，GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wis.，USA)；对CLUSTAL程序的详细描述见Higgins和Sharp(1988)Gene，73237-244以及Higgins和Sharp(1989)CABIOS5151-153；Corpet等(1988)NucleicAcids Research 16，10881-90；Huang等(1992)Computer Applications in theBiosciences 8，155-65，以及Pearson等(1994)Methods in Molecular Biology24，307-31。比对也经常通过目测和人工比对进行。
“严格性杂交洗涤条件”，就核酸杂交实验如Southern和Northern杂交而言，取决于序列，且因不同的环境参数而不同。核酸杂交的详尽描述可参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays″，Elsevier，N.Y.。通常，高严格性杂交和洗涤条件选择为在限定的离子强度和pH下低于特定序列的热熔点(Tm)5℃。Tm是当50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。对于特定的探针，极严格性条件被选择为与Tm相当。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另有说明，该术语涵盖的聚合物序列包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物，包括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤核苷、吖丙啶基胞嘧啶(aziridinylcytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤(N6-isopentenyladenine)、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶(2-thiocytosine)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、和2，6-二氨基嘌呤。
术语“基因”是指一种核酸(如DNA)序列，其包含产生多肽或其前体(例如c-myc)所必需的编码序列。所述多肽可由全长编码序列或该编码序列的任何一部分编码，条件是全长多肽或活性片段的所需活性或功能特性(例如酶活性、信号转导等)得以保留。该术语还涵盖结构基因的编码区域并包括位于与编码区域的5′和3′端邻近的序列，所述序列距编码序列一端大约1kb或1kb以上，如此使得基因相当于全长mRNA的长度。位于编码区域5′并出现在mRNA中的序列被称为5′非翻译序列。位于编码区域3′或下游并出现在mRNA中的序列被称为3′非翻译序列。术语“基因”同时涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式和克隆含有被非编码序列打断的编码区域，所述非编码序列被称为“内含子”和“插入区域”或“插入序列”。内含子是被转录为核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可含有调节元件例如增强子。内含子将自核转录产物或初级转录产物(primary transcript)中去除或剪切掉；因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录产物中。mRNA在限定新生多肽的氨基酸序列或顺序的翻译过程中起作用。
在此，术语“基因表达”是指通过将基因“转录”成RNA(即通过RNA聚合酶的酶作用)而将基因中编码的遗传信息转换为RNA(如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，而对于编码蛋白质的基因来说，是通过mRNA的“翻译”将所述遗传信息转换为蛋白质。可在上述过程的多个主要阶段对基因表达进行调节。“上调”或“激活”是指使得基因表达产物(即RNA或蛋白)的产生增多的调节，而“下调”或“阻抑(repression)”是指使其产生减少的调节。参与上调或下调的分子(例如转录因子)通常分别被称为“激活子”和“阻抑子”。
术语“野生型”是指一种基因或基因产物，其具有该基因或基因产物自其天然存在的来源处被分离出来时特征。野生型基因是群体中最常见的基因，因此将其主观地认定为是该基因的“正常”或“野生型”形式。与此不同，术语“修饰的”或“突变体”是指这样一种基因或基因产物，当其与野生型基因或基因产物相比时，其表现出序列和/或功能特性方面的变化(即改变的特征)。可分离到天然存在的突变体；可通过这些突变体与野生型基因或基因产物相比具有改变的特征这一点而对其进行鉴别。
DNA分子之所以被称为具有“5′端”和“3′端”是因为单核苷酸反应生成寡核苷酸或多核苷酸的方式使得一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸按照一个方向与其相邻的单核苷酸戊糖环的3′氧通过磷酸二酯键相连接。因此，对于寡核苷酸或多核苷酸来说，如果其一端的5′磷酸未与单核苷酸戊糖环的3′氧连接，则所述寡核苷酸或多核苷酸的该端被称为“5′端”，而如果其一端的3′氧未与随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸连接，则所述寡核苷酸或多核苷酸的该端被称为“3′端”。在此，就一种核酸序列而言，既便其位于一种更长的寡核苷酸或多核苷酸内部，其同样被称为具有5′和3′端。在线性或环状DNA分子中，分散的元件被称为是“下游”元件或3′元件的“上游”元件或5′元件。该术语反映的是转录在DNA链上按照从5′至3′的方式进行。指导与之连接的基因的转录的启动子和增强子元件通常位于该编码区域的5′或上游，不过，既便位于所述启动子元件和编码区域的3′，增强子元件同样可发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于所述编码区域的3′或下游。
在此，术语“寡核苷酸”是指长度较短的单链多核苷酸链。寡核苷酸的长度典型地少于100个残基(例如在15到50之间)，不过，在此，该术语也意在涵盖更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常因其长度而得名，例如，24个残基的寡核苷酸被称为“24-体”。寡核苷酸可通过自身杂交或与其他多核苷酸杂交而形成二级或三级结构。此类结构可包括、但不限于，双链体、发夹结构、十字结构、弯曲结构(bends)和三链体。
在此，术语“引物”是指一种寡核苷酸，无论其是天然存在的如纯化的限制酶消化物或人工合成的，当将其置于诱导合成与一种核酸链互补的引物延伸产物的条件下(即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适的温度和pH的条件下)，其可作为合成的起始点。所述引物优选地是单链以便具有最大的扩增功效，但其也可以是双链。如果是双链的，在制备延伸产物之前，需要先处理所述引物以使双链分开。优选地，所述引物是一种寡脱氧核苷酸。所述引物必需具有足够的长度以便能够在存在诱导剂的条件下引发延伸产物的合成。引物的具体的长度将取决于很多因素，包括温度、引物的来源以及所用方法。
术语“分离的”，就核酸而言，如“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”，是指一种核酸序列，该序列是自在天然环境中通常与其相关的至少一种污染核酸中鉴别并分离而得到的。如此看来，分离的核酸以一种不同于其天然发现时的形式或方式而存在。与此不同，未分离的核酸为例如在天然存在状态下被发现的DNA和RNA的核酸。例如，一种特定的DNA序列(例如一种基因)存在于宿主细胞染色体中并在其邻近基因附近；RNA序列，例如一种编码特定蛋白质的特定mRNA序列，与编码多种蛋白质的众多其他mRNA混合在一起存在于细胞中。但是，编码一种特定蛋白质的分离的核酸包括，举例而言，在细胞中通常表达该特定蛋白质的该核酸，其中所述核酸在染色体中的位置不同于其在天然细胞中的位置，或者其两翼的核酸序列不同于其在天然状态下所见的核酸序列。所述分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可为单链或双链形式。当分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表达一种蛋白质时，该寡核苷酸或多核苷酸至少含有有义链或编码链(即所述寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但也可以同时含有有义链和反义链(即所述寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。
在此，术语“探针”是指一种能够与所需的另一种寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即一种核苷酸序列)，无论其是作为纯化的限制性酶消化物而天然出现的还是以合成、重组或通过PCR扩增方式而产生的。探针可以是单链或双链。探针可用于检测、鉴别以及分离特定的基因序列。预期任何用于本发明的探针均可标记任何“报告分子”，因此可由任何检测系统进行检测，这些系统包括但不限于，酶(例如ELISA，以及基于酶的组化分析)、荧光、放射性以及发光系统。无意将本发明限制于任何特定的检测系统或标记。
在此，术语“转录因子”是指相互之间以及与RNA聚合酶相互作用以调节转录的蛋白质。转录因子通过识别特定的DNA调节序列(例如增强子)或其他转录因子而靶向基因。转录因子通常被称为与“顺式元件”(例如增强子)相互作用的“反式因子”，这是因为产生它们的基因典型地位于与其调节位点(cis)相远离的位置(trans)。一些转录因子仅在结合了与其自身相同的另一个转录因子(即通过“同二聚体化结构域”相连接的同二聚体)或结合了其他种类的转录因子(即通过“异二聚体化结构域”相连接的异二聚体)的时候才具有生物学活性。对大多数转录因子来说，蛋白的特异而独特的区域介导了DNA结合(即“tDNA结合结构域”)和转录激活(即“激活结构域”)。基因表达调节的最重要的水平是影响信息自基因向信使RNA分子传递的过程；该过程称为转录。这些蛋白质或转录因子依其作用方式分为4组一般转录因子、激活子、共激活子以及阻抑子。在一些转录因子疾病如Aniridia、Rubinstein-Taybi综合征和霍奇金病中，转录因子参与其中，且在一些疾病中是分子水平的病因，即已经阐明了引起转录因子分子功能异常的突变。术语“AP-1”是指一种转录因子，其结合存在于大量与细胞增殖应答和细胞外基质产生有关的基因中的特异性的DNA序列。“E2F”是指一种转录因子，其对于E1A介导的腺病毒E2启动子的激活是至关重要的。现在已知E2F与分化调节的转录因子DRTF相同，最初发现DRTF是在F9胚胎癌细胞分化过程中被下调的一种转录因子。E2F与细胞周期蛋白A、cdk2和pRB形成复合体，激活并磷酸化这些细胞周期调节基因，对于细胞生长和增殖至关重要。
