专利名称：弱毒化Vero毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种弱毒化的毒素，编码该毒素的基因、载体、病毒及含该毒素或毒素基因载体的药物组合物。更具体的说，本发明提供了一种弱毒化的Vero毒素突变VT2vp1毒素，及编码该毒素的突变VT2vp1基因，含有该突变基因的载体、病毒和含有该毒素或毒素基因的用于治疗细胞增生性疾病的药物组合物。
背量技术Vero毒素是由病原性大肠杆菌的一种肠道出血性大肠杆菌产生的。它是由有毒性的A亚基和与受体结合的B亚基构成的蛋白质性外毒素。如今，已发现的Vero毒素家族有VT1、VT2、VT2vha(VT2variant human a)、VT2 vhb、VT2vp1(VT2 variant porcine 1)和VT2vp2构成，其中发现VT2vp1与猪的浮肿病及人细胞增生性疾病有关(参见Linggood，M.A.，和Thompson，J.M.1987.Verotoxin production amongporcine strains of Escherichia coli and its association with edemadisease.J.Med.Microbiol.25359-362)。
Endo等证实，VT2有RNA的N-糖苷酶活性，能够切除兔网状细胞核糖体60S亚基的构成成分28S核糖体RNA的N糖苷键，从而抑制蛋白质的合成(参见Endo，Y.，等.1988.Site of action of a Verotoxin(VT2)from Escherichia coli O157H7 and of Shiga toxin oneukaryotic ribosomes.Eur.J.Biochem.17145-50)。这些分子的作用机理和Endo及其同事报道的植物血凝素、蓖麻毒素是完全一样的。这些发现促使许多研究工作者通过比较Vero毒素的A亚基和蓖麻毒素的氨基酸序列，来寻找Vero毒素的酶活性中心。Hovde等第一个证实了VT1中的E167对于活性的重要性。利用定点突变技术将E167替换为天门冬氨酸将会降低其蛋白合成的抑制活性、细胞内毒性和鼠致命活性(参见Hovde，C.J等.1988.Evidence that glutamic acid 167 isan active-site residue of Shiga-like toxin I.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852568-2572)。Yamasaki等构建了22个编码VT1的突变基因，发现E167Q和R170L能大大降低其生物学活性(参见Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Verotoxin 1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。Ohmura等进一步的构建了E167Q-R170L的双突变体。并检测纯化的突变VT1的活性(参见Endo，Y等.1987.RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain.J.Biol.Chem.2628128-8130)。
在VT2vp1中，Gordon等制备了E167Q、E167D和E167D-R170K，证实其中的E167Q毒性最低(参见Gordon等.1992.An enzymaticmutant of Shiga-like toxin II variant is a vaccine candidate for edemadisease of swine.Infect Immun.60485-490)。Macleod和Gyles报道了用戊二醛处理过的VT2vp1来免疫猪取得良好效果(参见Macleod等.1991.Immunization of pigs with a purified Shiga-like toxin II varianttoxoid.Vet.Microbiol.29309-318)。加入用VT2vp1类毒素来免疫能有效的防止猪浮肿的发生，那么和野生型VT2vp1有同样和相似抗原属性的无毒毒素突变体比用化学处理的类毒素应该更适合，因此Gordon等构建了VT2vp1的E167Q作为候选疫苗用来预防和治疗细胞增生性疾病。
发明内容
在本发明中，我们通过定点突变VT2vp1基因而获得弱毒性突变VT2vp1基因和弱毒性的突变毒素，在该毒素中，VT2vp1的A亚基从N末端起第167位点处的glu和170位点处的arg分别被谷氨酸盐和leu代替。我们发现双突变体E167Q-R170L表现出比单突变体E167Q有更低的活性。这个结果相对于Ohmura等以前所发现的在VT1中替换两个氨基酸，E167和R170没有表现出活性的降低来说是令人惊讶的。这种差异可能是由于VT1和VT1vp1突变体三维结构的不同从而影响了其活性。
在本研究中将构建的E167Q-R170L作为类毒素候选疫苗，其中有几个优点(i)它的生物活性低于E167Q，其抑制蛋白质合成、细胞内毒性和鼠致命性分别大约是E167Q的1/2、1/10和1/4，(ii)该三种突变多肽被替换了两个氨基酸，降低了回复突变的可能性。
