专利名称：利用精氨酸剥夺治疗人恶性肿瘤的药物组合物及方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物及其应用。具体地，本发明涉及能降低肿瘤患者体内精氨酸水平的药物组合物及其在治疗人恶性肿瘤中的应用。
背景技术：
精氨酸酶I(EC 3.5.3.1；L-精氨酸脒基水解酶)，是一种关键的哺乳动物肝脏酶，其催化尿素循环中尿素形成的最终步骤，将精氨酸转变为鸟氨酸和尿素。当具有高含量精氨酸酶的大鼠肝脏提取物被偶然加入到肿瘤细胞培养基中时发现其具有体外抗肿瘤性质(Burton等，1967，Cytolytic action of corticosteroids on thymus and lymphomacells in vitro.Can J.Biochem.1967 Feb，45(2)，289-297)。随后的实验示出所述酶的抗肿瘤作用是因为精氨酸耗竭(depletion)所致，精氨酸是培养基中的一种必需氨基酸。精氨酸低于8μM水平时，癌细胞发生不可回复的细胞死亡(Storr & Burton，1974，The effects of argininedeficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30，50)。
精氨酸的一个更新的方面集中在其作为潜在信号分子氧化氮(NO)合成的直接前体，NO作为一种神经递质，平滑肌松弛剂和血管扩张剂而起作用。NO的生物合成涉及由氧化氮合酶催化的Ca++及NADPH-依赖性反应。精氨酸的另一个公认的作用是其经鸟氨酸而作为多胺，亚精胺和精胺的前体，参与不同的生理过程，包括细胞增殖和生长。
精氨酸还是一些重要酶如氧化氮合酶(NOS)的底物。现有三种类型的NOS即nNOS，eNOS和iNOS，它们均能将精氨酸转变为氧化氮和瓜氨酸。例如由NO引起的面部发红是由nNOS介导的，nNOS是神经元类型NOS。iNOS即诱导型NOS由巨噬细胞产生，而且在败血病期间从精氨酸中如此产生的NO导致内毒性休克中血管舒张。eNOS即内皮NOS，由血管中的内皮细胞产生。其将精氨酸转变为NO，然后通过cGMP机制在内皮细胞表面引起血小板解聚集。从局部内皮细胞层中的eNOS产生的NO的半衰期为大约5秒，扩散距离为大约2微米。
这些酶的产生由分别在染色体12，17和7中编码的不同NOS基因(NOS1，NOS2，NOS3)控制。这些基因在外显子大小和剪接点位置方面呈现令人惊异的相似基因组结构。
精氨酸耗竭的体外抗肿瘤活性最近由英国苏格兰的一个研究小组证实(Scott等，2000，Single amino acid(arginine)deprivationrapidand selective death of cultured transformed and malignanat cells.Br.J.Cancer 83，800-810；Wheatley等，2000，Single amino acid(arginine)restrictionGrowth and Death of cultured Hela and Human DiploidFibroblasts.Cellular Physiol.Biochem.10，37-55)。在测试的24种不同的肿瘤细胞系中，所有细胞均在精氨酸耗竭5天内死亡，所述细胞系包括普通癌如乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，前列腺癌和卵巢癌细胞系。使用流式细胞术研究能示出正常细胞系在细胞周期G0期进入静止状态直至几周，而没有任何明显的伤害。然而，肿瘤细胞由于精氨酸缺乏而经过G1期的“R”点进入S期。精氨酸是一种不能替代的氨基酸，如果没有精氨酸时，蛋白质合成被扰乱。一些细胞系示出死于凋亡。更令人兴奋地，重复耗竭可以使肿瘤死亡而不产生“抗性”(Lamb等，2000，Single amino acid(arginine)deprivationinduces G1 arrest associated with inhibition of Cdk4 expression incultured human diploid fibroblasts.Experimental Cell Research 225，238-249)。
尽管体外数据很有前景，但在体内尝试精氨酸耗竭治疗癌症还未成功。最初Storr小组尝试用腹膜腔肝脏提取物治疗携带肿瘤的大鼠，但未获成功(Storr等，Br.J.Cancer 3050-59)。目前一般认为在正常生理条件下，血浆精氨酸水平及其它氨基酸水平同样保持在正常范围之间(100-120μM)，肌肉是主要调节物。面对氨基酸缺乏，胞内蛋白质分解途径被激活(蛋白酶体和溶酶体)，将氨基酸释放至循环中。这种氨基酸稳态机制(amino acid homeostatic mechanism)使多种氨基酸水平保持在恒定范围。因此，先前用多种物理方法或精氨酸降解酶耗竭精氨酸的尝试均失败了是因为机体的氨基酸稳态机制所致。
为克服机体的天然稳态倾向这一问题，Tepic等在美国专利6,261,557中阐述了一种治疗组合物及用于治疗癌症的方法，其中将一种精氨酸分解酶与一种蛋白质分解抑制剂如胰岛素组合使用，以防止机体的肌肉补充耗竭的精氨酸。
尽管胰岛素可以作为蛋白质分解抑制剂，但其对人体还具有深远的生理学作用，如果患者血糖水平不严格保持在有限的正常范围内则可以导致致命问题。因此本发明的一个目的是发现改良的用于治疗癌症的治疗方法和组合物。
发明概述因此，本发明提供了通过重组克隆和在一种选定的细菌菌株，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达而生产修饰的相对稳定的人精氨酸酶，特别是人精氨酸酶I的方法。而且，本发明提供了一种包含人精氨酸酶的药物组合物及用其治疗疾病，而不再与一种蛋白质分解抑制物组合使用。
本发明提供了一种分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其具有足够高的酶活性及稳定性以在患者体内维持“足够的精氨酸剥夺(adequate arginine deprivation)”(本文成为“AAD”)至少3天。
本文中，术语“分离的”指一种非天然的形式。术语“基本上纯化的”指至少大约95％，优选至少99％不含用于生产和/或修饰所述蛋白质的其它成分。
本文中，“基本上一样”，无论用于DNA的核苷酸序列、RNA的核糖核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列，都指与本文所揭示的序列具有很小的并且没有序列差异的序列。基本上一样的种类(species)被认为是所揭示的序列的等价物，并且其在所述权利要求的范围内。在这点上，“很小的并且没有序列差异的”指与所揭示的DNA、RNA或蛋白质基本上一样的序列和/或所要求保护的序列是本文所揭示的和/或要求保护的序列的功能等价物。功能等价物序列以基本上一样的方式生产与所本文揭示的和要求保护的核酸和氨基酸组合物基本上一样的组合物。特别地，功能等价物DNA编码的蛋白质与本文所揭示的一样，或与具有保守氨基酸变化的蛋白质一样，所述保守变化如非极性残基被取代为另一个非极性残基或一个带电残基被取代为一个相似的带电残基。这些变化包括本领域技术人员可识别的那些没有基本上改变蛋白质三级结构的变化。
本文中，术语“足够高的酶活性”指所述重组人精氨酸酶的酶特异活性为至少大约250U/mg，优选至少大约280U/mg，更优选至少大约300U/mg，及最优选至少大约330U/mg。在优选的实施方案中，所述分离纯化的重组人精氨酸酶具有大约330U/mg的特异活性。
本文中，术语“稳定性”指重组人精氨酸酶的体外(实施例9B描述)和体内(实施例9B描述)的稳定性。更优选地，所述稳定性指体内稳定性。酶活性降低的速率反比于所述分离纯化的重组人精氨酸酶的血清/血浆稳定性。这种人精氨酸酶在血清/血浆中的半衰期按照本领域已知的公式计算。
本文中，术语“足够的精氨酸剥夺”(AAD)指体内精氨酸水平在或低于10μM。
本文中，术语“半衰期”(1/2生命期)指所述分离的基本上纯化的重组人精氨酸酶无论在体内或体外的血清/血浆或其它体液中的浓度降低至一半所需的时间。
在优选的实施方案中，所述分离的和基本上纯化的重组人精氨酸酶在枯草芽孢杆菌中表达，并通过聚乙二醇化(pegylation)改良稳定性和最小化免疫反应性。聚乙二醇化的分离纯化的重组人精氨酸酶具有大约至少3天的血清/血浆半衰期和大约至少255U/mg的特异活性。
