专利名称：抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体物质——抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)产品，并涉及其制备工艺及在兽类药学和饲料添加剂上的应用。
在现代集约化养猪场，仔猪黄痢、白痢几乎无所不在，对养猪生产尤其是规模化养猪威胁较大。朱瑞民(1988)统计表明，台湾有15％-25％的仔猪因黄痢、白痢病无法育成，每年直接经济损失达3.6-6.9亿元。我国大陆目前没有全面统计仔猪黄痢、白痢的发病率和造成的损失，但各地在研究对该病的防治方法时，均在小范围内做过统计。金皓如(1986年)对出栏3.5万头猪场5年的统计结果表明，仔猪黄痢、白痢发病率占全群发病率的40.5％-58％，死亡率占全群死亡的29.5％-45.2％，每年直接经济损失5-10万元。综合许多试验报道表明，在广东、北京、山西、江苏、辽宁、吉林等地，观察近2万头试验空白对照组的仔猪，仅吉林延边自治州1987年因黄痢、白痢死亡9922头仔猪，占存栏数的11.3％。仔猪黄痢、白痢若防治不及时，可造成仔猪体重下降，从而影响后备猪质量，并降低肉猪出栏率，增加药费，提高养猪成本，从而造成严重的经济损失。
仔猪出生后主要从母猪乳中获得免疫抗体，形成被动免疫力。仔猪由母乳中获得的抗大肠杆菌的免疫球蛋白在2-3周消耗完，而自身抗体却从3周龄开始产生。因此3周龄是仔猪从母体获得抗体与自身产抗体的转换期，或称青黄不接期，此时仔猪免疫能力下降，最容易患仔猪白痢。
当前，临床治疗仔猪黄痢、白痢主要使用抗生素、磺胺类药物及其它化学合成药物，虽然短期效果明显，但长期使用后往往会产生严重的耐药性，使以后治疗效果大大降低，另有采用中药制剂方式对仔猪进行该类疾病的防治，但中药制剂的效果不甚理想，因而疾病在仔猪中无法从根本上得到控制。同时也有许多兽医学者致力于大肠杆菌疫苗的研制。而且剂型仅限于针剂。
鸡卵黄抗体(IgY)是来自鸡血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明IgY具有高度的稳定性，在热、酸、碱环境中具有优良的耐受性，同时IgY还具有成本低、易于形成规模化生产的优点。目前国内已有病毒、细菌等颗粒性抗原诱导鸡卵黄表达特异性抗体的研究报告。
现有技术中未见有通过采用仔猪黄痢、白痢病原菌(大肠杆菌)作为抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗-EitIgY报道。
本发明针对以上问题，研制出一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物制剂—鸡卵黄抗体(抗-EitIgY)，用于因特异性大肠杆菌感染所引起的仔猪黄痢、白痢疾病的防治。针对以往产品只能采取针剂的形式注射使用，使用不便，而加以改进。该抗体稳定性较强、耐酸、碱，可以采取口服形式使用，能保持产品的活性与效价，使用方便，易于推广。因其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握，提取回收率理想，经济效益可观，适于产业化制作。
本发明通过以仔猪黄痢、白痢病原菌为抗原，免疫健康产蛋母鸡，提取活性成分(抗-EitIgY)，为治疗仔猪黄痢、白痢感染提供一条新思路和新方法，并为进一步制备抗仔猪黄痢、白痢的免疫生物制剂奠定基础。
本发明所要解决的技术问题之一是针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)。
本发明所要解决的技术问题之二是提供上述抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三是提供上述抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)在制备用于因病原菌引起的仔猪黄痢、白痢的预防或治疗的药物制剂或饲料添加剂应用。
为解决上述技术问题之一，本发明采用的技术方案是这样的，即一种抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)，其特征在于所述抗-EitIgY按SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。
本发明解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)的方法，其特征在于采用如下的步骤完成1、制备仔猪黄痢、白痢病原菌抗原(1)菌体抗原制备分别将大肠杆菌(08、060、0115、0138、0139、0141)菌株，涂布于营养琼脂上，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。
(2)菌毛亚单位抗原制备将菌种按1∶100的比例接种营养肉汤中37℃培养72h，然后3000g 4℃离心10min，沉淀的菌体用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)，60℃下高速搅拌30min，11000g 4℃离心20min，取上清液重复离心一次，最后上清液为菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化镁溶液，使其浓度为0.1mol/L，于4℃静置12h以上，4℃ 24000g离心45min，收集菌毛沉淀。
(3)外膜蛋白抗原制备将菌种按1∶50的比例接种营养肉汤中，37℃振荡培养15h，培养物于4℃、5000r/min离心10min，沉淀悬浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w输出功率超声波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min离心10min，收集上清液，加入约8倍体积的2％Sarkosyl，室温作用20min后，于10℃、35000r/min离心1h，沉淀悬浮于10mmol/L，HEPES(pH7.4)，备用。