(iii)中和抗E167Q-R170L细胞内毒性的活性与中和抗野生型VT2vp1细胞内毒性的活性相当。
通过用VT2vp1特异性bead-ELISA技术，我们从猪中分离了VT2vp1株，但在人和牛中没有分离出来，这说明在生产VT2vp1的猪VTEC中存在一种独一无二的克隆因子，该克隆因子不能和牛及人的目的细胞相互作用。如果这个推断是事实的话，那么构建活的猪浮肿病及人细胞增生性疾病的口服疫苗是可能的，在该疫苗中，野生型的VT2vp1基因是被编码E167Q-R170L的基因体外替换。
本发明的目的是提供一种弱毒化的Vero毒素，具体的说就是提供一种由A亚基从N末端起第167位点处的glu和170位点处的arg分别被谷氨酸盐和leu代替的突变VT2vp1编码的Vero毒素；并利用Vero毒素的基因编码的蛋白质合成具有阻碍癌细胞生长的抗癌剂，更具体的说也就是用病毒载体把弱毒化了的Vero毒素的A亚基或A、B亚基导入进癌细胞，并使其死亡。
图1是纯化的突变VT2vp1毒素与野生型的VT2vp1毒素对兔网状细胞球蛋白抑制作用示意图。
具体实施例方式
本发明所用的菌株是E.coliO139H1(菌株号为KY010)，是由H.Tanaka从患浮肿病的猪中分离出来，并利用VT2vp1基因的特异性引物进行PCR证实了该菌株中仅仅含有VT2vp1基因。
用PstI、Ecot22I和EcoRI消化E.coli KY010的基因组DNA，在Southern杂交中能与VT2特异性探针发生阳性反应的2.0kb的PstI片断被克隆到质粒pUC119中，制备质粒pKTN802，能与VT2特异性探针(含有来自pKTN802质粒的A亚基和B亚基的部分基因的0.22kb的HincII/PstI片断)发生阳性反应的4.3kb的EcoT221/EcoRI片断被克隆到质粒pBR322中，形成质粒pKTN808。将pKTN802的1.6kb的PstI/HincII片断和来自pKTN808的1.0kb的HincII/BamHI片断连接起来，形成2.6kb的含有VT2vp1基因的片断，将该片断再克隆到质粒pUC119中，形成质粒pKTN817。
根据以前的描述进行多核苷酸的定点突变(参见Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Vero toxin1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。将来自pKTN817的1.9kb的Sau3AI片断克隆到M13mp18的BamHI位点形成M13mp18.CI。从E.coliCJ236(M13mp18.CI)中分离出单链的M13mp18.CI DNA，和突变的多核苷酸退火，在体外进行聚合和连接。将获得的双链DNA转化到载体中，转化获得的载体颗粒感染E.coli MV1184，分离其中的双链DNA，检测VT2vp1基因发生突变的M13mp18.CI衍生物。为了证实没有其他的突变产生，将含有突变基因的整个基因利用双脱氧链终止法进行序列测定。
将M13mp18.CI中用MUTAGENIC OLIGONUCLEOTIDES导入6个含有突变的VT2vp1基因的EcoRI-HindIII片断，分别克隆到pUC118的EcoRI-HindIII位点，形成pKTC1-pKTC6。再将PKTC1和pKTC2的EcoRV-HincII片断克隆到pKTN817的EcoRV-HincII位点形成pKTC7和pKTC2d。含有pKTC7、pKTC2d、、pKTC3、pKTC4、pKTC5和pKTC6分别命名为E.coli CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6，这些E.coli菌株生产的突变毒素分别命名为CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6。将含有野生毒素质粒的E.coliHB101(pKTN817)和突变毒素E.coli菌株进行摇床培养，使突变的VT2vp1s基因表达。收集细胞，进行超声波处理，离心混合物，收集上清液，制备毒素的粗样。最后纯化VT2vp1毒素和突变VT2vp1毒素。
优选地，纯化VT2vp1毒素和突变VT2vp1毒素包括以下步骤使粗样通过快速流DEAE琼脂糖凝胶色谱；在PBE118柱上进行层析聚焦色谱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)和在TSK胶G-2000SW上进行的高效液相色谱(HPLC)。
本发明对纯化的突变VT2vp1毒素的生物活性进行了测，分别检测了突变VT2vb1毒素的蛋白质合成抑制活性、非洲绿猴肾细胞细胞内毒性和鼠致命性，并与纯化野生型VT2vp1比较。我们发现，本发明的突变VT2vp1毒素的活性显著降低，如表1所示。
因此本发明的突变VT2vp1毒素可以用来作为疫苗，作为预防或治疗细胞增生性疾病。所以本发明还包括用于预防或治疗细胞增生性疾病的药物组合物，该组合物包含有上述突变的弱毒性VT2vp1毒素蛋白和其他任一种药用载体、辅助剂或赋形剂。可用于本发明药用组合物中的可药用载体、辅助剂或赋形剂包括，但不限于，卵磷脂、血清蛋白如人血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、山梨酸、梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油脂混合物、水、盐或电解质、纤维素基物质、聚乙二醇、腊及羊毛脂。