本发明提供了药物组合物，其包含分离的和基本上纯化的重组人精氨酸酶，所述酶具有足够高的酶活性及稳定性以在患者中维持AAD至少3天。这种重组人精氨酸酶如上述通过聚乙二醇化被进一步修饰以改良稳定性并最小化免疫反应性。
根据本发明的另一方面，本发明进一步提供了配制的药物组合物。
本发明的药物组合物的配方可以以固体、溶液、乳剂、分散体、胶束、脂质体等形式应用，其中所得配方含有一或多种本发明的修饰的人精氨酸酶作为活性成分，并与适于肠道或胃肠外应用的有机或无机载体或赋形剂混合。所述活性成分可以是分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶，例如，用具有通常无毒的、药物学可接受的载体的片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬液或任何其它适合的形式进行制备固体、半固体或液体形式的制备物。另外，可以使用佐剂(auxiliary agent)、稳定剂、thickening和coloring及香料。一或多种分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶的活性成分也包括在足够量的药物配方中以对目的过程、条件或疾病产生所希望的作用。
含有本文所述的活性成分的药物配方可以是适于口服的形式，例如，片剂、药片、止咳糖(lozenges)、水化或油化悬液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软的胶囊、或糖浆或西也剂(elixirs)。口服的配方可以按照本领域已知的任何制备药物配方的方法进行制备。片剂可以未包囊化(coated)或通过己知技术进行包囊化以减缓分解及在胃肠道的吸收，因而提供了较长时间的持续作用。其可以被包囊化以形成渗透性的控释治疗片剂。
在某些情况中，口服的配方可以是硬明胶胶囊的形式，其中活性成分和一种惰性固体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土等。其也可以是软明胶胶囊的形式，其中活性成分和水或一种油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
所述配方还可以是无菌的可注射溶液或悬液的形式。这个悬液可以是按照己知方法使用分散或润湿剂及悬浮剂进行配制。所述无菌的可注射制备物可以是在非毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶液中的无菌的可注射溶液或悬液，例如，1，4-丁二醇溶液。无菌固定油是常规使用的一种溶液或悬液介质。为此目的，可以使用任何刺激性小的固定油，包括合成的单或二酰甘油，脂肪酸(包括油酸)，天然的植物油如芝麻油，椰子油，花生油，棉花籽油，或合成的脂肪载体，如油酸乙酯等。缓冲液，葡萄糖溶液防腐剂，抗氧化剂等也可以掺入或用作溶质以溶解所述所需的可溶酶。
在本发明的另一方面中，提供了一种治疗疾病的方法，包括给予患者本发明的配制的药物组合物，以保持患者体内精氨酸水平在至少3天内低于10μM，而不需要其它蛋白质分解抑制剂。在一个优选的实施方案中，对非糖尿病患者不外源性给予胰岛素。本文中，术语“疾病”指任何病理状态，包括但不限于肝病和癌。
另外，本发明的治疗方法涉及监测患者的血液以进行血小板计数(优选保持在50,000×109以上)和凝血酶原时间(保持低于4倍正常值)。不外源性给予氧化氮产生剂，除非达到上述这些血小板计数水平和凝血酶原时间。
在本发明的优选实施方案中，聚乙二醇化修饰的分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶在间隔12小时的2个剂量中以1mg/kg进行超过1小时的短期输注(short infusion)。第2天，精氨酸酶输注是以2mg/kg/天进行24小时输注。精氨酸水平和精氨酸酶活性在精氨酸酶输注前每天测量两次。如果未达到AAD，下一次精氨酸酶的输注剂量提高20％直至达到AAD。AAD的最大耐受时间(maximumtolerated duration)定义为血压在控制之下(由治疗医生认为用或不用药物控制)时血小板计数在50,000×109之上及凝血酶原时间低于4倍正常值的时间。每日测定精氨酸水平，全血计数(CBC)和凝血酶原时间(PT)两次。在治疗期间至少隔天监测肝化学(liverchemistry)。
本发明的一个实施方案中，给予聚乙二醇化修饰的分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶以提高肝与碘化油(lipiodol)及明胶海绵栓塞后释放的内源精氨酸酶。
因此本发明提供了一种通过克隆及使用枯草芽孢杆菌表达的聚乙二醇化修饰的分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶，包含该酶的药物组合物，及使用其的方法。本发明的酶及其药物组合物足够稳定，具有适当的血清/血浆半衰期，可以有利地给予短期输注以便其在疗程中可以提供给门诊病人或在临床中减少费用。而且，本发明的酶及其药物组合物具有足够高的活性以在没有外源给予的蛋白质降解酶如胰岛素时被用作单一的药物。
附图简述
图1示出pAB101的质粒图。这个质粒携带编码精氨酸酶的基因(arg)，而且只在大肠杆菌(E.coli)中复制，不在枯草芽孢杆菌中复制。
图2A和2B示出人精氨酸酶的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。
图2A示出质粒pAB101的EcoRI/MunI至XbaI位点的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。核苷酸(nt)1-6，EcoRI/MunI位点；nt 481-486，启动子1的-35区域；nt 504-509，启动子1的-10区域；nt 544-549，启动子2的-35区域；nt 566-571，启动子2的-10区域；nt 600-605，核糖体结合位点；nt 614-616，起始密码子；nt 632-637，NdeI位点；nt 1601-1603，终止密码子；nt 1997-2002，XbaI位点。
图2B示出人精氨酸酶的编码核苷酸序列(SEQ ID NO2)及其相应编码的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。图2A中核苷酸614-1603是精氨酸酶氨基酸序列的编码区。N末端的6组氨酸(SEQ ID NO4)标记以下划线标示。翻译终止密码子以*标示。
图3是构建可表达精氨酸酶的枯草芽孢杆菌原噬菌体(prophage)的示意图。
图4示出在2L发酵罐中重组枯草芽孢杆菌原噬菌体菌株的发酵时程。图4A示出得自分批发酵(batch fermentation)的结果。图4B示出得自补料分批发酵(fed-batch fermentation)的结果。
图5示出发酵史图，示出参数的变化如温度，搅拌速度，pH和溶解氧的数值。图5A示出分批发酵的史图。图5B示出补料分批发酵的史图。
图6A和6B示出在热激(heat shock)后3小时通过第一个5mlHiTrap螯合柱对人精氨酸酶进行生物化学纯化后的结果。图6A示出FPLC运行参数和蛋白质洗脱图。图6B示出从所述柱中收集的5μl11-31各级分的SDS-PAGE(12％)分析。蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围的标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。
图7A和7B示出在热激后3小时通过第二个5ml HiTrap螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图7A示出FPLC运行参数及蛋白质洗脱图。图7B示出从所述柱收集的1μl 9-39各级分的SDS-PAGE(12％)分析。蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。
图8A和8B示出在热激后6小时通过第一个5ml HiTrap螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图8A示出FPLC运行参数及蛋白质洗脱图。图8B示出从所述柱收集的2.5μl 10-32各级分的SDS-PAGE(12％)分析。蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。