在此，术语“转录因子相关的疾病或病症”是指这样一种疾病或病症，其与病变累及的细胞或组织内的该转录因子的水平升高或降低有关或与该转录因子的功能不当(增强、修饰或削弱等)有关。优选地，此类疾病包括炎症性疾病(类风湿关节炎、骨关节炎等等)、皮炎(特应性皮炎、银屑病)、动脉瘤、动脉硬化、粥样硬化、脉管炎、PTCA后再狭窄以及PTA、癌症或恶性肿瘤、哮喘等等。通过使用哑铃状诱饵，本发明获得了优于现有技术的显著的效果，例如对核酸酶的抗性以及显著提高了在细胞或组织中的持久作用效果。
在此，“AP-1相关性疾病或病症”是指这样一种疾病或病症，其与病变累及的细胞或组织内的AP-1的水平升高或降低相关，或与由AP-1激活的基因的表达增强相关。优选地，此类疾病与炎症和细胞增殖相关。更优选地，该疾病或病症可以是血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。术语“E2F相关性疾病或病症”是指这样一种疾病或病症，其与病变累及的细胞或组织内的E2F的水平升高相关，或与由E2F激活的基因的表达增强相关。优选地，该疾病或病症可以是血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
在此，术语“具有生物学活性”指的是一种蛋白质或其他分子，其具有一种天然存在的分子在结构方面的、调节方面的或生化方面的功能(例如具有转录活性或对一种基因的特定位点具有结合特异性的分子)。
(ii.优选实施方案详述)本发明提供了一种包含两个环结构和一个茎结构的环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。本发明进一步提供了一种包含所述CDODN的药物组合物。所述药物组合物可用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症。本发明还提供了一种用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症的方法，包含给患者施用治疗有效量的一种包含两个环结构和一个茎结构的CDODN，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。相对于常规的诱饵或诱饵组合物，本发明通过提供一种环状哑铃状诱饵或诱饵组合物，并由此显著提高该诱饵或诱饵组合物在施用于个体后的稳定性，可提高治疗和/或预防与转录因子相关的疾病或病症的功效。
本发明证实，转移AP-1诱饵ODN在体内预防了球囊损伤后VSMC增殖体外和新内膜形成的发生。这些结果说明转录因子AP-1在球囊损伤后VSMC增殖和新内膜形成的过程中具有重要的作用。
越来越多的迹象表明MAP激酶级联的激活是损伤引起的VSMC增殖和细胞生长的关键事件(见Ohashi N等，Arterioscler Thromb Vasc Biol.2000202521-2526；Koyama H等，Circ Res.1998；82713-721；Hu Y等，Arterioscler Thromb Vasc Biol.1997172808-2816；Pyles JM等，CircRes.199781904-910；和Izumi Y等，Circ Res.2001881120-1126)。MAP激酶，例如JNK和ERK，控制了AP-1转录因子的表达和活化(见Davis RJ.，J Biol Chem 199326814553-14556；和Seger R等，FASEB J.19959726-73)。AP-1结合存在于与VSMC增殖应答和细胞外基质产生相关的大量基因中的特异性DNA序列(见Karin M.，J Biol Chem.1995；27016483-16486；和Whitmarch AJ，Davis RJ，J Mol Med.199674589-607)。这些发现提示，AP-1的活化可能是导致新内膜形成的重要一步。但是，证明AP-1在新内膜形成的发生过程中的作用长期以来一直受困于缺乏特异性的和有效的AP-1的药理学抑制剂。为了验证AP-1在VSMC增殖和新内膜形成的发生过程中具有至关重要的作用这一假说，我们采用了一种新的AP-1ODN转染方法。转染双链顺式元件诱饵ODN导致自相同序列的内源性顺式元件中去除了所有反式因子，继而抑制了该基因的表达。因此，本发明首次直接证实了AP-1参与了VSMC增殖和新内膜形成。
在本发明中，我们使用了高葡萄糖和血清作为刺激物以增强VSMC的增殖和迁移。这些刺激物通过MAPK通路诱导很多早期基因、生长因子以及有丝分裂原(见Miano JM等，Arterioscler Thromb.199313211-219Bennett MR等，J Clin Invest.199493820-828；Briata P等，Biochem Biophys Res Commun.19891651123-1129；Inaba T等，Diabetes199645507-512Di Paolo S等，Am J Pathol.1996；1492095-2106；Schwartz SM等，Circ Res.199577445-465；Lindner V等，Circ Res.1991；68106-113)。本发明还证实，高葡萄糖和血清刺激内源性表达细胞周期调节基因细胞周期蛋白A和PCNA，这些对于自G1期至S期的细胞周期进程是必需的。AP-1ODN有效消除了由高葡萄糖和血清引起的VSMC的增殖、迁移和细胞周期蛋白A和PCNA的基因表达。不仅如此，我们采用细胞周期蛋白A启动子的连续缺失或突变构建体得到的结果显示，负责结合转录因子例如AP-1蛋白的ATF(激活转录因子)位点，介导了由高葡萄糖引起的细胞周期蛋白A基因表达的上调。转染携带萤光素酶报告基因的AP-1诱饵ODN构建体而不是错配的ODN，也完全消除了由高葡萄糖和血清诱导的细胞周期蛋白A的萤光素酶表达。这些发现，连同那些转染AP-1诱饵抑制了VSMC增殖和迁移的体外结果，证实抑制VSMC生长和VSMC迁移参与了AP-1诱饵对新内膜形成的抑制作用。
为了转染AP-1诱饵ODN进入大鼠颈动脉，我们采用了HVJ-脂质体技术，该技术是用于将基因转移至未经内皮剥离的完整动脉内的中层VSMC中的一种非常有效的方法。采用HVJ-脂质体方法转染FITC-标记的ODN产生了很强的荧光，在动脉各层均很容易检测到。本发明还证实AP-1ODN可有效预防球囊损伤后的新内膜形成。有趣的是，我们发现，以诱饵ODN进行预处理较后处理更为有效。这可由损伤动脉内AP-1激活的时间过程来解释。以往的研究报道，血管壁内的ERK和JNK活性在球囊血管成形术后迅速升高，并在损伤后5分钟达到平台，且可持续1小时。立即早期基因c-jun和c-fos的表达在球囊损伤后30分钟到达高峰。我们的结果还显示，在球囊损伤后30分钟可检测到AP-1活性，并在3小时后达到最高。这些结果说明，应答于球囊损伤的信号转导很迅速，采取阻断的时间对于阻断由球囊损伤引起的信号的传递很重要。
本发明的重要一点在于，AP-1环状哑铃状诱饵ODN(CDODN)较化学修饰的诱饵ODN更为稳定而有效。CDODN在一条无开放端口的单链诱饵分子中具有两个AP-1结合位点，因而能够多重靶向一个以上的启动子位点。在以往的研究中，修饰的ODN，例如硫代磷酸酯和甲基磷酸酯，被广泛用于增强抵抗核酸酶的稳定性(见Khaled AR等，ClinImmunol Immunopathol 1998；86170-179Larrouy B等，Gene 1992121189-194)。作为抗c-myb、c-myc、cdc2和cdk2的反义分子或作为诱饵的NF-KB和E2F，这些修饰的ODN在实验性再狭窄中减轻了内膜增厚(见Simons M等，J.Clin Invest 1994931458-1464，Morishita R等1993见上，Morishita R等1994见上，Morishita R等1997见上)。但是，这些修饰的ODN具有一些缺陷，例如对RnaseH不敏感、水解厚的修饰的核苷酸可能再循环进入基因组DNA、缺乏序列特异性结合效应、以及免疫激活作用。与近期的报道一致(见Chu BCF等，Nucleic Acids Res.1992205857-5858；和Abe T等，FEBS Lett.199842591-96)，在存在血清、核酸外切酶III和S1核酸酶的情况下，CDODN较PSODN更为稳定。为了评价含有AP-1结合位点的CDODN和PSODN所序列特异性，我们设计了一个体外竞争分析实验。当以非标记的CDODN和PSODN作为竞争剂，CDODN和PSODN均能完全抑制AP-1与标记的探针的结合，但CDODN的序列特异性较PSODN的效应高大约10倍。此外，我们还评价了CDODN和PSODN在VSMC中对高葡萄糖或血清诱导的AP-1的结合活性的抑制效应。CDODN和PSODN均显著减弱AP-1的结合活性，但CDODN的抑制效应更强。这些结果说明，CDODN对AP-1结合蛋白的亲和力较PSODN更高。与这些体外结果一致，CDODN可更有效预防血管损伤后的新内膜形成。哑铃状诱饵ODN的另一个潜在的优点是没有在DNA复制或修复过程中因水解的修饰的核苷酸的再循环而引入基因组DNA的诱变潜力。
总之，本发明证实，与以往所尝试过的修饰的ODN相比，哑铃状诱饵ODN具有显著增高的稳定性。此外，以诱饵ODN抑制AP-1的活性有效降低体外的细胞增殖和迁移以及体内的新内膜形成。本发明提供了一种通过采用CDODN和不良反应极低且高度有效的HVJ-脂质体基因转移技术而用于治疗再狭窄的新的潜在的治疗策略。
在另一方面，本发明提供了一种新的E2F-诱饵。多个研究证实，抑制细胞周期调节基因可成功阻断受损血管内VSMC的增殖和新内膜形成。不过，单独一个细胞周期调节基因的抑制不足以预防VSMC增殖和新内膜形成。因此，我们将注意力集中在转录因子E2F上，其与参与G1/S细胞周期进程的多种基因的表达上调相关，这些基因包括PCNA、c-myc、c-myb、cdc2和cdk2(见Bielinska A等1990见上；Chu BCF，OrgalL.，Nucleic Acids Res.1992；205857-5858；和Abe T等，FEBS Lett.199842591-96)。在本发明中，我们证实，转染E2F诱饵成功地阻断了受损血管中平滑肌细胞的增殖和新内膜增生，这与以往体外和体内研究一致。