本发明的药物组合物可以经口、不经肠，通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、或经由植入的贮器施用。优选经口使用。本发明的药物组合物可以含有任一种常规的无毒可药用载体、辅助剂或赋形剂。“不经肠”一词在本文中包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、胸骨内或输注技术。
本发明的药用组合物可以以任选口服可接受的计量形式口服施用，包括单不限于，胶囊、药片、和水悬浮液和溶液。在口服药片的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。还可典型的加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水悬浮液口服施用时，活性成分与乳化与悬浮剂组合。如果需要，还可胶乳某些增甜和/或增香和/或着色剂。
为了更全面的了解本发明，给出以下优选实施例。这些实施例目的在于说明而非旨在以任何方式限定本发明的范围。
实施例1含有VT2vp1基因的质粒的构建用pstI、Ecot22I和EcoRI消化E.coli KY010的基因组DNA，在Southern杂交中能与VT2特异性探针发生阳性反应的2.0kb的pstI片断被克隆到质粒pUC119中，制备质粒pKTN802，能与VT2特异性探针(含有来自pKTN802质粒的A亚基和B亚基的部分基因的0.22kb的HincII/PstI片断)发生阳性反应的4.3kb的EcoT221/EcoRI片断被克隆到质粒pBR322中，形成质粒pKTN808。将pKTN802的1.6kb的PstI/HincII片断和来自pKTN808的1.0kb的HincII/BamHI片断连接起来，形成2.6kb的含有VT2vp1基因的片断，将该片断再克隆到质粒pUC119中，形成质粒pKTN817。消化连接的条件参考《分子克隆试验指南》。
实施例2定点突变的形成多核苷酸的定点突变根据以前的描述进行(参见Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Vero toxin1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。将来自pKTN817的1.9kb的Sau3AI片断克隆到M13mp18的BamHI位点形成M13mp18.CI。从E.coliCJ236(M13mp18.CI)中分离出单链的M13mp18.CI DNA，和突变的多核苷酸(见表1)退火，在体外进行聚合和连接。将获得的双链DNA转化到E.coli BMH71-81 muts中，转化获得的噬菌体颗粒感染E.coli MV1184，分离其中的双链DNA，检测VT2vp1基因发生突变的M13mp18.CI衍生物。为了证实没有其他的突变产生，将含有突变基因的整个基因利用双脱氧链终止法进行序列测定，为了测序，用到下列五个合成多核苷酸作为引物与VT2vp1序列互补的15-20bp的序列(位置为255-269，514-530，767-781，1037-1056和1258-1237)。用亚磷酰胺法在Cyclone Plus DNASynthesizer(Milligen/Biosearch Division of Millipore，Tokyo)中合成上述多核苷酸，在一个渗透填充柱中用HPLC纯化，该渗透填充柱用0.1M三乙胺醋酸，pH7.0和乙氰的梯度液通过。通过测定质粒PKTN802和PKTN808的DNA序列，得出VT2vp1基因的核苷酸序列，发现从患浮肿的猪中分离出来的菌株E.coli KY010，O139H1的VT2vp1基因和Weinstein等报道的核苷酸序列是一致的，从而证实除了目的突变外没有其他的突变产生。
表1 VT2vp1突变体及其相对非洲绿候肾细胞细胞内毒性相对非洲绿突变体 导致突变用的多核苷酸 候肾细胞细胞内毒性野生型 无 11(167Q-R170L) 5′(TGAACAGTAAGGCCTGTGCTG-3’ ＜1/10,000CCM2(167Q)5′-CTGAACCGTAAGGCTTGTGCTG-3’＜1/10,000CCM3(170L)5’-CTGAACAGTAAGGCTTCTGCTG-3’1/1,000CCM4(172L)5′-TGTATTTGCAGGAACCGTAAGG-3’1/100CCM5(W203L) 5’-CTGATTCTCCCCAGGTTCAG-3’1/10CM6(W203H)5′-GATTCTCCCGTGGTTCAGAGT-3’ 1/10实施例3VT2vp1和突变VT2vp1s的表达从M13mp18.CI中分离出6个含有突变的VT2vp1基因的EcoRI-HindIII片断，分别克隆到pUC118的EcoRI-HindIII位点，形成pKTC1-pKTC6。再将PKTC1和pKTC2的EcoRV-HincII片断克隆到pKTN817的EcoRV-HincII位点形成pKTC7和pKTC2d。含有pKTC7、pKTC2d、、pKTC3、pKTC4、pKTC5和pKTC6分别命名为E.coli CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6，这些E.coli菌株生产的突变毒素分别命名为CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6。含有突变质粒的E.coliHB101(pKTN817)和E.coli菌株在含有100ug/ml氨比西林的LB培养基中37℃摇床培养48小时，收集细胞，在Handy Sonic UR-20p仪器(Tomy Seiko，Tokyo)中以最大功率超声波处理60秒，13000×g离心混合物10分钟，收集上清液。