图9A和9B示出在热激后6小时通过第二个5ml HiTrap螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图9A示出FPLC运行参数及蛋白质洗脱图。图9B示出从所述柱收集的2μl 8-E6各级分的SDS-PAGE(12％)分析。蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,40。
图10示出当在较高细胞密度进行热激时细菌细胞生长的时程。当培养密度(OD600nm)为大约25时，在8小时进行热激。
图11是当在较高细胞密度进行热激时补料分批发酵的史图。这个图示出参数变化如温度，搅拌速度，pH和溶解氧数值。
图12A和12B示出在热激6小时后(在OD25的较高细胞密度)，通过第一个5ml HiTrap螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图12A示出FPLC运行参数和蛋白质洗脱图。图12B示出从所述柱中收集的5μl 16-45每种级分的SDS-PAGE(12％)分析结果。将蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围的标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。泳道“粗提物”5μl上柱之前的细胞粗提物。
图13A和13B示出在热激后6小时(在OD25的较高细胞密度)，通过第二个5ml HiTrap螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图13A示出FPLC运行参数和蛋白质洗脱图。图13B示出从所述柱中收集的5μl 7-34每种级分的SDS-PAGE(12％)分析结果。将蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围的标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。
图14示出在热激后6小时(在OD25的较高细胞密度)，通过第一个1ml HiTrap SP FF螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图14A示出FPLC运行参数和蛋白质洗脱图。图14B示出从所述柱中收集的5μl A11-B7每种级分的SDS-PAGE(12％)分析结果。将蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围的标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(到道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。。
图15示出在热激后6小时(在较高细胞密度)，通过第二个1ml HiTrap SP FF螯合柱对人精氨酸酶进行纯化的结果。图15A示出FPLC运行参数和蛋白质洗脱图。图15B示出从所述柱中收集的5μlA6-B12每种级分的SDS-PAGE(12％)分析结果。将蛋白质凝胶用考马斯亮蓝染色，并脱色以示出蛋白质条带。泳道M低分子量范围的标记(1μg/条带；Bio-Rad)，MW(道尔顿)97,400；66,200；45,000；31,000；21,500；14,400。
图16是对用mPEG-SPA(MW 5,000)修饰的人精氨酸酶进行的SDS-PAGE(15％)分析，所用精氨酸酶与PEG的摩尔比率为1∶50。图16A示出当在冰上进行反应时的结果。泳道1低分子量范围蛋白质标记；泳道2未加入PEG的精氨酸酶(5.35μg)(对照组)；泳道3反应后1小时；泳道4反应后0.5小时；泳道5反应后2小时；泳道6反应后3小时；泳道7反应后4小时；泳道8反应后5小时；泳道9反应后23小时。图16B示出在室温进行反应的结果。泳道1低分子量范围蛋白质标记；泳道2未加入PEG的精氨酸酶(5.35μg)(对照组)；泳道3反应后1小时；泳道4反应后0.5小时；泳道5反应后2小时；泳道6反应后3小时；泳道7反应后4小时；泳道8反应后5小时；泳道9反应后23小时。
图17是对用mPEG-SPA(MW 5,000)修饰的人精氨酸酶进行的SDS-PAGE(15％)分析，所用精氨酸酶与PEG的摩尔比率为1∶20。图17A示出当在冰上进行反应时的结果。泳道1低分子量范围蛋白质标记；泳道2未加入PEG的精氨酸酶(5.35μg)(对照组)；泳道3反应后1小时；泳道4反应后0.5小时；泳道5反应后2小时；泳道6反应后3小时；泳道7反应后4小时；泳道8反应后5小时；泳道9反应后23小时。图17B示出在室温进行反应的结果。泳道1低分子量范围蛋白质标记；泳道2未加入PEG的精氨酸酶(5.35μg)(对照组)；泳道3反应后1小时；泳道4反应后0.5小时；泳道5反应后2小时；泳道6反应后3小时；泳道7反应后4小时；泳道8反应后5小时；泳道9反应后23小时。
图18是对用mPEG-CC(MW 5,000)修饰的人精氨酸酶进行的SDS-PAGE(15％)分析。将反应在冰上进行。泳道1低分子量范围蛋白质标记；泳道2未加入PEG的精氨酸酶(5.35μg)(对照组)；泳道3用1∶50摩尔比率的精氨酸酶∶PEG反应后2小时；泳道4空白；泳道5用1∶50摩尔比率的精氨酸酶∶PEG反应后23小时；泳道6用1∶20摩尔比率的精氨酸酶∶PEG反应后2小时；泳道7用1∶20摩尔比率的精氨酸酶∶PEG反应后5小时；泳道8用1∶20摩尔比率的精氨酸酶∶PEG反应后23小时。
图19示出分离的重组人精氨酸酶纯度的测定。图19A示出泳道1得自Ikemoto等所述方法(Ikemoto等1990，Biochem.J.270，697-703)的5μg纯化的大肠杆菌表达的重组人精氨酸酶。泳道2得自本发明方法的5μg纯化的枯草芽孢杆菌表达的重组人精氨酸酶。图19B示出用Lumi-imagerTM的Lumianalyst 32程序(Roche MolecularBiochemicals)对图19A中所示蛋白质条带的密度分析。上方图19A的泳道1的结果。下方图19A的泳道2的结果。
图20是聚乙二醇化修饰的分离的并基本上纯化的重组人精氨酸酶在人血清中的体外稳定性示意图。
图21A和21B示出得自实施例8A的mPEG-CC聚乙二醇化的分离并纯化的重组人精氨酸酶在体内的半衰期测定。图21A示出根据本发明方法生产的聚乙二醇化修饰的重组人精氨酸酶的体内活性，使用实施例9A所述活性测试测得。图21B是测定聚乙二醇化精氨酸酶的第一次半衰期和第二次半衰期的示意图。
图22A和22B是表示按照本发明另一个方面每天短期输注(图22A)或连续输注(图22B)外源给予一种聚乙二醇化修饰的分离并纯化的重组人精氨酸酶的治疗方案的示意图。
图23是示出外源给予分离并纯化的重组人精氨酸酶以提高肝栓塞作用的治疗方案的示意图。
详细描述在2001年早些时候，本发明人观测到肝细胞癌(HCC)自发暂时消退的三个病例。所有这三个患者均自发HCC破裂，导致血性腹膜炎(haemoperitoneum)。在一个病例中，发现血浆精氨酸水平低至3μM，腹水中精氨酸水平为7μM。这些患者在未使用任何药物治疗的情况下，其肝脏肿瘤在破裂性肝脏损伤后均自发消退，同时AFP正常化。一个患者其HCC消退6个月以上。根据本发明，确信这种消退是由于内源精氨酸酶从破裂的肝脏自发释放至腹膜所致。
本发明人设计了一系列实验，示出经肝动脉栓塞(transhepticarterial embolisation)后内源的肝精氨酸酶可以从肝脏中释放，导致全身性精氨酸剥夺。这已经在美国临时专利申请60/351816中提请专利，该申请并入本文作为参考。在本发明人设计的实验中，发现在具有不可切除的转移的HCC的患者中，在使用导致暂时肝灌注缺陷的碘化油及明胶海绵对肝动脉栓塞治疗后，发现少量可测量的内源肝精氨酸酶释放至体循环中。在治疗方案中加入高剂量胰岛素输注以提高释放的内源精氨酸酶的药理作用。在所治疗的一系列6个HCC病例中，有4个肝癌肝外消退(extra hepatic remission)，提示所述治疗作用是全身性的。一个患者经CT和PET放射线检查其肝脏和肝外疾病(腹腔腺病)持续完全消退。其AFP水平在3周内降至正常，而且持续4个月以上。间隔4个月的CT示出肝脏和肝外均无可证实的肿瘤。在栓塞4周后经PET检查，其它3个患者其肝外疾病均消退(一个是肺部，一个是肠系膜/腹膜后/骨病，一个是腹膜后腺病)。在2小时-2天的时间内测试其精氨酸酶活性和精氨酸水平，所有患者均示出足够的精氨酸耗竭。事实上，AAD的持续时间与肝脏和肝外肿瘤消退的程度和持续时间密切相关。