在本发明中，我们设计了一种新的环状哑铃状诱饵以增强其抗核酸酶的稳定性。在以往的研究中，以硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、或其他外来材料修饰的ODN被用于增强其抗核酸酶的稳定性(见Tanaka H等，Nucleic Acids Res 1994；223069-3074；Bielinska A等1990见上)。尽管ODN对核酸酶的稳定性通过化学修饰得到增强，但这些修饰的ODN可能引起一些其他的问题，这是因为其采用了外来材料来修饰ODN。最近已经报道，与化学修饰的线性ODN相比，哑铃型ODN可增强对核酸酶的抗性以及被细胞摄入(见Chu BC等，Nucleic Acids Res 1992；205857-5858；Abe T等，FEBS Lett 1998；42591-96)。因此我们设计了一种新的针对E2F结合位点的环状哑铃状诱饵ODN。我们的CD-E2F在一个单独的无开放端口的诱饵分子中具有两个E2F结合位点，因而能够多重靶向一个靶启动子位点或一个以上的启动子位点。正如所预期的，在存在核酸酶和血清的情况下，CD-E2F较PS-E2F更加稳定。此外，经体外竞争结合分析，CD-E2F的序列特异性较PS-E2F高近10倍。不仅如此，CD-E2F对葡萄糖诱导的和血清诱导的VSMC中的E2F结合活性的抑制作用也高于PS-E2F。这些结果说明，CD-E2F具有增强的稳定性以及对E2F结合位点的优越的序列特异性抑制作用。
进行ODN治疗的主要障碍在于，通过常规的脂质体方法输送的ODN难以被细胞摄取，且在被细胞吞噬后会被溶酶体降解(见Marcus-SekureCJ.，Anal Biochem 1988；172289-295；Stein CA，Cohen JS.，癌症Res1988；482659-2668)。为了克服这一障碍，我们采用HVJ-脂质体技术将E2F诱饵转染至大鼠颈动脉。在该输送系统中，外来分子例如质粒DNA或ODN被包被在包含磷脂和胆固醇的脂质体内。脂质体随后与UV灭活的HVJ进行融合以形成HVJ-脂质体。来自HVJ的融合蛋白促进了脂质体与细胞膜的融合以及分子沉积到细胞内。我们最近报道，常规的转染方法相比，采用HVJ-脂质体方法将FITC标记的诱饵转染至培养的VSMC中是非常有效的基因转移(见Ahn JD等，Diabetologia 2001；44713-720)。与此相一致的是，通过HVJ-脂质体方法体内转染FITC-标记的诱饵产生了很强的荧光，在动脉各层均容易检测到。
尽管已经认识到高血糖症是引起糖尿病患者出现大血管并发症的原因，但很少有研究关注葡萄糖浓度升高对VSMC的直接影响(Ahn JD等，2001见上；Natarajan R等，Hypertension 199933378-384；Yasunari K等，Circ Res 1997；81953-962)。在本发明中，我们研究了高浓度的葡萄糖对VSMC的E2F DNA结合活性以及细胞周期调节基因和VSMC增殖的作用。我们的研究发现，以高浓度葡萄糖处理后，VSMC内的E2FDNA结合活性以及在启动子区域含有4个E2F结合位点的[E2F]x4萤光素酶构建体的萤光素酶活性显著升高。血清可加强这种作用。本发明还证实，高葡萄糖和血清刺激内源性表达细胞周期调节基因例如细胞周期蛋白A和PCNA，这些基因对于自G1至S期的细胞周期进程有重要作用。转染E2F诱饵，而不是序列错配的寡核苷酸(M-E2F)，有效减弱了高葡萄糖和血清引起的VSMC增殖以及PCNA的细胞周期蛋白A基因表达，与细胞周期蛋白A启动子研究一致。不仅如此，我们使用细胞周期蛋白A启动子的连续缺失或突变的构建体得到的结果证实，葡萄糖刺激引起的细胞周期蛋白A基因表达的上调是由细胞周期蛋白A启动子内的E2F位点介导的。将萤光素酶报告基因构建体与E2F诱饵而非M-E2F共转染也完全消除了高葡萄糖引起的细胞周期蛋白A启动子控制下的萤光素酶表达。
最后，转染CD-E2F较PS-E2F更有效地预防了球囊损伤后的新内膜形成。还发现，在以CD-E2F处理的血管中，PCNA染色阳性的细胞较PS-E2F处理的血管或未转染的血管少的多。这些发现，连同体外研究的结果，说明CD-E2F可更有效地抑制VSMC生长并预防血管损伤后的新内膜形成。CD-E2F的另一个潜在的治疗益处在于其缺乏突变潜力，而以外来材料修饰的ODN可能具有突变潜力，如果在DNA复制过程中水解的核苷酸被再循环引入基因组DNA。
总之，本发明证实，与常规的修饰的ODN相比，CD-E2F显示出显著增高的稳定性以及优越的序列特异性诱饵效应。此外，以CD-E2F抑制E2F的DNA结合活性在体外和体内显著降低了细胞周期调节基因的表达以及细胞增殖。本发明运用了一种新的CD-E2F和高效的HVJ-脂质体输送技术，这将为预防人类的血管成形术后再狭窄提供一种不良反应极低的新的治疗策略。
因此，本发明的一个优选的实施方案提供了药物组合物，其包含AP-1以及可选择的或额外的E2F诱饵作为活性成分，并任选地包含另一种转录因子(例如NFκB)诱饵，以用于治疗和预防各种AP-1相关性或E2F相关性疾病，并提供了所述治疗和预防的方法。
本发明的治疗性/预防性组合物所针对的疾病是AP-1相关性和E2F-相关性疾病，也就是说由受控于转录调节因子AP-1或E2F的基因的不适当的激活所引起的疾病，优选地，此类疾病包含，但不限于，炎症性疾病(类风湿关节炎、骨关节炎等)、皮炎(特应性皮炎、银屑病等)、动脉瘤、动脉硬化、粥样硬化、脉管炎、PTCA和PTA后再狭窄、癌症或恶性肿瘤、哮喘等等。
AP-1是多种重要基因的关键调节因子，包括参与产生(i)引起组织破坏的酶、(ii)与慢性炎症相关的细胞因子和(iii)细胞增殖所必需的蛋白质的基因。因此，AP-1哑铃状诱饵可以成为治疗慢性炎症性疾病的潜在的强效药物。
E2F转录因子家族在调节细胞增殖中发挥重要作用。因此，本发明提供的E2F诱饵可以成为治疗与异常细胞增殖有关的疾病的潜在的强效药物。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的治疗性/预防性组合物所针对的疾病是NF-KB相关性疾病，也就是说由受控于转录调节因子NF-KB的基因的不适当的激活所引起的疾病，此类疾病可以包括缺血性疾病、炎症性疾病、自身免疫病、癌症转移和侵润、以及恶病质。缺血性疾病包括器官缺血性疾病(例如，缺血性心脏病例如心肌梗死、急性心衰、慢性心衰等，缺血性脑部疾病例如脑梗死，以及缺血性肺部疾病例如肺梗死)，器官移植或器官手术预后恶化(例如心脏移植、心脏手术、肾移植、肾脏手术、肝移植、肝脏手术、骨髓移植、皮肤移植、角膜移植和肺移植的预后恶化)，再灌注疾病以及PTCA后再狭窄。上述炎症性疾病包括多种炎症性疾病，例如肾炎、肝炎、关节炎、急性肾衰、慢性肾衰、和动脉硬化等等。上述自身免疫病包括，但不限于，风湿病、多发性硬化和Hashimoto甲状腺炎。具体而言，以本发明的NF-KB诱饵作为活性成分的药物组合物非常适合用于治疗和预防缺血性疾病中的再灌注损伤、器官移植或器官手术预后恶化、PTCA后再狭窄、癌症转移和侵润、以及恶病质例如癌症引起的体重下降。
任何与转录因子相关的其他疾病均可采用本发明的诱饵进行治疗或预防。此类疾病包括，但不限于E2F-相关性疾病、疾患或病症例如新内膜增生、肿瘤性疾病(neoplasia)、肾小球肾炎、血管形成、炎症；AP-I-相关性疾病、疾患或病症例如新内膜增生、心肌细胞生长/分化；NFκB-相关性疾病、疾患或病症例如炎症、免疫应答、移植排异、缺血再灌注损伤、肾小球肾炎、炎症性肠病；SSRE相关性疾病、疾患或病症例如新内膜增生、搭桥手术、血管形成、侧枝形成(collateral formation)；CREB-相关性疾病、疾患或病症例如cAMP激活事件；MEF-2-相关性疾病、疾患或病症例如心肌细胞分化和生长；CArG box-相关性疾病、疾患或病症例如心肌细胞生长和分化；tax-相关性疾病、疾患或病症例如HTLV感染VP16-相关性疾病、疾患或病症例如疱疹病毒感染TAR/tat相关性疾病、疾患或病症例如HIV感染GRE/HRE MRE-相关性疾病、疾患或病症例如类固醇激素过程(乳腺或前列腺细胞生长)；热休克RE-相关性疾病、疾患或病症例如细胞应激，例如缺血缺氧SRE-相关性疾病、疾患或病症例如细胞增殖/分化AP-2相关性疾病、疾患或病症例如细胞增殖；固醇应答元件-相关性疾病、疾患或病症例如高胆固醇血症；TRE(TGFb应答元件)-相关性疾病、疾患或病症例如细胞生长、分化、迁移、血管形成、内膜反应性增生、基质产生、元件凋亡(element apoptosis)。
具体而言，以本发明的诱饵作为活性成分的药物组合物高度适合用于治疗和预防缺血性疾病中的再灌注损伤、器官移植或器官手术预后恶化、PTCA后再狭窄、癌症转移和侵润以及恶病质例如癌症引起的体重下降。
可用于本发明的诱饵可以是特异性拮抗相应于所述类型的转录因子的染色体结合位点的任何化合物，包括但不限于核酸及其类似物。作为所述诱饵的优选的实例，其可以是所提及的含有核苷酸序列TGACTCA(AP-1)和TTTCGCGC(E2F)(分别为序列表中的SEQ ID NO1和2的5’端的7-13位核苷酸的序列和5’端8-15位核苷酸的序列)、GGGATTTC(NFκB)或其互补序列的寡核苷酸及其突变体，以及含有任何上述寡核苷酸序列的化合物。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA，并可含有修饰的核苷酸和/或假核苷酸。此外，这些寡核苷酸、其变体、或含有其中任何之一的化合物可以是单链或双链以及线性或环状。变体是那些具有突变的核酸序列，例如上述序列的任何部分的取代、添加和/或缺失，其特异性拮抗转录因子可结合的染色体结合位点。更加优选的诱饵包括双链寡核苷酸，每条均含有一或多种上述核苷酸序列及其变体。可用于本发明的寡核苷酸包括经过修饰的寡核苷酸，以便降低其对生物降解的敏感性，例如那些含有通过将磷酸二酯基团中的氧以硫取代而得到的硫代磷酸二酯键(S-oligo)的寡核苷酸以及那些以不携带电荷的甲基磷酸基团取代磷酸二酯基团而得到的寡核苷酸。
至于产生用于本发明的诱饵的技术，可采用常规的化学或生物化学合成方法。例如，如果要将一种核酸用作所述的诱饵，可采用遗传工程学中常用的核酸合成方法。例如，可在DNA合成仪上直接合成目的诱饵寡核苷酸。或者，预先合成的核酸或其片段可通过PCR或使用克隆载体或类似方式进行扩增。此外，所需核酸可通过类似如下的程序获得，如以限制性酶或类似方式裂解和/或通过DNA连接酶或类似方式连接。为了获得在细胞内更加稳定的诱饵核苷酸，可以对核酸的碱基、糖或/和磷酸基团进行烷基化、乙酰化或其他化学修饰。
以本发明的诱饵作为活性成分的药物组合物不限于任何形式，只要该活性成分可以被受累部位的细胞或靶组织的细胞摄取即可。因此，诱饵无论是单独使用或常用的药物载体混合使用，可通过口服、肠外、局部或外用而施用。
药物组合物可以是液体剂型，例如溶液、悬液、糖浆、脂质体、洗剂等，或是固体剂型，例如片剂、颗粒、粉剂和胶囊。如果需要，药物组合物中可以补充各种载体、赋形剂、稳定剂、润滑剂和/或其他常规的药物添加剂，例如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石、凝胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可油、乙二醇，等等。
具体而言，如果将一种核酸或其修饰产物用作所述的诱饵，优选的剂型包括那些基因治疗中常用的剂型，例如脂质体，包括但不限于使用仙台病毒的膜融合脂质体和使用胞吞作用的脂质体、含有阳离子脂质的制剂例如Lipofectamine(Life Tech Oriental)或使用逆转录病毒载体、腺病毒载体的病毒体(virosomes)，等等。具体而言，优选膜融合脂质体。