实施例4VT2vp1和突变VT2vp1s的纯化毒素粗样的制备 将E.coliHB101(pKTN817)和E.coli CCM1-6分别在含有100ug/ml氨比西林的12升LB培养基中37℃摇床培养48小时，收集细胞，13000g离心20分钟，大约得到180g细胞，将这些细胞悬浮在1/5体积的加有0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.6)的初始培养基中，间断超声波裂解。30000g离心30分钟除去细胞粹片，在4℃下向上清夜中加入固体硫酸胺直至饱和，30000g离心30分钟，收集沉淀。等体积溶解在0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.6)中，用同样的缓冲液透析过夜，透析样品在13000g下离心20分钟，除去不容物，即得毒素粗样。
DEAE-纤维柱层析 从14升培养基(180g细胞)中提取的毒素粗样应用于DEAE-纤维柱，该柱用0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.6)平衡。样品用2000ml含有0.05M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液稀释，然后用3000ml NaCl浓度梯度(0.05M-0.9M)Tris-HCl缓冲液(pH8.6)稀释。收集能与抗VT2vp1毒素形成沉淀的那部分样品，用Amicon PM-10膜超虑浓缩。
层析聚焦柱层析 DEAE-纤维柱的流出物在0.025M咪唑-HCL缓冲液(pH7.4)中透析后，应用于含有30ml多聚缓冲交换剂PBE94(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)的1×40cm的柱，该柱已用0.025M咪唑-HCL缓冲液(pH7.4)平衡。材料用多聚缓冲液74(pH4.0)稀释，以获得pH7.0-4.0的梯度溶液，每4ml流出物的pH值增加0.04个单位。收集能与抗VT2vp1毒素形成沉淀的那部分样品，用Amicon PM-10膜超虑浓缩。
高效液相色谱 层析聚焦柱的流出物在0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中透析后，应用于TSK-gel G-2000SW柱的高效液相色谱(HPLC)，在Gilson HPLC系统中，为302型(Gilson France SA，Villiers-le-bel，France)，该柱用含有0.2M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡，材料用同样的缓冲液以0.45ml/min的速率稀释。收集能与抗VT2vp1毒素形成沉淀的那部分样品，用AmiconPM-10膜超虑浓缩。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨平板凝胶电泳 将产物再进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨平板凝胶电泳。含0.1％SDS的十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰氨平板凝胶电泳如Laemmli的描述(参见Laemmli，U.K.1970.Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4.Nature 227680-685)，用的是16％的丙稀酰凝胶。样品在0.1％SDS存在的情况下在100℃加热4分钟。
蛋白质的浓度测定 用Bradford的方法以牛血清蛋白作为标准对照测量蛋白质的浓度(参见Bradford，M.M.1976.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizingthe principle ofprotein-dye binding.Anal.Biochem.72248-254)。
用bead-ELISA法测定VT2vp1和突变VT2vp1s的量 如以前所描述的，用bead-ELISA法测定野生型和突变型VT2vp1s的浓度，用纯的VT2vp1免疫兔制备出一种抗VT2vp1的抗血清，用于检测VT2vp1的VT2vp1特异性bead-ELISA法的灵敏度为200pg/ml(参见Cao等.1994.Specific detection of a Verotoxin 2 variant，VT2vp1，by abead-enzyme-linked immunosor-bent assay.Microbiol.Immunol.38435-440)。