尽管经肝动脉栓塞技术与高剂量胰岛素输注联合进行，然而本发明人根据本发明随后认识到需要给予胰岛素是因为这样的事实，即释放至患者全身的精氨酸酶活性不足，由此来自肌肉的任何蛋白质降解均具有对精氨酸剥夺的补偿性作用，并导致治疗无效。根据本发明，本发明人意识到为改良治疗及消除与精氨酸剥夺治疗联合的胰岛素给药的需求，患者系统中必需存在足够高数量的精氨酸酶活性，以抵消来自肌肉的任何蛋白质降解。根据本发明，本发明人因此致力于生产一种精氨酸酶，其具有足够高的酶活性和稳定性，以在患者体内保持10μM以下的“足够的精氨酸剥夺(本文称为AAD)”，而不需要给予高剂量的胰岛素。
精氨酸的全身性耗竭可以引起与氧化氮缺乏相关的其它不希望的副作用。这些副作用包括由于缺乏NO对血管内皮的血管扩张作用所致高血压，由于缺乏NO及与细胞分裂暂时停止相关的早期凝血因子耗竭所致血小板聚集和血小板减少。然而，本发明人验证了在氧化氮剔除的小鼠中，动物无高血压而且具有正常血小板计数的正常预期寿命。因此，根据本发明的另一方面及在具有血小板减少症的患者中，直至血小板计数低于50,000×109仍未见明显的出血倾向。在具有出血(thrombotic)倾向的患者中，所进行的治疗必需使凝血时间延长至正常的4倍。
以下详述的实施例教导怎样生产和使用本发明的高稳定和活性的重组人精氨酸酶。实施例1阐述了含有人精氨酸酶I基因的枯草芽孢杆菌LLC101的重组菌株的构建。随后是重组枯草芽孢杆菌的发酵的两个实施例。在重组LLC101细胞的初始发酵实验中，进行了分批发酵和补料分批发酵。发现在分批条件下，不能达到足够高的细胞密度。只有在特异的补料分批条件下，细胞密度可以提高至10OD(光密度)以上。这些实验和结果示于实施例2A和2B。两种发酵方法的对比示于实施例3。因此选择补料分批发酵产生分离的和纯化的重组人精氨酸酶。
LLC101菌株是一种热敏菌株，其使重组人精氨酸酶在50℃热激下表达。在初始的优化实验中，在不同细胞密度进行热激处理以获得产生最大量分离的及纯化的重组人精氨酸酶的最佳条件。实施例5和6阐述了纯化方法及在12.8和25这两种不同OD(在600nm的光密度)进行热激的两种不同的补料分批发酵获得的纯精氨酸酶产量。所述实验数据示出尽管所有热激均在LLC101的指数生长期期间进行，但在较低细胞密度例如12.8OD进行热激产生较好的结果。
热激后分离的及纯化的重组人精氨酸酶的最大程度表达条件也通过改变热激后收获时间而优化。实施例4示出在热激后3小时收获细胞及使用补料分批发酵方法的结果。
实施例5阐述了在细胞密度为12.8OD热激后6小时分离的及纯化的重组人精氨酸酶的纯化。实施例6阐述在细胞密度为25OD热激后6小时分离的重组人精氨酸酶的纯化。实施例7示出在不同收获和纯化条件下分离的及纯化的重组人精氨酸酶产量的对比数据。这些数据示出在12.8的较低细胞密度热激后6小时收获细胞产生较高产率的精氨酸酶，产率为132mg/L。
对所述分离的及纯化的重组人精氨酸酶进行修饰以改良稳定性。实施例8A示出聚乙二醇化分离的及纯化的重组人精氨酸酶的一种方法，使用氰尿酰氯(cc)作为交联剂，以1∶140(精氨酸酶∶PEG)摩尔比率进行。实施例8B阐述了一种不同的聚乙二醇化方法，其中向含有酶的反应混合物中加入更低比例的交联剂。对cc和丙酸的琥珀酰亚胺(SPA)作为交联剂均进行了测试。实验结果示出实施例8B所述使用SPA的方法提供一种聚乙二醇化精氨酸酶，其半衰期为3天，比活性为大约255U./mg，如实施例10所述。
使用上述方法已经产生了高稳定性和活性的重组人精氨酸酶，其具有足够高的活性和稳定性以治疗患者，而不用使用蛋白质降解抑制剂，因为由肌肉补充的任何精氨酸均会由全身性分离的及纯化的重组人精氨酸酶迅速除去。因此，可以达到低于10μM的足够的精氨酸剥夺而不用大剂量外源施用胰岛素。使用本发明分离的及纯化的重组人精氨酸酶的多种治疗方法见实施例11和12所述。
以上引用的所有参考文献在此均并入作为参考，以阐述本发明。本发明的实践在以下非限制性实施例中得以示出。本发明的范围仅由所附权利要求限定，实施例没有限制本发明内容或范围之意。
实施例实施例1构建重组菌株LLC101(a)分离编码人精氨酸酶I的基因人精氨酸酶I的基因序列公布于1987年(Haraguchi，Y.等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84，412-415)，基于该序列设计引物。使用Expand高保真PCR系统试剂盒(Roche)进行聚合酶链反应(PCR)以分离编码人精氨酸酶的基因。引物Arg1(5’-CCAAACCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATA-3’)(SEQ ID NO5)和Arg2(5’-CCAAACTCTAGAATCACATTTTTTGAATGACATGGACAC-3’)(SEQID NO6)购自Genset Singapore Biotechnology Pte Ltd.。这两个引物具有相同解链温度(Tm)72℃。引物Arg1含有一个NdeI限制酶识别位点(下划线)，引物Arg2含有一个XbaI位点(下划线)。将这两个引物(各自终浓度为300nM)加入到一个0.2ml小试管中的5μl人肝脏5’stretch plus cDNA文库中(Clontech)。另外加入DNA聚合酶(2.6单位，0.75μl)，4种脱氧核糖核苷酸(各自为4μl，各自终浓度为200μM)和反应缓冲液(5μl)及dH2O(17.75μl)。使用以下条件进行PCR预-PCR(94℃，5分钟)，25次PCR循环(94℃，1分钟；57℃，1分钟；72℃，1分钟)，后-PCR(72℃，7分钟)。将PCR产物(5μl)在0.8％琼脂糖凝胶上分析，观测到一个1.4kb条带。这个DNA含有编码精氨酸酶的基因。
(b)分离质粒pSG1113质粒pSG1113是质粒pSG703的衍生物(Thornewell，S.J.等，1993，Gene，133，47-53)，将其通过使用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega)根据使用说明书，从携带pSG1113的大肠杆菌DH5α克隆中分离。这个质粒只在大肠杆菌中复制，在枯草芽孢杆菌中不复制，将其用作亚克隆所述精氨酸酶基因的载体。
(c)将所述1.4kb PCR产物亚克隆入质粒pSG1113中以形成质粒pAB101将使用上述方法制备的PCR产物用限制性内切酶NdeI和XbaI(Promega)在反应介质中于37℃处理1.5小时，所述介质由6mMTris-HCl(pH 7.9)，6mM MgCl2，150mM NaCl，1mM DTT组成。在处理完成后，将反应混合物进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，并使用QiaexII凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中回收1.4kb DNA片段。将质粒pSG1113用相同限制性内切酶以相同方式处理。处理完成后，将反应混合物进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，并从该凝胶中回收大约3.5kb大小的一个DNA片段。使用T4 DNA连接酶将该DNA片段与上述1.4kb DNA片段连接。该连接混合物用于转化大肠杆菌XLI-Blue，使用常规钙方法进行(Sambrook，J.等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约1989)，并铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素的营养琼脂平板上。筛选菌落，获得通过限制分析具有适当插入片段的质粒。该质粒构建体称为pAB101(图1)。用引物Arg1(SEQ ID NO5)，Arg2(SEQ ID NO6)和Arg6(5’-CTCTGGCCATGCCAGGGTCCACCC-3’)(SEQ ID NO7)进行DNA测序，以证实该编码精氨酸酶的基因(图2)。