此脂质体制剂的结构可以是大单层囊泡(large unilamellar vesicle，LUV)、多层囊泡(MLV)和小单层囊泡(SUV)中的任意一种。囊泡的大约尺寸可为，LUV在200-1000nm之间，MLV在400-3500nm之间，SUV在20-50nm之间，但对于使用仙台病毒的膜融合脂质体制剂，例如，优选地使用具有直径为200-1000nm的囊状系统的MLV。
对产生脂质体制剂的技术没有特别的限制，只要诱饵能够成功包装进囊泡即可。因此，这样的脂质体可通过常规的技术制造，例如反向蒸发法(reversed phase evaporation method)(Szoka，F.等Biochim.Biophys.Acta，Vol.601 559(1980))、醚进样法(ether injection method)(Deamer，D.W.Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.308 250(1978))、以及表面活性剂法(Brunner，J.等Biochim.Biophys.Acta，Vol.455 322(1976))，仅试举几例。
可用于形成脂质体的脂质包括磷脂、胆固醇及其衍生物、以及含氮脂质，但磷脂通常是优选的。可使用的磷脂包括天然存在的磷脂例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂等，通过常规的方法进行氢化的相应的磷脂，以及合成的磷脂例如联十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、油酰基硬脂酰磷脂酰胆碱(oleostearoylphosphatidylcholine)、油酰基硬脂酰磷脂酰乙醇胺(oleostearoylphosphatidylethanolamine)、油酰基硬脂酰磷脂酰丝氨酸(oleostearoylphosphatidylserine)，等等。
脂质，特别是磷脂，可单独或以适当的组合形式应用。通过使用含有正电荷基团例如乙醇胺或胆硷的脂质，可增强带负电的诱饵核苷酸的结合。除了主要的磷脂，已知可作为脂质体添加剂的各种化合物，例如胆固醇及其衍生物、硬脂胺、生育酚等，均可添加到脂质体的制备过程中。
在得到的脂质体中可加入膜融合促进剂(membrane fusionpromotor)，例如仙台病毒、灭活的仙台病毒、纯化自仙台病毒的膜融合促进蛋白、聚乙二醇等等，以便有助于被受累部位或靶组织的细胞摄入到细胞内。
在此详细描述一种制备药用脂质体的典型程序。将上述形成脂质体的物质以及胆固醇或类似的物质溶解于一种有机溶剂，例如四氢呋喃、氯仿、乙醇或类似的物质。在适当的容器中在负压下使得该溶剂蒸馏，以便在该容器的内壁上留下一层所述的形成脂质体的物质。然后加入含有诱饵的缓冲液，并搅拌该混合物。在任选地加入所述膜融合促进剂后对脂质体进行分离。将已经装入了诱饵的脂质体悬浮于适当的介质中或将其冻干物重新分散在一种适当的介质中以用于治疗。可以在脂质体分离后至使用前的间歇阶段添加所述的膜融合促进剂。
对以诱饵作为活性成分的药物组合物中的诱饵含量没有特别限制，只要所含诱饵的量可有效控制转录因子相关性疾病即可。因此，可根据所要控制的疾病、靶部位、剂型以及剂量方案任意选择诱饵含量。
根据疾病的类型和所含诱饵的种类，可通过多种方法施用如上产生的以诱饵作为活性成分的药物组合物。以缺血性疾病、炎症性疾病、自身免疫病、癌症转移或侵润以及恶病质为例，所述组合物可以静脉输入、直接施加到受累区域、注射入病变内部或施用至受累区域的局部血管内。作为一个进一步的特定实例，当进行PTCA治疗器官梗死时，可在手术的同时或手术之前或手术之后将所述药物组合物施用于局部血管。对于器官移植，可使用本发明的组合物对移植物进行预先处理。此外，在骨关节炎或风湿病的治疗中，可将所述组合物直接注射入关节内。
可根据病人的年龄和其他因素、疾病类型、所用的诱饵的种类等选择诱饵的剂量，但对于血管内、肌肉内或关节内施用来说，例如通常可每日施用一至数次10-10,000纳摩尔的单位剂量。
以下实施例用于阐述本发明而无任何限制本发明的意图。
实施例实施例1新的AP-1诱饵寡脱氧核苷酸对体外血管平滑肌细胞增殖和体内新内膜形成的抑制作用材料和方法动物使用9-10周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Hyochang，Taegu，Korea)，体重为280-320g。依照动物研究的统一准则进行所有步骤。
细胞培养如Ahn等(2001见上)所述收集人VSMC，自成年雄性SpragueDawley大鼠(200-250g)的胸主动脉收集大鼠主动脉平滑肌细胞。VSMC培养于含20％胎牛血清(Gibco BRL)的Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEMGibco BRL，Grand Island，NY，USA)中。以平滑肌特异性α-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)阳性染色来鉴定VSMC的纯度。
构建CDODN本发明所用的衍生自AP-1结合位点的哑铃型和硫代磷酸酯双链ODN和错配的ODN的序列如下CDODN(共有序列以下划线标出)，5′-GGATCCATGACTCAGAAGACGACACACGTCTTCTGAGTCAT-3′(SEQ ID NO3)；硫代磷酸酯线性AP-1诱饵ODN(PSODN)，5′-AGCTTGTGACTCAGAAGCT-3′(SEQ ID NO4)；错配的AP-1诱饵ODN(MODN)，5′-GGATCCAAATCTCAGAAGACGACACACGTCTTCTGAGATTT-3′(SEQ ID NO5)。
茎的5′端具有6个碱基的单链序列5′-GGATCC-3′作为BamHI的限制性位点。将两个寡分子通过两者的5’末端的互补的6个碱基的序列进行连接。将ODN退火2小时，期间温度自80℃降至25℃。加入1单位T4DNA连接酶并在16℃孵育24h以产生共价连接的哑铃状诱饵ODN分子(CDODN)。该CDODN由两个环和一个茎组成，其含有两个串联的AP-1共有序列(图1A)。
CDODN的稳定性为了测试CDODN的稳定性，将各1μg的非连接的磷酸二酯ODN、PSODN和CDODN与人血清、胎牛血清、小牛血清、核酸外切酶III或S1核酸酶进行孵育。所有血清在使用中均未进行热灭活以便保护Dnase活性。在ODN中加入各种血清，达到100μl反应体系的50％，在37℃孵育24h。在ODN中加入核酸外切酶III(Takara，Otsu，Japan)，160单位/μgODN，并在37℃孵育2h。在ODN中加入S1核酸酶(Takara)，10单位/μgODN，并在25℃孵育30分钟。以酚和氯仿抽提ODN，并以15％的变性聚丙烯酰胺凝胶检测。
AP-1诱饵ODN对VSMC生长的影响将VSMC接种于96-孔组织培养板。当达到30％汇合时，将VSMC在规定的无血清培养基中孵育24小时以使其达到静止。然后，将含有100nmol/L诱饵ODN的Lipofectin加入各孔中。细胞在37℃孵育5小时。2-3天后，使用WST细胞计数试剂盒(Wako，Osaka，Japan)确定细胞增殖指数。
细胞迁移分析以改良的Boyden小室(Corning，NY，USA)测定VSMC迁移。将悬浮于对照培养基的VSMC(2×105细胞/孔)加至上层小室，将测试的样品置于下层小室。在37℃孵育24小时后，固定细胞并以苏木精和曙红染色。计数在滤膜的下表面随机选择的4个高倍(x400)视野的平均细胞数。
电泳迁移率改变分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)如Ahn JD等(见上)所述，自VSMC制备核提取物。简言之，将DNA探针例如AP-1和错配诱饵ODN进行标记作为引物。在室温进行蛋白质-DNA结合反应20分钟，体积为20μl。反应混合物含有6μg的核提取物，100μg/ml poly dIdC，10mmol/l Tris/HCl(pH7.5)，50mmol/l NaCl，0.5mmol/l EDTA，0.5mmol/l DTT，1mmol/l MgCl2，4％甘油和60,000cpm32P-标记的引物DNA。孵育后，样品加至4％非变性(native)聚丙烯酰胺凝胶，0.5xTris-硼酸盐-EDTA缓冲液，150V电泳2小时。将凝胶进行干燥和自显影。为进行竞争实验，采用相同的实验条件，不同的是，在加入核提取物前，在反应混合物中先加入超过50倍至100倍的适当的竞争剂ODN。
萤光素酶分析AP-1萤光素酶构建体，pAP1(PMA)-TA-Luc，购自Clontech，细胞周期蛋白A启动子萤光素酶构建体由Dr.Masao Yoshizumi(University ofTokyo Hospital，Tokyo，Japan)惠赠(见Yoshizumi M等J Biol Chem，199727222259-22264)。为分析萤光素酶的表达，将细胞以PBS洗涤2次，并以200μl的1X Reporter裂解缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)中裂解。取50微升的各种裂解物测定萤光素酶活性。
Northern印迹分析以northern印迹来测定PCNA和细胞周期蛋白A的基因表达。为进行northern印迹分析，将10μg的总RNA加至1％甲醛-琼脂糖凝胶并转移至尼龙膜。将尼龙膜在ExpressHybTM溶液中在65℃与放射性标记的PCNA cDNA探针或细胞周期蛋白A cDNA探针(由Dr.Young-ChaeChang惠赠，Dankook University Medical School，Korea)杂交2小时，并按照厂商的说明进行洗涤。将膜暴露于X-线胶片，并以密度计分析来定量mRNA表达。
制备日本血凝病毒(HVJ)脂质体如Ahn JD等(2001见上)所述制备HVJ-AVE脂质体。简言之，将胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸按照如下摩尔比进行混合50∶13.3∶13.3∶13.3∶10。除去氯仿以使脂质混合物沉积在容器的侧壁。将干燥的脂质在200μl含有ODN的平衡盐溶液(BSS；137mmol/l NaCl，5.4mmol/l KCl，10mmol/l Tris-HCl，pH7.6)中水化。通过摇动和过滤制备脂质体。将纯化的HVJ(Z株)以UV照射3分钟进行灭活，然后使用。将脂质体悬液与HVJ在总体积为2ml的BSS中混合。将混合物在4℃孵育5分钟，然后在37℃孵育30分钟并轻轻摇动。通过蔗糖梯度密度离心将游离的HVJ自HVJ-脂质体中去除。收集蔗糖梯度的上层备用。