以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得免疫抗原。
2、将菌体抗原按以下的步骤制备抗体(1)对产卵母鸡的免疫I、基础免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养，进行鸡皮下多点注射复合抗原，0.5ml/只。
II、强化免疫基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂复合抗原0.5ml/只。
III、超强化免疫21天后需超强化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗体滴度。
于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。
(2)卵黄抗体的提取①.采用水溶法提取卵黄抗体从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上层清液浓缩、冷冻干燥，得到抗-EitIgY。
或②采用膜过滤法提取卵黄抗体分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集蛋白物质，冷冻干燥得到抗-EitIgY。
本发明所提供的上述抗-EitIgY产品由仔猪黄痢、白痢病原菌免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治仔猪大肠杆菌感染引起的仔猪黄痢、白痢疾病具有良好的效果。本发明采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。
由于解决上诉技术问题，抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)可制成粉剂、散剂、水剂等剂型，可以口服应用，使用方便。
附图
的说明附图给出了本发明制备方法的工艺流程图。
实施例2菌体抗原的制备，将病原菌菌株，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。
实施例3菌毛亚单位抗原制备，将菌种按1∶100的比例接种营养肉汤中37℃培养72h，然后3000g 4℃离心10min，沉淀的菌体用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)，60℃下高速搅拌30min，11000g 4℃离心20min，取上清液重复离心一次，最后上清液为菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化镁溶液，使其浓度为0.1mol/L，于4℃静置12h以上，4℃24000g离心45min，收集菌毛沉淀。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌毛亚单位抗原。
实施例4外膜蛋白抗原制备，将菌种按1∶50的比例接种营养肉汤中，37℃振荡培养15h，培养物于4℃、5000r/min离心10min，沉淀悬浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w输出功率超声波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min离心10min，收集上清液，加入约8倍体积的2％Sarkosyl，室温作用20min后，于10℃、35000r/min离心1h，收集沉淀。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得外膜蛋白抗原。
实施例5采用如下方式分离提取抗-EitIgY从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗-EitIgY。
实施例6分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集蛋白物质，冷冻干燥得到抗-EitIgY。
实施例7取实施例1、5、6中的产品进行IgY纯度检查用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。
实施例8取实施例1、5、6中的产品进行IgY浓度检查将提取的抗体用PBS作5-10倍的稀释，然后采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。
实施例9取实施例1、5、6中的产品进行IgY效价测定采用奥氏双扩散方法进行IgY效价测定，IgY效价为1∶160-1∶12800。
实施例10采集抗-EitIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在99.5％以上的IgY抗-EitIgY)10克。超滤液按5-10％加入淀粉，混合均匀，冷冻干燥，用于治疗和预防仔猪大肠杆菌感染引起的疾病。
实施例11体外实验①.分子量检测SDS-PAGE电脉，分离胶浓度7.5％，浓缩胶浓度5％，电流11mA，电压200V，时间45min，Marker采用低相对分子质量标准蛋白质，取下凝胶用于常规银染色法。
②.纯度分析双向免疫扩散法，参照文献进行。
③.活性检测ELISA间接试验，操作方法参照常规ELISA间接法，所用抗原、抗-EitIgY、酶标抗体均按棋盘滴定法确定工作浓度，抗原浓度为100ug/ml，包被板每孔加样100ul，被测抗-EitIgY浓度为8ug/ml，每孔加样100ul，辣板过氧化物酶标抗IgY-IgG(Sigma公司)工作稀释度为1∶1000，底物为OPD，2ml/浓硫酸终止反应，酶标仪492nm下测定OD值。
实施例12IgY抗体抑制大肠杆菌粘附的作用抗-EitIgY和大肠杆菌、肠上皮细胞一起培养，每1ml添加0.5mg抗体就能观察到粘附在上皮细胞上的大肠杆菌减少，抗体浓度达到3mg/ml时，效果更好。说明抗-EitIgY抗体能抑制大肠杆菌粘附在肠上皮细胞上，进而阻断了细菌的繁殖和产生毒素。