(d)构建新的重组枯草芽孢杆菌原噬菌体菌株LLC101使用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega)，从携带pAB101的克隆中提取质粒pAB101并纯化。在质粒pAB101中(图1)，所述精氨酸酶基因的两侧为0.6kb MunI-NdeIφ105噬菌体DNA片段和cat基因(图3)。这个质粒DNA(1μg)用于转化感受态枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)，根据已知方法进行转化(Anagnostopoulos C.和Spizizen J.，1961，J.Bacteriol.81，741-746)。所述枯草芽孢杆菌菌株1A304(φ105MU331)得自J.Errington(Thornewell，S.等，1993，Gene 133，47-53)。该菌株根据以下出版物所述方法产生Thornewell，S.等，1993，Gene 133，47-53及Baillie，L.W.J.等，1998，FEMS Microbiol.Letters 163，43-47，这两篇文献以其全文并入本文作参考。将质粒pAB101(划线处所示)转化入具有选择标记CmR的枯草芽孢杆菌菌株1A304(φ105MU331)中，并对所述转化体筛选ErS表型。这种转化体应已经从双交换事件中产生，如示，精氨酸酶基因(arg)的转录置于强噬菌体启动子控制下。粗线表示原噬菌体基因组，虚线表示枯草芽孢杆菌染色体，细线表示质粒DNA。所述基因以黑箭头指示转录和翻译方向。同源区域用垂直虚线标示界限，而且同源重组事件用“X”表示。
将600μl转化的细胞铺板于含有氯霉素(5μg/ml)的琼脂平板上，从中获得52个氯霉素抗性(CmR)菌落。随机选择10个菌落，并在含有红霉素(20μg/ml)的琼脂平板上划线，这些菌落有一个不生长，表示其是红霉素敏感的(ErS)。因此分离这个氯霉素抗性但红霉素敏感的菌落，并命名为LLC101。在这个新构建的原噬菌体菌株染色体中，红霉素抗性基因在同源重组中通过双交换由精氨酸酶基因置换。0.6kb MunI-NdeIφ105噬菌体DNA片段和cat基因提供了用于进行重组的同源序列。以这种方式，精氨酸酶基因被导向至枯草芽孢杆菌1A304(φ105MU331)的原噬菌体DNA中的表达位点，并使所述精氨酸酶基因处于强温度诱导启动子(Leung，Y.C.和Errington，J.，1995，Gene 154，1-6)的控制下。
枯草芽孢杆菌LLC101细胞的发酵实施例2A在2L发酵罐中分批发酵将枯草芽孢杆菌LLC101菌株维持在当需要时补加了80mg/L的氨苄青霉素或5mg/L氯霉素的营养琼脂(牛肉膏1g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L及琼脂20g/L)平板上。为制备分批发酵和补料分批发酵的接种物，将上述菌株的几个菌落从刚制备的营养琼脂平板中移至两个1L烧瓶中，每个烧瓶含有80ml发酵培养基，所述培养基含有葡萄糖5g/L，胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L，柠檬酸1g/L，KH2PO41.5g/L，KH2PO41.5g/L及(NH4)2SO43g/L。将细菌细胞培养物在37℃和pH 7.0下，在一个轨道摇床中以250r.p.m培养。在生长大约9-11小时，OD600达到5.5-6.0时，停止培养。然后将160mL这种培养液导入2L发酵罐中，所述发酵罐中含有1440mL发酵培养基(葡萄糖5g/L，胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L，柠檬酸1g/L，KH2PO41.5g/L，KH2PO41.5g/L及(NH4)2SO43g/L)。在37℃进行分批发酵。通过加入氢氧化钠和盐酸将pH控制在7.0。通过调节搅拌速度将溶解氧浓度控制在20％空气饱和度。当培养物密度(OD600nm)为大约3.9时，在3.25小时进行热激。在热激期间，发酵罐的温度从37℃提高至50℃，然后立即冷却至37℃。完成加热和冷却循环需要大约0.5小时。在热激后3.5小时，培养物的OD达到6.0的最大值。在热激后9小时收获细胞以分离和纯化精氨酸酶。在热激后9小时，上述菌株产生活性人精氨酸酶的量为大约3.0mg/L发酵培养基。发酵时程示于图4A。示出参数的变化，如温度，搅拌速度，pH和溶解氧值的该分批发酵的史图示于图5A。
实施例2B在2L发酵罐中补料分批发酵在37℃，pH7.0和溶解氧为20％空气饱和度下进行补料分批发酵。接种方法与实施例2A所述分批发酵中所用方法相似。最初，生长培养基与实施例2A所述分批发酵中所用培养基相同。流加培养基(feeding medium)含有200g/L葡萄糖，2.5g/L MgSO4·7H2O，50g/L胰化蛋白胨，7.5g/L K2HPO4和3.75g/L KH2PO4。培养基进料速度用pH-stat控制策略控制。在这个策略中，调节进料速度以代偿由葡萄糖耗竭而产生的pH提高。在发酵大约4.5小时，当葡萄糖浓度降至非常低水平时，第一次进行这个控制策略。如果pH＞7.1，将4mL流加培养基导入发酵罐中。在加入葡萄糖后，pH值立即迅速降低至7.1以下。在大约10分钟后，当加入的葡萄糖完全被细菌细胞消耗后，pH值提高至7.1以上，表示在发酵罐中应该再加入另外4ml流加培养基。当培养物密度(OD600nm)在12.0-13.0之间时，在5-6小时进行热激。在热激期间，发酵罐的温度从37℃提高至50℃，然后立即冷却至37℃。完成加热和冷却循环需要大约0.5小时。在热激后3和6小时收获细胞以分离和纯化精氨酸酶。在热激后6小时，上述菌株产生活性人精氨酸酶，数量为至少大约132mg/L发酵培养基。发酵时程示于图4B。示出参数变化如温度，搅拌速度，pH和溶解氧值的该补料分批发酵的史图示于图5B。
实施例3分批发酵和补料分批发酵的对比下表1对比了分批发酵和补料分批发酵的结果，对比表明补料分批发酵比分批发酵在培养物OD，精氨酸酶产量和产率方面更胜一筹。
表1
实施例4在低细胞密度补料分批发酵后，在热激后3小时纯化精氨酸酶如实施例2B所述在2L发酵罐中进行补料分批发酵。以30或60分钟间隔监测补料分批培养的细胞密度，在开始发酵后5.5小时当培养OD达到12.8时，将培养温度提高至50℃进行热激(见图4B和图5B)。
将在热激后3小时收集的细胞培养物(470ml)在4℃以5,000rpm离心20分钟以沉淀细胞。细胞的湿重为15.1g。弃去培养上清并将细胞沉淀贮存于-80℃。在此温度细胞可稳定几天。为提取胞内蛋白质，将细胞沉淀重悬于140ml溶解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.1M NaCl，5mM MnSO4，溶菌酶(75μg/ml)]中。在30℃温育15分钟后，将混合物使用Soniprep 150仪器(MSE)以2分钟间隔超声8次，每次持续10秒(共80秒)。加入大约500单位脱氧核糖核酸酶I(Sigma D 4527)，并将该混合物在37℃温育10分钟，以消化染色体DNA。在4℃以10,000rpm离心20分钟后，测定含有蛋白质粗提物的上清中精氨酸酶活性存在情况，并通过SDS-PAGE(Laemmli，1970，Nature 227，680-685)分析。
将一个5-ml HiTrap螯合柱(Pharmacia)用5个柱体积的在dH2O中的0.1M NiCl2平衡。将蛋白质粗提物(140ml)加样于柱中。用线性梯度(0-100％)以5ml/分钟流速在以下条件下洗脱15个柱体积，所述条件是缓冲液A＝起始缓冲液
；缓冲液B＝含有0.5M咪唑的起始缓冲液。洗脱图示于图6A，蛋白质凝胶示于图6B。合并级分13-20(16ml)，并用起始缓冲液
稀释10倍。将其加样于第二个5-ml HiTrap螯合柱中(Pharmacia)，重复上述相同步骤。洗脱图示于图7A，蛋白质凝胶示于图7B。合并含有精氨酸酶的级分12-30(38ml)，使用50-ml HiPrep 26/10脱盐柱(Pharmacia)，在以下条件下除去盐流速＝10ml/分钟，缓冲液＝10mM Tris-HCl(pH 7.4)，洗脱长度＝1.5柱体积。通过Bradford所述方法(Bradford，M.M.，1976，Anal.Biochem.，72，248-254)测定蛋白质浓度。从470ml细胞培养物中纯化共56.32mg的精氨酸酶。纯化的精氨酸酶产量估计为119.8mg/l细胞培养物或3.73mg/g细胞湿重。