球囊损伤和体内基因转移使用2 French Fogarty导管在雄性Sprague-Dawley大鼠(280-320g)诱导血管损伤。以戊巴比妥麻醉这些大鼠，并手术显露左侧颈总动脉。经颈外动脉将套管导入颈总动脉。自颈外动脉切开处通入球囊导管，并充气3次以诱导颈总动脉血管损伤。通过临时结扎将损伤的区段短时间分离。球囊损伤后，将20μl的含有CDODN、MODN、FITC-标记的PSODN的HVJ-脂质体或HVJ-脂质体本身与内膜在室温孵育10分钟。孵育10分钟后，取出输液套管。转染后，松开止血带以恢复颈总动脉的血流，关闭伤口。在历经此过程的动物中未观察到任何神经系统或血管系统的不良反应。
组织学分析转染后2周，将大鼠处死并灌注4％的多聚甲醛以固定血管。由不清楚样品来源者通过形态测定法定量测量新内膜的尺寸。以一种数字化系统测量内膜和中膜区域(型号INTUOS 6x8，Wacom，Vancouver，WA，USA)。对于以FITC标记的AP-1诱饵ODN转染的情况，在转染3天后收集血管并灌注4％的多聚甲醛以固定血管。以荧光显微镜对切片进行测定。为进行免疫组织化学分析，将切片与兔抗增殖细胞核抗原抗体(1∶200稀释，SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)进行孵育，并按照标准的方法处理以便进行免疫组织化学分析。
统计学分析结果以平均值±SEM表示。采用方差分析和Duncan′s检验以确定多重比较的差异的显著性。P＜0.05被认为具有统计学显著意义。所有实验均至少重复3次。
结果构建具有增强的稳定性的哑铃型AP-1诱饵为研究各种诱饵ODN的稳定性，我们首先测定了这些分子对核酸酶的稳定性。CDODN对核酸外切酶III稳定，但当PSODN和退火的诱饵ODN与核酸外切酶III孵育2小时后，其被完全降解(图1B)。我们进一步用S1核酸酶测定了CDODN的分子特征，S1核酸酶消化DNA分子的单链区域。哑铃状诱饵(72个碱基)和PSODN(38个碱基)的茎区域均可免于S1核酸酶消化，但退火的诱饵ODN则被消化(图1B)。
与未灭活的人血清、胎牛血清和小牛血清孵育24小时后，PSODN和退火的诱饵ODN均发生显著的水解。而CDODN与这些不同的血清孵育24小时后，仍有大部分保持完好，说明与PSODN和退火的诱饵ODN相比，CDODN具有明显增强的稳定性(图1B)。
AP-1与具有AP-1靶位点的哑铃状诱饵ODN的特异性结合。
为了证明CDODN能够作为诱饵以序列特异性的方式与AP-1发生足够强的相互作用，我们进行了体外竞争性分析。未标记的AP-1诱饵ODN的增加降低了被延迟的条带的强度，该条带相应于由AP-1蛋白形成的复合体(图2A)。以过量1000倍的未标记的PSODN作为竞争剂，几乎完全争夺了与AP-1结合的标记的探针。如果以CDODN替代PSODN作为竞争剂，过量100倍的未标记的CDODN竞争剂完全争夺了与AP-1结合的标记的探针。随后，我们将CDODN和PSODN转染入处于高葡萄糖和血清刺激条件下的细胞中，以研究CDODN是否能够特异性抑制AP-1的DNA结合活性。正如所预料的，与低葡萄糖相比，高葡萄糖处理显著升高了AP-1的结合活性(图2B，p＜0.001)。相似地，血清也以剂量依赖性的方式升高了AP-1的DNA结合活性(p＜0.001)。转染PSODN和CDODN均显著降低由高葡萄糖或血清诱导的AP-1的DNA结合活性(p＜0.01)，但CDODN对AP-1的结合活性具有更高的抑制作用(p＜0.001)。
AP-1诱饵ODN对平滑肌细胞基因表达的影响我们使用了在启动子区域具有AP-1结合位点的报告基因构建体，以研究AP-1诱饵ODN对启动子活性的影响。为了研究AP-1结合位点在高葡萄糖上调细胞周期蛋白A启动子活性中的作用，我们将一系列萤光素酶报告基因质粒转染入以高葡萄糖处理的平滑肌细胞中，这些质粒含有不同长度的人细胞周期蛋白A的5′侧翼序列。在这些质粒中，仅有两种质粒(pCA-266/+205mt和pCA-133/-205mt)具有显著降低的萤光素酶活性(图3A，p＜0.001，与pCA-266/+205或pCA-133/+205相比)，且这些报告基因构建体具有来自细胞周期蛋白A启动子的突变的ATF位点，该ATF位点负责结合AP-1蛋白。这些结果说明，AP-1诱饵ODN可在平滑肌细胞中下调由高葡萄糖诱导的细胞周期蛋白A的启动子活性。
接下来，我们比较了AP-1诱饵ODN对高葡萄糖和血清诱导的萤光素酶报告质粒(pAP1(PMA)-TA-Luc和细胞周期蛋白A启动子萤光素酶构建体(pCA-266/+205)，含有AP-1结合位点)的活性的影响。正如所预料的，将萤光素酶报告基因与PSODN和CDODN进行共转染显著降低了高葡萄糖刺激的和血清刺激的萤光素酶基因表达(图3B和C，p＜0.01)。不过，CDODN较PSODN更加有效(p＜0.01，与PSODN相比)。因此，我们研究了AP-1诱饵ODN在体外对内源性细胞周期调节基因表达的影响。为此，通过northern印迹测定了PCNA和细胞周期蛋白A的基因表达。对于细胞周期由G1期至S期的进程，细胞周期蛋白A和PCNA均为必需的。如图3D所示，高葡萄糖和血清均可刺激人VSMC和大鼠主动脉平滑肌细胞的PCNA和细胞周期蛋白A mRNA的表达。转染AP-1诱饵ODN(而不是错配的ODN)可使得高葡萄糖和血清诱导的这些基因的表达降低。此外，在这些刺激条件下，CDODN对这些基因的表达的抑制作用较PSODN更强。
AP-1诱饵ODN在体外对平滑肌细胞生长和迁移的抑制作用与对照相比，高葡萄糖和血清处理刺激了培养的原代人和大鼠VSMC的生长(图4A和4B)。与经高葡萄糖或血清刺激的细胞相比，转染AP-1诱饵ODN显著抑制细胞生长(p＜0.05)。值得注意的是，CDODN几乎完全抑制了细胞生长(p＜0.01)。与此相似的是，与对照相比，高葡萄糖和血清均可增强VSMC的迁移(图4C和4D，p＜0.05)，而尽管AP-1诱饵ODN显著降低了由高葡萄糖和血清刺激引起的迁移(p＜0.01)，CDODN对迁移具有最强的抑制作用(p＜0.001)。
CDODN对大鼠球囊损伤的颈动脉内新内膜形成的影响我们用荧光(FITC)-标记的AP-1诱饵ODN测试了HVJ-脂质体方法对大鼠颈动脉的转染效力。用HVJ-脂质体方法转染FITC-标记的ODN产生了强烈的荧光(图5A和B)，在动脉各层均能容易地检测到。因此，我们选择HVJ-脂质体方法将AP-1诱饵ODN转染入大鼠颈动脉。
采用HVJ-脂质体方法，我们测定了AP-1诱饵ODN对大鼠颈动脉球囊损伤模型中新内膜形成的影响。如图5所示，转染2周后，转染了错配ODN的血管出现了与未处理的血管相似的新内膜形成。与此不同，施用单剂的PSODN和CDODN导致新内膜形成显著减少(p＜0.001)。与体外结果相似，CDODN对新内膜形成的抑制作用较PSODN更强(p＜0.0001)。
接下来，我们比较了用AP-1诱饵ODN进行预处理和后处理对损伤的颈动脉中新内膜形成的抑制作用。如图6所示，在球囊损伤前对大鼠颈动脉进行AP-1诱饵ODN预处理较后处理更加有效地抑制了新内膜形成(p＜0.0001，与球囊损伤血管相比；p＜0.01，与CDODN后处理相比)。
AP-1诱饵ODN在体内对AP-1 DNA结合活性和基因表达的影响为了证实AP-1诱饵ODN在体内有效地阻断了AP-1的DNA结合活性，我们使用来自受损动脉的相比进行凝胶迁移分析。如图7A所示，AP-1 DNA结合活性在损伤后30分钟已经升高，并在损伤后3小时达到高峰。以CDODN处理抑制了这种激活。以诱饵ODN进行预处理较后处理更加有效地降低了AP-1的活性。
AP-1诱饵ODN对细胞增殖的抑制作用得到了PCNA染色的证实，PCNA染色被广泛用作正常和疾病状态下的增殖标记物。如图7B所示，在未受损的动脉中无PCNA染色。损伤后2周，在新内膜区域和再生内皮细胞中检测到PCNA染色阳性的细胞明显增加。与此不同，与未转染的血管相比，经AP-1诱饵ODN处理的血管中的PCNA染色阳性的细胞要少的多。
实施例2新的E2F诱饵寡脱氧核苷酸的作用材料和方法动物使用9-10周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重为280-320g。依照动物研究的统一准则进行所有步骤。
细胞培养自心脏移植供体的胸主动脉分离人VSMC，此组织的采集得到了伦理委员会的批准。自成年雄性SD大鼠的胸主动脉收集大鼠VSMC。VSMC培养于含20％胎牛血清(Gibco BRL)的Dulbecco′s modified Eagle′smedium(DMEMGibco BRL，Grand Island，NY，USA)中。以平滑肌特异性α-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)阳性染色来鉴定VSMC的纯度。
当在100-mm培养皿中达到80-90％汇合时，将VSMC在无血清培养基中孵育24小时，然后置于作为对照的正常葡萄糖培养基(DMEM，含有5.5mmol/l D-葡萄糖)或条件培养基(DMEM，含有10％血清和22mmol/l D-葡萄糖)中。将细胞按照如下进行处理以提取核蛋白或提取RNA。
构建哑铃型诱饵ODN本发明所用的针对E2F结合位点的哑铃型和硫代磷酸酯双链ODN的序列以及突变的ODN序列如下CD-E2F(注共有序列以下划线标出)，5′-GGATCCGTTTCGCGCTATTGCAAAAGCAATAGCGCGAAAC-3′(SEQ ID NO6)；硫代磷酸酯E2F诱饵(PS-E2F)，5′-ATsTTAAGTTTCGCGCCCTTTCTCAsAs-3′(SEQ ID NO7)；突变的E2F诱饵(M-E2F)，5′-GGATCCGTTTCGATTTATTGCAAAAGCAATAAATCGAAAC-3′(SEQID NO8)。CD-E2F预计会形成茎环结构。各个寡分子两端的互补序列形成茎。茎的5′端具有6个碱基的单链序列5′-GGATCC-3′作为BamHI酶切位点。将两个寡分子通过两者的5’末端的互补的6个碱基的序列进行连接。将ODN退火2小时，期间温度自80℃降至25℃。加入1单位T4DNA连接酶并在16℃孵育24h以产生共价连接的哑铃型诱饵分子。CD-E2F由两个环和一个含有两个E2F共有序列的茎组成(图8A)。
CD-E2F的稳定性为了测试CD-E2F的稳定性，将各1μg的PS-E2F、非连接的磷酸二酯寡分子和CD-E2F与人血清、FBS、核酸外切酶III或S1核酸酶进行孵育。所有血清在使用中均未进行热灭活以便保护Dnase活性。在寡分子中加入各种血清，达到100μl反应体系的50％，在37℃孵育24h。在寡分子中加入核酸外切酶III(Takara，Otsu，Japan)，160单位/μg寡分子，并在37℃孵育2h。在寡分子中加入S1核酸酶(Takara)，10单位/μg寡分子，并在25℃孵育30分钟。以酚和氯仿抽提寡分子，并以15％的变性聚丙烯酰胺凝胶检测。
体外基因转移在加入诱饵前1天，将细胞培养在新鲜的培养基中，并在进行每个实验前以Opti-MEM(Gibco BRL)洗涤两次。细胞以100nM的诱饵ODN和Lipofectin(摩尔比DNA∶脂质＝1∶3)(Gibco BRL)转染。根据生产商的说明，将诱饵ODN∶Lipofectin混合物一滴滴加入到细胞中。将细胞在37℃孵育5小时。然后更换新鲜的含有10％FBS的培养基，然后将细胞孵育在CO2培养箱中。