实施例13抗-EitIgY体外中和细菌毒素的生物活性实验抗-EitIgY(50ug-800ug/ml)与大肠杆菌培养上层清液在无菌条件下11混合，37℃24h后，取0.1ml混合物上层清液加入培养肠上皮细胞体系中，发现IgY浓度在500ug/ml可明显抑制细菌毒素对培养肠上皮细胞的毒性，其后的系列稀释，其抑制保护活性亦随之减低。
实施例14口服抗-EitIgY在体生物学活性观察参照相关文献建立小鼠大肠杆菌感染的模型，试验分为(10mg/Kg和50mg/Kg)两个治疗组、对照组。口服治疗48h后，观察鼠的大体变化、肠道的病理组织学检查，组织细菌定量培养、血内毒素测定等指标。结果发现对照组小鼠感染48h后的精神状态差，大都发生腹泻，肠道病理组织学检查发现肠粘膜明显充血，高度水肿，细胞连接有破损，有大量浆性和炎性细胞浸润；治疗组治疗后48h的肠粘膜水肿，有浆性和炎性细胞浸润，细胞连接完整。组织细菌定量检查发现对照组和治疗组均为阳性，但治疗组数量明显低于对照组，血中内毒素含量治疗组亦明显低于对照组。
权利要求
1.一种抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗-EitIgY)，其特征在于所述抗-EitIgY按SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度；经体外拮抗细菌生物活性检测，抗-EitIgY浓度在500μg/ml时，表现出对仔猪黄痢、白痢病原菌(大肠杆菌)有明显的抑制作用；经奥氏双扩散法对抗-EitIgY进行效价测定效价为1∶160-1∶12800。
2.一种制备抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体，即抗一EitIgY的方法，其特征在于采用如下的工艺步骤(1)制备仔猪黄痢、白痢病原菌抗原①菌体抗原制备分别将大肠杆菌(08、060、0115、0138、0139、0141)菌株，涂布于营养琼脂上，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体。按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原；②菌毛亚单位抗原制备将菌种按1∶100的比例接种营养肉汤中37℃培养72h，然后3000g 4℃离心10min，沉淀的菌体用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)，60℃下高速搅拌30min，11000g 4℃离心20min，取上清液重复离心一次，最后上清液为菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化镁溶液，使其浓度为0.1mol/L，于4℃静置12h以上，4℃24000g离心45min，收集菌毛沉淀；③外膜蛋白抗原制备将菌种按1∶50的比例接种营养肉汤中，37℃振荡培养15h，培养物于4℃、5000r/min离心10min，沉淀悬浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w输出功率超声波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min离心10min，收集上清液，加入约8倍体积的2％Sarkosyl，室温作用20min后，于10℃、35000r/min离心1h，沉淀悬浮于10mmol/L，HEPES(pH7.4)，备用；以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得免疫抗原。(2)将所得的菌体抗原按以下的步骤制备抗体①对产卵母鸡的免疫I、基础免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养，进行鸡皮下多点注射复合抗原，0.5ml/只；II、强化免疫基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂复合抗原0.5ml/只；III、超强化免疫21天后需超强化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗体滴度；于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用；②卵黄抗体的提取I、采用水溶法提取卵黄抗体从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗-EitIgY；或II、采用膜过滤法提取卵黄抗体分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为300KD和100KD的膜分别过滤，收集蛋白物质，冷冻干燥得到抗-EitIgY；
3.抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体，即抗-EitIgY在制备用于因病原菌引起的仔猪黄痢、白痢的预防或治疗的药物制剂或饲料添加剂应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗体活性的抗仔猪黄痢、白痢病原菌卵黄抗体(抗－EitIgY)、制备该抗体的方法及其在制备用于治疗因仔猪病原菌(大肠杆菌)感染引起的相关疾病药物或饲料添加剂中的应用。上述抗－EitIgY按SDS－PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western－blotting检测中高分子量带处出现清晰的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。上述方法为制备仔猪黄痢、白痢病原菌抗原，将该抗原免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗－EitIgY。用于制备预防或治疗仔猪黄痢、白痢的的药物制剂或饲料添加剂。
文档编号A61P31/04GK1438246SQ0311750
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者雁杰, 陈君 申请人:重庆和润实业(集团)有限公司