实施例5在低细胞密度补料分批发酵后，在热激后6小时纯化精氨酸酶如实施例4所述在一个2L发酵罐中进行补料分批发酵。将在OD12.8热激后6小时收集的细胞培养物(650ml)在4℃，以5,000rpm离心20分钟以沉淀细胞。细胞湿重为24g。弃去培养上清，并将细胞沉淀贮存于-80℃。细胞在此温度会稳定几天。为提取胞内蛋白质，将细胞沉淀重悬于140ml溶解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.4)，0.1M NaCl，5mM MnSO4，溶菌酶(75μg/ml)]中。在30℃温育15分钟后，将混合物使用Soniprep 150仪器(MSE)以2分钟间隔超声8次，每次持续10秒(共80秒)。加入大约500单位脱氧核糖核酸酶I(Sigma D 4527)，并将该混合物在37℃温育10分钟，以消化染色体DNA。在4℃以10,000rpm离心20分钟后，测定含有蛋白质粗提物的上清中的精氨酸酶活性存在情况，并通过SDS-PAGE(Laemmli，1970，Nature 227，680-685)分析。
将一个5-ml HiTrap螯合柱(Pharmacia)用5个柱体积的在dH2O中的0.1M NiCl2平衡。将蛋白质粗提物(140ml)加样于柱中。用线性梯度(0-100％)以5ml/分钟流速在以下条件下洗脱15个柱体积，所述条件是缓冲液A＝起始缓冲液
；缓冲液B＝含有0.5M咪唑的起始缓冲液。洗脱图示于图8A，蛋白质凝胶示于图8B。合并级分13-24(24ml)，并用起始缓冲液
稀释10倍。将其加样于第二个5-ml HiTrap螯合柱中(Pharmacia)，重复上述相同步骤。洗脱图示于图9A，蛋白质凝胶示于图9B。合并含有精氨酸酶的级分12-24(26ml)，使用50-ml HiPrep 26/10脱盐柱(Pharmacia)，在以下条件下除去盐流速＝10ml/分钟，缓冲液＝10mM Tris-HCl(pH 7.4)，洗脱长度＝1.5柱体积。通过Bradford所述方法(Bradford，M.M.，1976，Anal.Biochem.72，248-254)测定蛋白质浓度。从650ml细胞培养物中纯化共85.73mg的精氨酸酶。纯化的精氨酸酶产量估计为132mg/l细胞培养物或3.57mg/g细胞湿重。
实施例6在较高细胞密度热激后6小时纯化精氨酸酶在这个特定补料分批发酵中，程序与上述实施例所述相似，除了热激在8小时、培养密度(OD600nm)为大约25时进行。在热激期间，发酵罐的温度从37℃提高至50℃，然后立即冷却至37℃。完成这一加热和冷却循环需要大约0.5小时。在热激后6小时收获一部分细胞培养物(760ml)以分离和纯化精氨酸酶。此发酵中细菌细胞生长时程示于图10。示出参数变化如温度，搅拌速度，pH和溶解氧值的该补料分批发酵的史图示于图11。
将在热激后6小时收集的细胞培养物(760ml)在4℃，以5,000rpm离心20分钟以沉淀细胞。细胞湿重为32g。弃去培养上清，并将细胞沉淀贮存于-80℃。细胞在此温度能稳定几天。为提取胞内蛋白质，将细胞沉淀重悬于280ml溶解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.1M NaCl，5mM MnSO4，溶菌酶(75μg/ml)]中。在30℃温育15分钟后，将混合物使用Soniprep 150仪器(MSE)以2分钟间隔超声8次，每次持续10秒(共80秒)。加入大约500单位脱氧核糖核酸酶I(Sigma D 4527)，并将该混合物在37℃温育10分钟，以消化染色体DNA。在4℃以10,000rpm离心20分钟后，测定含有蛋白质粗提物的上清中精氨酸酶活性存在情况，并通过SDS-PAGE(Laemmli，1970，Nature 227，680-685)分析。
将一个5-ml HiTrap螯合柱(Pharmacia)用5个柱体积的于dH2O中的0.1M NiCl2平衡。将蛋白质粗提物(280ml)加样于柱中。用线性梯度(0-100％)以5ml/分钟流速在以下条件下洗脱15个柱体积，所述条件是缓冲液A＝起始缓冲液
；缓冲液B＝含有0.5M咪唑的起始缓冲液。洗脱图示于图12A，蛋白质凝胶示于图12B。合并级分17-31(30ml)，并用起始缓冲液
稀释10倍。将其加样于第二个5-ml HiTrap螯合柱中(Pharmacia)，重复上述相同步骤。洗脱图示于图13A，蛋白质凝胶示于图13B。合并含有精氨酸酶的级分10-20(22ml)，使用50-ml HiPrep 26/10脱盐柱(Pharmacia)，在以下条件下除去盐流速＝10ml/分钟，缓冲液＝10mM Tris-HCl(pH 7.4)，洗脱长度＝1.5柱体积。然后将样品加样于1-ml HiTrap SP FF柱(Pharmacia)中，在以下条件下进行洗脱流速＝1ml/分钟，缓冲液A＝10mM Tris-HCl(pH 7.4)，缓冲液B＝含有1M NaCl的10mM Tris-HCl(pH 7.4)，线性梯度(0-100％)，洗脱长度＝30柱体积。洗脱图示于图14A，蛋白质凝胶示于图14B。合并级分A12-B7(7ml)并用起始缓冲液
稀释10倍。将该样品加样于第二个1-ml HiTrap SP FF柱(Pharmacia)中，除了用分段梯度(segmented gradient)进行洗脱之外重复上述相同步骤。洗脱图示于图15A，蛋白质凝胶示于图15B。合并级分A7-B12(7ml)，并使用50-ml HiPrep 26/10脱盐柱(Pharmacia)脱盐。通过Bradford所述方法(Bradford，M.M.，1976，Anal.Biochem.72，248-254)测定蛋白质浓度。从760ml细胞培养物中纯化共41.61mg的精氨酸酶。纯化的精氨酸酶产量估计为55.5mg/l细胞培养物或1.3mg/g细胞湿重。
实施例7在不同条件下收获和纯化的分离纯化的重组人精氨酸酶产率对比下表2示出在不同收获和纯化条件下产生的分离纯化的重组人精氨酸酶产率的对比。这些数据示出在12.8这个较低细胞密度热激后6小时收获的细胞产生较高产率132mg/L的精氨酸酶。
表2
实施例8A使用氰尿酰氯(CC)制备聚乙二醇化的酶将50mg精氨酸酶溶解于20ml PBS缓冲溶液(pH 7.4)中至终浓度为2.5mg/ml。在60℃对精氨酸酶加热激活10分钟。在激活后，将酶的温度降至室温。将1g氰尿酰氯激活的聚乙二醇(mPEG-CC)(MW＝5000，Sigma)以1∶140摩尔比率(Arginase∶PEG)加入精氨酸酶中。使用磁性搅拌棒搅拌该混合物，直至所有聚乙二醇(PEG)均溶解。
当所有PEG均溶解时，将PEG-精氨酸酶混合物的pH用0.1NNaOH调节为9.0，进一步加入NaOH将pH在9.0进一步保持30分钟。通过加入0.1N HCl将pH调节为7.2而终止聚乙二醇化。
将聚乙二醇化精氨酸酶在4℃用2-3升PBS缓冲溶液pH 7.4透析以除去过量的PEG，使用Hemoflow F40S毛细管透析器进行(Fresenius Medical Care，德国)透析。在透析后，回收聚乙二醇化精氨酸酶并再次调节终浓度。
将聚乙二醇化精氨酸酶通过一个0.2μm滤膜过滤至一个无菌容器中，并在4℃贮存。这种酶在病人体内的半衰期经测试为大约6小时(见图21)。
实施例8B制备在枯草芽孢杆菌中表达的聚乙二醇化的分离纯化的重组人精氨酸酶及在低PEG比率使用CC或SPA聚乙二醇化首先由Davis，Abuchowski及同事(Davis，F.F.等，1978，Enzyme Eng.4，169-173)在二十世纪七十年代揭示。与修改药物配方相反，将聚(乙二醇)PEG组分化学附着于具有治疗作用的蛋白质(一种已知为“聚乙二醇化”的方法)代表一种新方案，其可以增强重要的药物性质(Harris，J.M.等，2001，Clin.Pharmacokinet.40，539-551)。