诱饵ODN对VSMC生长的影响将VSMC接种于96-孔组织培养板。当达到30％汇合时，将SMC在规定的无血清培养基中孵育24小时以使其达到静止。然后，将Lipofectin∶诱饵ODN(含有100nM ODN)加入各孔中。细胞在37℃孵育5小时。2-3天后，使用WST细胞计数试剂盒(Wako，Osaka，Japan)确定细胞增殖指数。
电泳迁移率改变分析(EMSA)如Ahn JD等(2001，见上)所述，自VSMC制备核提取物。简言之，将DNA探针，例如E2F和突变的ODN的探针，用[Y-32P]ATP和T4多核苷酸激酶进行标记作为引物。进行末端标记后，以NAP-5柱纯化32P-标记的ODN。在室温进行蛋白质-DNA结合反应20分钟，体积为20μl。反应混合物含有6μg的核提取物，100μg/ml poly dIdC，10mmol/l Tris/HCl(pH7.5)，50mmol/l NaCl，0.5mmol/l EDTA，0.5mmol/lDTT，1mmol/l MgCl2，4％甘油和60,000cpm32P-标记的引物DNA。孵育后，样品加至4％非变性聚丙烯酰胺凝胶，在0.5xTris-硼酸盐-EDTA缓冲液中，150V电泳2小时。将凝胶进行干燥和自显影。为进行竞争实验，采用相同的实验条件，不同的是，在加入核提取物前，在反应混合物中先加入超过50-100倍的适当的竞争剂ODN。
Northern印迹分析以northern印迹来测定PCNA和细胞周期蛋白A的基因表达。将10μg的总RNA加至1％甲醛-琼脂糖凝胶并转移至尼龙膜。将尼龙膜在ExpressHybTM溶液中在65℃与放射性标记的PCNA cDNA探针或细胞周期蛋白A cDNA探针(由Dr.Young-Chae Chang惠赠，DankookUniversity Medical School，Korea)杂交2小时，并按照厂商的说明进行洗涤。将膜暴露于X-线胶片24-48小时，并以密度计分析来定量mRNA表达。使用18s rRNA cDNA探针对上样的差别进行标准化。
制备日本血凝病毒(HVJ)脂质体如Ahn JD等(2001见上)所述制备HVJ-AVE脂质体。简言之，将胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸按照如下摩尔比进行混合50∶13.3∶13.3∶13.3∶10。除去氯仿以使脂质混合物沉积在容器的侧壁。将干燥的脂质在200μl含有ODN的平衡盐溶液(BSS；137mmol/l NaCl，5.4mmol/l KCl，10mmol/l Tris-HCl，pH7.6)中水化。通过摇动和过滤制备脂质体。使用前将纯化的HVJ(Z株)以UV照射3分钟进行灭活。将脂质体悬液与HVJ在总体积为2ml的BSS中混合。将混合物在4℃孵育5分钟，然后在37℃孵育30分钟并轻轻摇动。通过蔗糖梯度密度离心将游离的HVJ自HVJ-脂质体中去除。收集蔗糖梯度的上层备用。
球囊损伤和体内基因转移使用2 French Fogarty导管在雄性SD大鼠诱导血管损伤。以戊巴比妥麻醉这些大鼠，并手术显露左侧颈总动脉。经颈外动脉将套管导入颈总动脉。通入球囊导管并充气3次以诱导颈总动脉血管损伤，之后进行体内基因转移。球囊损伤后，将20μl的含有CDE2F、M-E2F、FITC-标记的PS-E2F的HVJ-脂质体复合体或HVJ-脂质体本身与内膜在室温孵育10分钟。孵育10分钟后，取出输液套管。转染后，松开止血带以恢复颈总动脉的血流，并关闭伤口。在历经此过程的动物中未观察到任何神经系统或血管系统的不良反应。
萤光素酶分析E2F萤光素酶构建体由Dr.Youngchae Jang(Dankook University，Chunan，Korea)惠赠。为分析萤光素酶的表达，将细胞以PBS洗涤2次，并以200μl的1XReporter裂解缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)中裂解。取50微升的各种裂解物测定萤光素酶活性。
组织学分析转染后2周，将大鼠处死并灌注4％的多聚甲醛以固定血管。由不清楚样品来源者通过形态测定法定量测量新内膜的尺寸。以一种数字化系统测量内膜和中膜区域(型号INTUOS 6x8，Wacom，Vancouver，WA，USA)。对于以FITC标记的E2F诱饵ODN转染的情况，在转染3天后收集血管并灌注4％的多聚甲醛以固定血管。以荧光显微镜对切片进行测定。为进行免疫组织化学分析，将切片与兔抗增殖细胞核抗原抗体(1∶200稀释，SantaCruz，Santa Cruz，CA，USA)进行孵育，并按照标准的方法处理以便进行免疫组织化学分析。
统计学分析结果以平均值±SEM表示。采用方差分析和Duncan′s检验以确定多重比较的差异的显著性。P＜0.05被认为具有统计学显著意义。所有实验均至少重复3次。
结果CD-E2F的稳定性为了研究新合成的CDE2F的稳定性，我们先检测了其在存在核酸酶的情况下的分子稳定性(图8B)。正如所预期的，CD-E2F对核酸外切酶III具有抗性，并在凝胶电泳上呈现为一条主要条带。与CD-E2F不同，与核酸外切酶III孵育2小时后，PSE2F和退火型诱饵均完全降解。为了确定CD-E2F的茎环结构，我们采用S1核酸酶进一步测定了CD-E2F的分子特征。将诱饵与消化DNA分子单链区域的S1核酸酶一起孵育。CD-E2F的茎区域(74个碱基)和PS-E2F的茎区域(50个碱基)均可抵抗S1核酸酶，而退火型诱饵(图8B)则不能。
据报道，核酸外切酶活性构成了细胞浆和血清中核酸酶活性的绝大部分。因此，我们通过与未进行热灭活的血清进行孵育测试了诱饵的稳定性。将诱饵以50％的未经热灭活的人血清、FBS、或小牛血清孵育24小时。与各种血清孵育24小时后，PS-E2F和退火型诱饵均明显水解。而CD-E2F与这些不同的血清孵育24小时后则大部分保持完好，说明其与PSE2F和退火型诱饵相比具有更高的稳定性(图8B)。
E2F与具有E2F靶位点的CD-E2F的特异性结合为了CD-E2F的序列特异性，我们进行了体外竞争性分析。未标记的E2F诱饵的增加降低了被延迟的条带的强度，该条带相应于由E2F蛋白形成的复合体(图9A)。以过量1000倍的未标记的PS-E2F作为竞争剂完全争夺了与E2F结合的标记的探针。另一方面，如果以CD-E2F替代PS-E2F作为竞争剂，仅需要过量100倍的未标记的CD-E2F竞争剂便可完全争夺与E2F结合的标记的探针。随后，我们将诱饵转染入细胞中，以研究诱饵是否能够特异性抑制E2F的DNA结合活性。正如所预料的，与在对照培养基中进行培养相比，在含有高葡萄糖和血清的条件培养基中培养显著升高了E2F的结合活性(图9B，p＜0.01)。转染PS-E2F和CD-E2F均显著降低由高葡萄糖和血清诱导的E2F的DNA结合活性(p＜0.01)。不过，与PS-E2F相比，CD-E2F强烈地抑制了由高葡萄糖和血清诱导的E2F的DNA结合活性的升高(p＜0.05)。
E2F诱饵对平滑肌细胞中细胞周期蛋白启动子活性的影响我们使用了在启动子区域具有E2F结合位点的报告基因构建体，以研究E2F诱饵对启动子活性的影响。为了研究E2F结合位点在高葡萄糖上调细胞周期蛋白A启动子活性中的作用，我们将一系列萤光素酶报告基因质粒转染入以高葡萄糖处理的平滑肌细胞中，这些质粒含有不同长度的人细胞周期蛋白A的5′侧翼序列。在这些质粒中，仅有两种质粒(pCA-133/+205和pCA-133/-2)具有显著降低的萤光素酶活性(图10A)，且pCA-133/-2构建体的活性最低，该构建体中的细胞周期蛋白A启动子的两个E2F结合位点是缺失的。这些结果说明，在VSMC中，E2F位点介导了高葡萄糖对细胞周期蛋白A启动子活性的上调。接下来，我们研究了E2F诱饵对报告基因质粒pCA-266/+205和[E2F]X4-Luc的启动子活性的抑制作用，[E2F]X4-Luc在启动子区域含有4个E2F结合位点。正如所预料的，共转染E2F诱饵显著降低了由高葡萄糖和血清对萤光素酶基因表达的上调(图10B和C，p＜0.01)。此外，CD-E2F较PS-E2F更加有效(p＜0.05)，而M-E2F没有消除萤光素酶活性的升高。
E2F诱饵对VSMC中细胞周期调节基因表达的影响我们测定了E2F诱饵对内源性细胞周期调节基因表达的影响。如图11所示，高葡萄糖和血清刺激了人VSMC和大鼠ASMC中细胞周期蛋白A和PCNA基因的表达(p＜0.01)。转染E2F诱饵(而不是M-E2F)降低了PCNA和细胞周期蛋白A的基因表达(p＜0.01)。转染E2F诱饵没有影响18SrRNA的表达。在这些刺激条件下，CD-E2F对这些基因的表达的抑制作用较PS-E2F更强(p＜0.05)。
E2F诱饵在体外抑制VSMC生长的作用对球囊损伤的血管应答的通常的应答是VSMC增殖，我们测试了E2F诱饵抑制平滑肌细胞生长的能力。通过使用WST细胞计数试剂盒测定发现，与对照相比，高葡萄糖和血清处理刺激了原代培养的人和大鼠VSMC的生长(图12A and B)。与经高葡萄糖或血清刺激的细胞相比，转染E2F诱饵引起细胞生长的显著抑制(p＜0.01)。CD-E2F几乎完全抑制了细胞生长(p＜0.05，相对于PS-E2F)。
CD-E2F对球囊损伤的大鼠颈动脉影响我们测试了HVJ-脂质体方法将E2F诱饵族人入大鼠颈动脉的效力。
采用HVJ-脂质体方法转染一种FITC-标记的E2F诱饵产生了强烈的荧光(图13B)，在动脉各层均能容易地检测到。因此，在随后的实验中，我们均选择采用HVJ-脂质体方法将E2F诱饵转染入大鼠颈动脉。
我们在大鼠颈动脉球囊损伤模型中采用E2F诱饵测定了一种体内反基因策略的效应。如图13所示，以M-E2F进行转染的血管在转染2周后出现了新内膜形成，这与未经处理的血管相似。与此不同，施用单剂PS-E2F和CD-E2F即明显抑制了新内膜形成(p＜0.001)。与体外结果一致，CDE2F对新内膜形成的抑制作用较PS-E2F更强(p＜0.05)。诱饵处理没有改变中膜区域。新内膜形成的减少局限于转染区域。
PCNA的基因被认为是E2F依赖性的，其最初被认为是一种核蛋白，该蛋白的出现与细胞的增殖状态相关。因此，我们探讨了球囊损伤对PCNA表达的影响，以及以E2F诱饵处理是否能够抑制PCNA的表达。如图14所示，在对照，即未受损的动脉中未见PCNA染色。损伤2周后，在新内膜区域和再生的内皮细胞中PCNA染色阳性细胞明显增多。与此不同，在以E2F诱饵处理的血管中，PCNA染色阳性细胞的数量大大低于未经处理的血管。