实施例5突变VT2vp1毒素的活性检测测定纯化的VT2vp1突变体VT2vp1s的蛋白质合成抑制活性、非洲绿猴肾细胞细胞内毒性和鼠致命性，与纯化野生型VT2vp1比较。如表2所示，有两个氨基酸替换的E167Q-R170L的毒性最弱，在抑制蛋白质合成、非洲绿猴肾细胞细胞内毒性和鼠致命性活性方面分别是野生型毒素的1/1900、1/12500和1/2000。E167Q和R170L也表现出了生物活性的大大降低，虽然降低的程度小于E167Q-R170L降低的程度。
表2纯化的突变体VT2vp1与纯化的野生型VT2vp1不同生物活性比较毒素 蛋白合成抑制活性 非洲绿猴肾细胞毒性 鼠致死活性(ID50a)，μg) (CD50b)，ng) (LD50c)，μg)
非洲緑候肾细胞细胞毒性的检测 非洲绿候肾细胞细胞毒性的检测如以前的文章的描述(参见Noda等.1987.Purification and someproperties of Shiga-like toxin form Escherichia coli O157H7 that isimmunologically identical to Shiga toxin.Microb.Pathog.2339-349)。野生型的VT2Vp1和突变型的VT2vp1s用上文所描述的方法表达，测定毒素粗样的突变VT2vp的非洲绿猴肾细胞细胞内毒性。如表1所示，CCM1的A亚基从N末端起第167位(E167)处的Glu和第170位(E170)的Arg分别被谷氨酸盐和Leu所代替(E167Q-E170L)，CCM2第167位(E167)处被谷氨酸盐替换(E167Q)，都表现出非洲绿猴肾细胞细胞内毒性的显著降低。CCM3第170位被Leu代替(E170L)也表现出非洲绿猴肾细胞细胞内毒性的显著降低。另外，其他三种突变VT2vp1s R172L(CCM4)、W202L(CCM5)和W202H(CCM6)都没有表现出实质性的活性降低。
鼠致命活性的检测 毒素对于ddY鼠(Shimizu Laboratory SupplyCo，Kyoto)的致命活性的检测如以前的文章所述。将0.5ml样品腹内膜注射到4-5周龄的鼠中。观察动物7天，计算在2-7天内的死亡数。用Reed和Muench描述的方法测定6只鼠群的LD50。
蛋白质合成的抑制 毒素对于网状细胞溶解产物的球蛋白合成的抑制作用的检测如以前的文章所述(参见Ogasawara等.1988.Inhibition of protein synthesis by a Bero toxin(VT2 or Shiga-like toxin II)produced by Escherichia coli O157H7 at the level ofelongation facter 1-dependent aminoacyl-tRtNA binding toribosimes.Microb.Pathog.4127-135.)。如图1所示，每个反应用1μg纯化的VT2vp1就能完全抑制兔网状细胞的球蛋白合成，而每个反应用10μg的E167Q-R170L对兔网状细胞的球蛋白合成没有明显的抑制作用，每个反应用10μg的其他两种突变毒素对蛋白质的合成有轻微的抑制作用。抑制50％的球蛋白合成的VT2vp1和突变VT2vp1s的量(ID50)被测定，结果如表2所示，表2还列出了导致50％的非洲绿猴肾细胞细胞死亡的突变VT2vp1的量(CD50)和杀死50％的用毒素接种的鼠所需的量(LD50)。
权利要求
1.一种DNA序列，它编码弱毒化Vero毒素，并且具有下列序列之一(i)具有5’-CAGCACAGGCCTTACTGTTCAG-3’的核苷酸序列，(ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交的DNA序列。
2.权利要求1的DNA序列，其具有5’-CAGCACAGGCCTTACTGTTCAG-3’的核苷酸序列。
3.含有权利要求1DNA序列的载体。
4.含有权利要求1DNA序列的重组病毒。
5.权利要求4的病毒，其中该病毒是腺病毒。
6.权利要求4的病毒，其中该病毒逆转录病毒。
7.权利要求1或2的DNA编码的弱毒化Vero毒素。
8.一种用于治疗细胞增生性疾病的药物组合物，该组合物含有权利要求3的载体和可药用载体、辅助剂或赋形剂。
9.一种用于治疗细胞增生性疾病的药物组合物，该组合物含有权利要求4-6中任一项的病毒和可药用载体、辅助剂或赋形剂。
10.权利要求7中的弱毒化Vero毒素在用于制备治疗细胞增生性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种弱毒化的毒素，更具体的说，本发明通过定点突变VT2vp1基因而获得微弱毒性突变VT2vp1基因和微弱毒性的突变毒素，在该毒素中，VT2vp1的A亚基从N末端起第167位点处的glu和170位点处的arg分别被谷氨酸盐和leu代替，该双突变体E167Q－R170L比单突变体E167Q表现出更低的蛋白质合成抑制活性、非洲绿猴肾细胞细胞内毒性和鼠致命性，因此适合用于制备疫苗和治疗细胞增生性疾病的药物。
文档编号A61K48/00GK1536083SQ03109430
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者刘笑燕, 吉田秀男, 任秀宝, 黄宗堂, 男 申请人:刘笑燕