在1979年，Savoca等使用2，4，6-三氯-s-三嗪(氰尿酰氯)作为偶联剂，将5,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇(mPEG)共价附着于牛肝脏精氨酸酶(Savoca，K.V等，1979，Biochimica et Biophysica Acta 578，47-53)。所述缀合物(PEG-精氨酸酶)只保留其原始酶活性的65％。他们报道PEG-精氨酸酶在小鼠血液循环中的寿命超过牛精氨酸酶的寿命。注射的牛精氨酸酶的半衰期小于1小时，而PEG-酶的半衰期是12小时。他们的数据还表明通过PEG修饰的牛精氨酸酶当在小鼠中测试时是非免疫原性和非抗原性的。
在冰上或在室温将重组人精氨酸酶(1.068mg)溶解于125mM硼酸盐缓冲溶液(pH 8.3)中。将激活的PEG，即mPEG丙酸的琥珀酰亚胺(mPEG-SPA；MW5,000)或者用氰尿酰氯激活的mPEG(mPEG-CC；MW5,000)，以1∶50或1∶20的精氨酸酶∶PEG摩尔比率加入所述溶液中。这通过两个步骤实现，在第一步骤中，将一半的PEG一点一点地加入精氨酸酶溶液中并在冰上轻轻混合30分钟以防止pH偏离8.0-8.5这个推荐范围。将另一半PEG加入该溶液中并进一步轻轻混合0.5-23小时。然后将此混合物使用截断值低于10,000的透析膜，在4℃用dH2O透析，至少更换3次dH2O。mPEG-SPA和mPEG-CC均使用蛋白质的赖氨酸和N末端的氨基基团作为修饰部位。
当在冰上或在室温用mPEG-SPA(MW 5,000)以1∶50的精氨酸酶∶PEG摩尔比率修饰人精氨酸酶时，在反应1小时后大多数酶分子被修饰(图16)。甚至在反应23小时后，样品还呈现同样状态。用不同数量的PEG分子附着人精氨酸酶分子，产生不同分子量的分子。正如所预期的，当使用较低摩尔比率1∶20进行聚乙二醇化反应时，发现存在较高比例的未聚乙二醇化形式的精氨酸酶(图17)。然而，针对所使用的两种精氨酸酶∶PEG摩尔比率，较长的反应时间及使用室温而不是在冰上反应似乎不影响聚乙二醇化程度。就mPEG-SPA(MW 5,000)而言，1∶50的摩尔比率和1小时的反应时间，所述聚乙二醇化的人精氨酸酶保留其原始酶活性的72-76％(见下表3)，这高于所报道的牛精氨酸酶活性(Savoca，K.V.等，1979，Biochimica etBiophysica Acta 578，47-53)。
当在冰上用mPEG-CC(MW 5,000)以1∶50的精氨酸酶∶PEG摩尔比率修饰人精氨酸酶时，反应非常缓慢，需要23个小时完成聚乙二醇化(图18A)。另外，大多数酶分子转变为一个窄范围的非常高的分子量。如果使用更低的1∶20的摩尔比率，反应将更加缓慢，如图18所示。
表3当用多种激活的PEG在不同摩尔比率和温度聚乙二醇化时精氨酸酶的活性
ND未测定精氨酸酶的100％活性相当于336单位/mg蛋白质。
实施例9A对得自实施例8A的mPEG-CC聚乙二醇化的分离纯化的重组人精氨酸酶进行体内半衰期测定将聚乙二醇化的分离纯化的重组人精氨酸酶注射入患者体内。每天从患者取3ml血液样品于EDTA中。将试管在融化的冰上预冷却至4℃以防止源于体内(ex vivo)的酶反应。然后将血液立即以14000rpm旋转2分钟，以除去红细胞。吸出1.5ml上清(血浆)，移至一个新的微量离心管(eppendorf tube)中。然后将该血浆在37℃温育30分钟。在温育后，加入100μM浓度的精氨酸作为底物。在37℃进行酶反应0，10，30，60分钟。在每次时间间隔，通过取出300μl反应样品移至一个新的微量离心管中终止反应，所述微量离心管中含有300μl 10％三氯乙酸。取样品并以最大速度(14000rpm)旋转10分钟。吸出上清，用0.45μm滤膜过滤。最后，用氨基酸分析仪(Hitachi，L8800)分析在不同时间间隔取的样品。结果示于图21A。
在研究期间如实施例8A所述制备两批聚乙二醇化精氨酸酶。第一批聚乙二醇化精氨酸酶用1∶140摩尔比率的精氨酸酶∶PEG制备。第二批聚乙二醇化精氨酸酶用1∶70摩尔比率的精氨酸酶∶PEG制备。制备这两批产物的聚乙二醇化方案和条件相同(见实施例8A)。
在0时间点，输注50mg第一批聚乙二醇化精氨酸酶。12小时后，再输注50mg第一批聚乙二醇化精氨酸酶。在第24小时进行第三次精氨酸酶输注，使用50mg第一批聚乙二醇化精氨酸酶。
从第26至第72小时，连续输注第一批聚乙二醇化精氨酸酶(100mg/天)代替间断输注(50mg/剂)。从第72至第144小时，以100mg/天连续输注第二批聚乙二醇化精氨酸酶。在第144小时，停止连续输注精氨酸酶，从这个时间点开始测定半衰期。半衰期测定结果示于图21B。图21B中0时间点等于图21A中第144小时。
所得结果提示重组人精氨酸酶活性的半衰期可以分为两个阶段。聚乙二醇化酶的第一个半衰期为大约6小时。相对活性从100％降至50％需要大约6小时(见图21B)。然而，第二个半衰期为大约21天。相对活性从50％降至25％需要大约21天。这种双重半衰期作用可能由于许多因素所致，包括在聚乙二醇化中使用较高数量的mPEG-CC及使用特异的输注方案。
实施例9B使用在人血清中的方法测定mPEG-SPA聚乙二醇化的分离纯化的重组人精氨酸酶的半衰期将纯化的重组人精氨酸酶(1mg)溶解于在冰上的1ml 125mM硼酸盐缓冲溶液(pH 8.3)中。将激活的PEG(mPEG-SPA，MW5,000)(7.14mg)以精氨酸酶∶PEG为1∶50摩尔比率缓慢加入该蛋白质溶液中。根据实施例8B所述方法将此混合物在冰上搅拌2.5小时。
将聚乙二醇化精氨酸酶(305.6μl)以1mg/ml浓度加入人血清(1ml)中，聚乙二醇化精氨酸酶的终浓度为0.24mg/ml。将此混合物分为20等份，置于微量离心管中(每个微量离心管中65μl)，然后在37℃温育。从每个微量离心管中取1-2μl混合物用于测试精氨酸酶活性。结果示于图20。经测定半衰期为大约2-3天。
实施例10枯草芽孢杆菌表达的分离纯化的重组人精氨酸酶及聚乙二醇化的分离纯化的重组人精氨酸酶的鉴定将通过Ikemoto等所述方法(Ikemoto等，1990，Biochem.J.270，697-703)获得的纯化的大肠杆菌表达的重组人精氨酸酶与通过本发明方法获得的纯化的枯草芽孢杆菌表达的重组人精氨酸酶进行对比(图19A和19B)。用Lumi-imagerTM的Lumianalyst32程序(RocheMolecular Biochemicals)对图19A所示总蛋白质条带进行密度分析，表明本发明方法产生高达100％纯的重组人精氨酸酶(图19B)。在优选的实施方案中，使用80-100％纯的重组精氨酸酶。在最优选的实施方案中，使用SDS-PAGE随后进行光成像分析，本发明的重组精氨酸酶的纯度为90-100％。
在一个系统中监测通过精氨酸酶从L-精氨酸中释放尿素的速率，所述系统中含有尿素酶，L-谷氨酸脱氢酶和NADPH(Ozer，N.，1985，Biochem.Med.33，367-371)。为制备主混合物(master mix)，将0.605g Tris，0.0731g α-酮戊二酸和0.4355g精氨酸溶解于40mldH2O中。用1M HCl将pH调节为8.5，然后在此混合物中加入0.067g尿素酶。用HCl将pH进一步调节为8.3，之后加入0.0335g谷氨酸脱氢酶和0.0125g NADPH。用dH2O将终体积调节为50ml，以形成主混合物。将此主混合物(1ml)吸入一个石英比色杯中。为测定精氨酸酶活性，加入1-5μg精氨酸酶，随后在30℃追踪340nm吸光度(A340)的降低1-3分钟。1单位的精氨酸酶定义为在给定条件下1分钟释放1μmol尿素的酶的量。本发明的纯化的重组人精氨酸酶的比活性计算为336单位/mg蛋白质，这与报道的纯化的人红细胞精氨酸酶的数值(204单位/mg蛋白质；Ikemoto等，1989，Ann.Clin.Biochem.26，547-553)和大肠杆菌表达的分离纯化的重组人精氨酸酶的数值(389单位/mg蛋白质；Ikemoto等，1990，Biochem.J.270，697-703)在同一个数量级上。
使用mPEG-SPA(MW 5,000)，以1∶50摩尔比率和1小时反应时间，聚乙二醇化人精氨酸酶保留多达72-76％的原始酶活性(见表3)。这意味着所述聚乙二醇化人精氨酸酶的比活性为242-255单位/mg。
使用mPEG-CC(MW 5,000)，聚乙二醇化人精氨酸酶保留其原始酶活性的64-68％(表3)，与聚乙二醇化牛精氨酸酶活性相似(Savoca，K.V.等，1979，Biochimica et Biophysica Acta 578，47-53)。