实施例3新的NF-KB诱饵寡脱氧核苷酸效果构建哑铃型诱饵ODN本发明所用的针对NFκB结合位点的哑铃型和硫代磷酸酯化的双链ODN的序列以及突变的ODN的序列如下CD-NF(注共有序列以下划线标出)，5′-GGATCCGGGGATTTCTATTGCAAAAGCAATAGCGCGAAAC-3′(SEQID NO15)；硫代磷酸酯NFκB诱饵(PS-NF)，5′-ATsTTAAGGGGATTTCCCTTTCTCAsAs-3′(SEQ ID NO16)突变的E2F诱饵(M-NF)，5′-GGATCCGGGGATATTTATTGCAAAAGCAATAAATCGAAAC-3′(SEQID NO17)。预期CD-NF会形成一种茎环结构。每种寡分子的两端的互补序列形成了茎。茎的5′端具有6个碱基的单链序列5′-GGATCC-3′，作为BamHI的酶切位点。两个寡分子通过两者5’末端互补的6个碱基序列相连接。将ODN退火2小时，期间将温度自80℃降至25℃。加入1个单位的T4 DNA连接酶并在16℃孵育24h，以产生共价连接的哑铃型诱饵分子。CD-NF由两个环和一个含有两个NFκB共有序列的茎组成。
合成NF-KB诱饵(诱饵寡核苷酸)使用DNA合成仪自S-寡核苷酸分别合成了一种NF-KB诱饵寡核苷酸和一种杂乱的(scrambled)诱饵寡核苷酸(一种寡核苷酸，其含有与NF-KB诱饵寡核苷酸相同的碱基组成，但序列是随机的)，其核苷酸序列如下所示。将这些核苷酸在80℃加热30分钟，然后冷却至室温达2小时以上，以便形成双链DNA。
NF-KB诱饵寡核苷酸CCTTGAAGGGATTTCCCTCC(SEQ ID No.9)GGAACTTCCCTAAAGGGAGG(SEQ ID No.18)杂乱的诱饵寡核苷酸TTGCCGTACCTGACTTAGCC(SEQ ID No.19)AACGGCATGGACTGAATCGG(SEQ ID No.20)CD-NF的稳定性为了测试CD-NF的稳定性，将PS-NF、未连接的磷酸二酯寡分子和CD-NF各1μg与人血清、FBS、核酸外切酶III、或S1核酸酶之一进行孵育。所有的血清均未进行热灭活，以便保留Dnase活性。将各种血清加入至寡分子中，达到100μl反应体积的50％，并在37℃孵育24h。将核酸外切酶III(Takara，Otsu，Japan)以160单位/μg寡分子加入至寡分子中，并在37℃孵育2h。将S1核酸酶(Takara)以10单位/μg寡分子加入至寡分子中，并在25℃孵育30分钟。然后以酚和氯仿提取寡分子，并在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行检测。
体外基因转移在加入诱饵前1天，将细胞培养在新鲜的培养基中，并在进行每个实验前以Opti-MEM(Gibco BRL)洗涤两次。细胞以5μM的诱饵ODN和Lipofectin(摩尔比DNA∶脂质＝1∶3)(Gibco BRL)转染。根据生产商的说明，将诱饵ODN∶Lipofectin混合物一滴滴加入到细胞中。将细胞在37℃孵育5小时。然后更换新鲜的含有10％FBS的培养基，然后将细胞孵育在CO2培养箱中。
制备CD-NF的日本血凝病毒(HVJ)脂质体如Ahn JD等(2001见上)所述制备HVJ-脂质体。简言之，将胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸按照如下摩尔比进行混合50∶13.3∶13.3∶13.3∶10。除去氯仿以使脂质混合物沉积在容器的侧壁。将干燥的脂质在200μl含有ODN的平衡盐溶液(BSS；137mmol/l NaCl，5.4mmol/l KCl，10mmol/l Tris-HCl，pH7.6)进行水化。通过摇动和滤过制备脂质体。在使用前，将纯化的HVJ(Z株)以UV照射3分钟进行灭活。脂质体悬液与HVJ在总体积为2ml的BSS中进行混合。将混合物在4℃孵育5分钟，然后在37℃孵育30分钟并轻轻摇动。通过蔗糖梯度密度离心将游离的HVJ自HVJ-脂质体中去除。收集蔗糖梯度的上层备用。
制备普通的NFκB诱饵的脂质体制剂将重量比为1∶4.8∶2(总共10mg)的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇溶解于四氢呋喃。使用旋转蒸发器将四氢呋喃自脂质溶液中去除，留下的脂质以薄膜状贴附于瓶壁。加入200ml含有实施例1制备的NF-KB诱饵寡核苷酸(0.7mg)的盐水(BSS139mM NaCl，5.4mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.6)，将该混合物进行搅动并在常规条件下进行超声波处理以产生一种含有NF-KB诱饵寡核苷酸的脂质体悬液。将该脂质体囊泡悬液(0.5ml，脂质含量为10mg)与纯化的仙台病毒(Z株，10000血凝单位(hemaglutinating unit))混合，仙台病毒在使用前曾以UV照射(110erg/mm2/sec)3分钟，并以BSS将该混合物调至4ml。将该混合物在4℃保持5分钟，然后在37℃轻柔地搅动30分钟。通过蔗糖梯度密度离心将未结合脂质体的仙台病毒去除，然后分离最上面的一层，并以BSS调整其浓度，以形成一种含有8μM被包载的NF-KB诱饵寡核苷酸的脂质体制剂。类似地使用实施例1的杂乱的诱饵寡核苷酸替代NF-KB诱饵寡核苷酸制备了一种脂质体制剂。
再灌注模型实验(1)方法以戊巴比妥钠将9-10周龄的SD大鼠麻醉，将套管插入至左侧颈动脉邻近气道处，并使之停留在靠近心脏的主动脉瓣处(靠近冠状动脉入口处)。此外，给动物插入气管插管，并将气管插管与人工呼吸器相连接，以提供呼吸支持。然后行左侧肋间切口，并结扎大鼠心脏的左前降支以诱发缺血。30分钟后，剪断结扎缝线以启动再灌注。随后立即将1.5ml/大鼠的如上制备的脂质体包载的CD-NF、PS-NF、M-NF、NF-KB诱饵核苷酸或杂乱的诱饵核苷酸通过停留在靠近冠状动脉入口处的套管进行施用。关闭胸腔切口，缝合气管，并维持动物存活。24小时后，将大鼠再次麻醉，取出心脏并以盐水洗涤。将大鼠心脏的心室切成6片，以氯化四氮唑(tetrazolium chloride，TTC)染色。将6份切片分别照相并进行影像分析。通过如下公式计算梗死面积。
梗死率(％)＝6份切片的总梗死面积/6份切片的总面积×100通过多重比较(ANOVA)进行统计学分析。
(2)结果在未经处理的对照组、M-NF和杂乱的诱饵处理组中，心肌梗死的程度大致相当。与未经处理的组、M-NF和杂乱的诱饵处理组相比，在给予CD-NF、PS-NF和NF-KB诱饵核苷酸的组中，梗死受到显著地抑制。在这些阳性的组中，给予CD-NF的组较普通的诱饵或PS-NF显示出更显著的抑制效果。
在即将诱导梗死之前施用脂质体也产生了相似的抑制作用。
抑制癌症转移(1)方法给7周龄的C57BL/6株雌性小鼠静脉施用1×104的鼠网状组织细胞肉瘤M5076细胞，24后静脉施用0.2ml(6纳摩尔)的按照上述方法制备的各种以脂质体包载的如上制备的CD-NF、PS-NF、M-NF、NF-KB诱饵核苷酸或杂乱的诱饵核苷酸。对照组以相同的方式接受0.2ml的盐水。静脉施用M5076后第14天，将底物解剖并在离体显微镜下计数肝脏表面的肿瘤结节的数量。各组均有10只小鼠。采用Kruskal-Wallis检验和Dunnett′s多重比较进行统计学分析。
(2)结果CD-NF、PS-NF和NF-KB诱饵处理组较M-NF处理组或对照组更加显著地抑制了肿瘤的体积。在这些阳性的组中，给予CD-NF的组较普通的诱饵或PS-NF更显著地抑制了肿瘤的体积。
抑制恶病质(1)方法使用了7周龄的雄性BALB/c小鼠，将鼠结肠癌细胞系Colon26的2mm3大小的瘤块进行皮下移植。自移植后第7天开始，将0.2ml(6纳摩尔)如上制备的脂质体包载的CD-NF、PS-NF、M-NF、NFκB诱饵核苷酸或杂乱的诱饵核苷酸施用至瘤块内，并连续测定体重和肿瘤。在第13天将底物解剖，并分离附睾脂肪(epididymal fat)和腓肠肌并称重。并测定了不包括所有剩余脏器和肿瘤的动物的湿重。根据以下公式，由各个瘤块的长径和短径计算肿瘤的重量。
肿瘤重量(mg)＝长径×短径2/2
各组均有10只小鼠。通过单变量输出ANOVA和Dunnett′s多重比较进行统计学分析。
(2)结果在带瘤组中，肿瘤的生长导致体重、附睾脂肪重量、腓肠肌重量和动物的湿重的显著下降。CD-NF、PS-NF和NF-KB诱饵组取得了改善。CD-NF组的改善要显著高于PS-NF或NF-KB组。但是，在M-NF和杂乱的诱饵组中则没有改善。M-NF或杂乱的诱饵组对肿瘤的重量没有明确的影响。
上述本发明的各种实施方式旨在阐述和说明本发明，其并非是穷举性的或是试图将本发明局限在所揭示的确定的形式内，根据以上教导，显然可以进行多种修改和变动。选择并描述这些实施方式的目的在于以最佳的方式解释本发明的原理及其实际应用，由此使得本领域人员能够根据预期的各种用途，采用各种实施方式以及各种修改，以便以最佳的方式实施本发明。本发明的范围以所附的权利要求书为准。所有在此引用的参考文献在此并入作为参考。
工业实用性本发明提供了一种包含两个环结构和一个茎结构的环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。本发明进一步提供了一种包含所述CDODN的药物组合物。所述药物组合物可用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症。本发明还提供了一种用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症的方法，其包含给患者施用治疗有效量的一种包含两个环结构和一个茎结构的CDODN，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
此外，本发明提供了通过抑制转录因子AP-1的反式激活能力而治疗血管成形术后再狭窄的方法和组合物。这些组合物和方法可用于治疗血管病变。本发明还提供了针对转录因子AP-1和E2F的新的环状哑铃状寡脱氧核苷酸诱饵(CDODN)，其可用于治疗AP-1和E2F相关性病变并可用于阐明这些转录因子在细胞内的作用。
序列表<110>安琪士多摩奇 株式会社<120>含有转录DNA结合位点的环状哑铃状诱饵寡脱氧核苷酸(CDODN)<130>JPSHU0377<140>
<141>
<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述AP-1诱饵<400>1agcttgtgag tcagaagct19<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述E2F诱饵<400>2atttaagttt cgcgcccttt ctcaa 25<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述CD-AP1<400>3ggatccatga ctcagaagac gacacacgtc ttctgagtca t 41<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述硫代磷酸酯线性AP-1诱饵ODN(PSODN)<400>4agcttgtgac tcagaagct19
<210>5<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述错配的AP-1诱饵ODN(MODN)<400>5ggatccaaat ctcagaagac gacacacgtc ttctgagatt 41<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列描述人工序列<220>
<223>CD-E2F<400>6ggatccgttt cgcgctattg caaaagcaat agcgcgaaac 40<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述硫代磷酸酯E2F诱饵(PS-E2F)<400>7atttaagttt cgcgcccttt ctcaa 25<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述突变的E2F诱饵(M-E2F)<400>8ggatccgttt cgatttattg caaaagcaat aaatcgaaac 40<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述NF-KB诱饵<400>9ccttgaaggg atttccctcc 20
<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述STAT-1诱饵<400>10gatctaggga tttccgggaa atgaagct 28<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述GATA-3诱饵<400>11agcttgagat agagct 16<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述STAT-6诱饵<400>12gatcaagacc ttttcccaag aaatctat 28<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述AP-1诱饵<400>13agcttgtgag tcagaagct 19<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Ets诱饵<400>14aattcaccgg aagtattcga 20
<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述CD-NF<400>15ggatccgggg atttctattg caaaagcaat agcgcgaaac 40<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PS-NF<400>16atttaagggg atttcccttt ctcaa 25<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述M-NF<400>17ggatccgggg atatttattg caaaagcaat aaatcgaaac 40<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述NF-KB诱饵(反向)<400>18ggaacttccc taaagggagg 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述杂乱的诱饵<400>19ttgccgtacc tgacttagcc 20
<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述杂乱的诱饵(反向)<400>20aacggcatgg actgaatcgg20
权利要求
1.一种环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其包含两个环结构和一个茎结构，其中所述茎结构包含一种能够结合一种转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
2.权利要求1的CDODN，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
3.权利要求1的CDODN，其包含通过酶性连接而共价连接的两个相同的茎环结构。
4.权利要求1的CDODN，其不含有任何化学修饰的核苷酸。
5.权利要求1的CDODN，其茎结构额外包含能够结合两种或更多的转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
6.权利要求1的CDODN，所述转录因子是AP-1。
7.权利要求6的CDODN，其中所述能够结合AP-1的DNA结合结构域的核苷酸序列是5′-TGACTCA-3′。
8.权利要求6的CDODN，其中每一个所述相同的茎环结构具有SEQID.NO.3的序列。
9.权利要求6的CDODN，其茎结构额外包含一种能够结合另一种转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
10.权利要求6的CDODN，经体外竞争结合分析测定，其具有的AP-1序列特异性比具有SEQ ID.NO.4的序列的硫代磷酸酯化的寡核苷酸高大约5倍。
11.权利要求1的CDODN，其中所述转录因子是E2F。
12.权利要求11的CDODN，其中所述能够结合E2F的DNA结合结构域的核苷酸序列是5′-TTTCGCGC-3′。
13.权利要求11的CDODN，其中每一个所述相同的茎环结构具有SEQ ID.NO.6的序列。
14.权利要求11的CDODN，经体外竞争结合分析测定，其具有的E2F序列特异性比具有SEQ ID.NO.7的序列的硫代磷酸酯化的寡核苷酸高大约5倍。
15.权利要求1的CDODN，其中所述转录因子是NFκB。
16.一种治疗或预防个体的与一种转录因子相关的疾病或病症的方法，其包含给该个体施用治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN，其中所述茎结构包含一种能够结合该转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
17.权利要求16的方法，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
18.权利要求16的方法，其中的药用可接受的载体是HVJ-脂质体组合物。
19.权利要求16的方法，其中所述转录因子是AP-1。
20.权利要求18的方法，其中所述与一种转录因子相关的疾病或病症包含个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
21.权利要求19的方法，其中所述CDODN的量足以预防个体发生再狭窄。
22.权利要求20的方法，其中所述化合物在血管损伤发生之前施用。
23.权利要求16的方法，其中所述转录因子是E2F。
24.权利要求23的方法，其中所述疾病或病症包含个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
25.权利要求23的方法，其中所述治疗有效量的CDODN有效预防个体发生再狭窄。
26.权利要求24的方法，其中所述CDODN在血管损伤发生之后施用。
27.权利要求16的方法，其中所述转录因子是NFκB。
28.权利要求16的方法，其中所述疾病或病症包含炎症性肠病。
29.一种用于治疗或预防个体的与一种转录因子相关的疾病或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN以及药用可接受的载体，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
31.权利要求29的药物组合物，其中所述药用可接受的载体是HVJ-脂质体组合物。
32.权利要求29的药物组合物，其中所述转录因子是AP-1。
33.权利要求29的药物组合物，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
34.权利要求29的药物组合物，其中所述CDODN的量足以预防个体发生再狭窄。
35.权利要求29的药物组合物，其中所述转录因子是E2F。
36.权利要求35的药物组合物，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述治疗有效量的CDODN有效预防个体发生再狭窄。
38.权利要求29的药物组合物，其中所述转录因子是NFκB。
39.权利要求29的药物组合物，其中所述疾病或病症包含炎症性肠病。
40.治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN在制备一种用于治疗或预防个体的与一种转录因子相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述茎结构包含一种能够结合所述转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
41.权利要求40的用途，其中所述转录因子选自NFκB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets或CRE。
42.权利要求40的用途，其中所述药物的形式为HVJ-脂质体组合物。
43.权利要求40的用途，其中所述转录因子是AP-1。
44.权利要求43的用途，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
45.权利要求43的用途，其中所述CDODN的量足以预防个体发生再狭窄。
46.权利要求40的用途，其中所述转录因子是E2F。
47.权利要求46的用途，其中所述疾病或病症是个体在血管损伤后出现的血管平滑肌细胞增殖或新内膜增生。
48.权利要求40的用途，其中所述治疗有效量的CDODN有效预防个体发生再狭窄。
49.权利要求40的用途，其中所述转录因子是NFκB。
50.权利要求46的用途，其中所述疾病或病症包含炎症性肠病。
全文摘要
本发明提供了一种环状哑铃状寡脱氧核苷酸(CDODN)，其包含两个环结构和一个茎结构，其中所述茎结构包含一种能够结合转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含所述的CDODN。所述药物组合物可用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症。本发明还提供了一种用于治疗和/或预防与该转录因子相关的疾病或病症的方法，其包含给个体施用治疗有效量的包含两个环结构和一个茎结构的CDODN，其中所述茎结构包含一种能够结合该转录因子的DNA结合结构域的核苷酸序列。
文档编号A61K31/70GK1665929SQ0282922
公开日2005年9月7日 申请日期2002年4月26日 优先权日2002年4月26日
发明者李仁奎, 森下龙一 申请人:安琪士多摩奇株式会社, 李仁奎