实施例11利用外源给予分离纯化的重组人精氨酸酶的治疗方案在治疗期间每天两次取患者血液样品，以了解精氨酸水平，精氨酸酶活性，全血图和凝血图(full clotting profile)。如果认为需要，至少每隔几天测试肝功和肾功。
在开始输注精氨酸酶后每15分钟测生命迹象(vital signs)(BP，脉搏，呼吸频率，血氧读数)，共测1小时，然后每小时测一次直至稳定。之后，由经治医生判断。
在输注精氨酸酶之前20分钟，经静脉内给予10mgdipheneramine，在每次输注精氨酸酶之前经静脉内给予100mg氢化可的松。
在第一天(诱导期)，在上午10点输注分离纯化的重组人精氨酸酶1小时以上，在晚上10点重复，如图22A和22B所示。
从第2-5天，每天以2mg/kg短期输注精氨酸酶，如图22A所示。
第二种方法中，起始诱导后可以连续输注分离纯化的重组人精氨酸酶几天，如图22B所示。
实施例12外源给予精氨酸酶以提高肝脏栓塞治疗的治疗方案本实施例中，使用例如碘化油及明胶海绵的标准肝栓塞方案治疗肝癌患者。这通过阻断肝动脉血流至肝脏而降低了对肝肿瘤供应氧和营养。然后给予分离纯化的重组人精氨酸酶以提高创伤肝脏释放的内源精氨酸酶。这个使用分离纯化的重组人精氨酸酶的治疗对于非糖尿病患者不需要非外源给予胰岛素，所述精氨酸酶具有如实施例9B所述的大约2-3天的半衰期及大约255单位/mg的高活性。治疗方案图示于图23。
必需注意本文所用的及在权利要求中所用的单数形式术语“一个”“这个”除非特别指出，还包括复数形式。因此，例如“一种药物制备物”包括不同制备物的混合物，“治疗方法”包括本领域技术人员已知的等价的步骤和方法等等。
除非另外指出，本文所用所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或相同的任何方法和材料可以用于本发明的实践和测试中，但本文描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物在此并入参考，以阐述和揭示与所引用的内容相关联的特殊内容。
本发明已经充分地进行了描述，本领域技术人员可以在本发明范围内对其加以修改。所有这种修改包含在本发明的范围内。
序列表以下序列在说明书中被揭示，需要包含在序列中SEQ ID NO1(图2A)SEQ ID NO2 & 3(图2B核苷酸序列(SEQ ID NO2)；和氨基酸序列(SEQ ID NO3))SEQ ID NO46xHis标记MHHHHHSEQ ID NO55’-CCAAACCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATA-3’(Arg1)SEQ ID NO65’-CCAAACTCTAGAATCACATTTTTTGAATGACATGGACAC-3’(Arg2)SEQ ID NO75’-CTCTGGCCATGCCAGGGTCCACCC-3’(Arg6)
权利要求
1.一种分离的重组人精氨酸酶，其纯度为80-100％。
2.权利要求1的分离并基本上纯的重组人精氨酸酶，其中所述酶具有与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示基本相同的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码所述人精氨酸酶的SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，其中所述分离的重组人精氨酸酶具有至少250U/mg的基本上高的酶活性。
3.权利要求1的分离并基本上纯的重组人精氨酸酶，其中所述酶被修饰以在血清或血浆中具有大约至少3天的半衰期的足够的稳定性。
4.权利要求1的分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其是人精氨酸酶I。
5.权利要求1的分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其在选自以下一组中的细菌菌株中克隆及表达大肠杆菌，杆菌，肠细菌，假单胞杆菌等。
6.权利要求5的分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其中所述细菌菌株是枯草芽孢杆菌。
7.权利要求1的分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其中所述修饰是聚乙二醇化。
8.权利要求7的分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其中所述聚乙二醇化通过使用偶联剂将至少一个聚乙二醇(PEG)组分共价附着于所述酶而实现。
9.权利要求7的分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶，其中所述偶联剂选自2，4，6-三氯-s-三嗪(氰尿酰氯，CC)和琥珀酰亚胺丙酸(SPA)。
10.一种分离并纯化所述重组人精氨酸酶的方法，包括(a)克隆编码人精氨酸酶I的基因；(b)构建一个重组枯草芽孢杆菌原噬菌体菌株以表达所述克隆的人精氨酸酶I；(c)使用所述构建的重组枯草芽孢杆菌原噬菌体菌株发酵枯草芽孢杆菌细胞；及(d)热激后纯化所述克隆的人精氨酸酶I。
11.权利要求10的方法，进一步包括通过使用偶联剂将至少一个聚乙二醇(PEG)组分共价附着于所述重组人精氨酸酶来修饰所述纯化的重组人精氨酸酶I。
12.权利要求11的方法，其中所述聚乙二醇组分是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
13.权利要求11的方法，其中所述偶联剂选自2，4，6-三氯-s-三嗪(氰尿酰氯，CC)和琥珀酰亚胺丙酸(SPA)。
14.一种药物组合物，其包含一种分离并基本上纯化的重组人精氨酸酶。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述重组人精氨酸酶是人精氨酸酶I。
16.权利要求14的药物组合物，其中所述组合物进一步以选自以下一组中的形式进行配方固体、溶液、乳剂、分散剂、胶束、脂质体等。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述药物组合物的配方是适于口服应用、无菌注射溶液或无菌注射悬液的形式。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述药物组合物给予患者，其中所述药物组合物中的所述重组人精氨酸酶是具有至少250U/mg的比酶活性的活性成分，及其中所述药物组合物中的所述重组人精氨酸酶在所述患者中维持精氨酸水平低于大约10μM至少3天。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述重组人精氨酸酶在所述患者血浆中的半衰期为至少3天。
20.权利要求18的药物组合物，其中所述重组人精氨酸酶在所述患者血浆中的半衰期为至少1天。
21.权利要求18的药物组合物，其中所述患者血浆中的半衰期体内或体外测定。
22.权利要求18的药物组合物，其中所述药物组合物在所述患者中以每天不超过1小时的短期输注给予。
23.权利要求18的药物组合物，其中所述患者患有肝病。
24.权利要求18的药物组合物，其中所述患者患有癌。
25.权利要求18的药物组合物，其中给予所述患者只作为单一药剂的所述药物组合物，其中不需要给予所述患者其它的蛋白质分解抑制剂。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述蛋白质分解抑制剂是胰岛素。
27.人精氨酸酶在制备药物中的应用。
28.权利要求27的应用，其中所述药物用于治疗人恶性肿瘤。
29.权利要求27的应用，其中所述人精氨酸酶的纯度为80-100％。
30.权利要求27的应用，其中所述人精氨酸酶的酶活性为至少250U/mg。
31.权利要求27的人精氨酸酶的应用，其中所述人精氨酸酶在人体中具有足够的稳定性，半衰期大约3天。
全文摘要
本发明提供了一种分离的和基本纯化的重组人精氨酸酶，其具有足够高的酶活性和稳定性以在患者体内保持AAD。本发明还提供了一种包含修饰的本发明的酶的药物组合物及使用本发明的药物组合物治疗疾病的方法。
文档编号A61K38/00GK1918298SQ02829179
公开日2007年2月21日 申请日期2002年9月9日 优先权日2002年6月20日
发明者郑宁民, 梁润松, 劳伟雄 申请人:康达医药科技有限公司