专利名称：精氨酸对糖尿病皮肤组织“隐性损害”的改善作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和药物学领域，更具体地涉及精氨酸对糖尿病皮肤组织“隐性损害”的改善作用。
背景技术：
糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病。临床常见糖尿病患者皮肤菲薄，普遍易受损伤，且损伤后表现为创面愈合延迟或不愈。
目前临床治疗糖尿病，通常采用的药物是磺脲类和双胍类药物及胰岛素。然而，这些药物都不能显著改善糖尿病患者皮肤组织的变薄。
精氨酸是一种必需氨基酸。从十九世纪末期精氨酸结晶品被提纯至今，精氨酸被发现与生长发育、生化代谢、免疫等有重要的联系，并作为一种重要的营养素被广泛应用。然而，迄今为止尚没有将精氨酸用于治疗糖尿病皮肤隐性损害的报道。
因此，本领域迫切需要开发新的改善糖尿病患者皮肤组织的变薄状况的药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效改善糖尿病患者皮肤组织的变薄状况的药物。
在本发明的第一方面，提供了一种精氨酸的用途，用于制备治疗糖尿病皮肤隐性损害的组合物，其中所述的隐性损害选自下组(a)皮肤组织糖含量高于正常值(如大于0.3963mg/克皮肤组织)；(b)皮肤组织糖基化终末产物含量高于正常值(如大于22.6±5.1μ/mg羟脯氨酸)；
(c)皮肤组织的表皮厚度小于正常值(如小于0.0318±0.007mm)；(d)皮肤组织中表皮细胞处于S期的细胞比例正常，处于G2/M期的细胞比例低于正常值(如低于2.22％)，真皮细胞中处于S期的细胞比例高于正常值(如高于17.17％)，处于G2/M期的细胞比例正常；(e)无创伤皮肤组织出现异常炎症反应。
在另一优选例中，所述组合物含有占组合物总重量0.01％-99％的精氨酸。
在另一优选例中，所述组合物含有占组合物总重量0.1％-90％的精氨酸。
在另一优选例中，所述组合物还含有选自下组的物质胰岛素、生长因子、生长激素、其它各种氨基酸、微量元素、维生素。
在另一优选例中，所述组合物用量为每天0.01-10mg/kg体重，按精氨酸计。
在另一优选例中，所述组合物用量为每天0.1-5mg/kg体重，按精氨酸计。
在另一优选例中，所述组合物为保健品。
在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述组合物为片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、或酏剂。
在本发明的第二方面，提供了糖尿病保健品，含有10-900mg/g，较佳地10-100mg/g的精氨酸和可接受的载体或稀释剂。
图1显示了糖尿病皮肤组织变薄，精氨酸导致糖尿病皮肤的厚度回复至接近正常水平。
图2显示了精氨酸导致糖尿病皮肤组织中糖含量下降。
图3显示了正常皮肤组织中糖基化终末产物蓄积状态。
图4显示了糖尿病皮肤组织中糖基化终末产物蓄积明显增多。
图5显示了精氨酸导致糖尿病皮肤组织中表皮细胞进入G2/M期的比例增加。
图6显示了精氨酸导致糖尿病皮肤组织中真皮细胞进入G1期的比例增加，进入S期的真皮细胞比例恢复正常。
图7显示了糖尿病组皮肤组织HE染色结果(×200)。
图8显示了精氨酸组皮肤组织HE染色结果(×200)。
具体实施例方式
本发明人经过多年深入而广泛的研究发现，糖尿病患者皮肤组织的变薄，“隐性损害”是其中的重要原因。并且意外地发现，精氨酸能够显著改善治疗这种隐性损害，使糖尿病患者的皮肤回复至接近正常厚度。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，糖尿病皮肤组织“隐性损害”指发生在糖尿病无创伤皮肤组织中的组织和生化的改变，包括局部组织糖含量增高及糖基化终末产物(advanced glycation endproducts，AGEs)蓄积、表皮组织菲薄、主要组织修复细胞(包括表皮细胞和成纤维细胞)“增而不殖”、炎性介质和炎性细胞异常增多等。
“隐性损害”不仅有助于解释临床所见的糖尿病患者皮肤菲薄，普遍易发生自发性溃疡和易受损伤的现象，同时部分解释了糖尿病创面难愈的现象。
应用外源性精氨酸对糖尿病大鼠皮肤组织“隐性损害”现象有显著的改善作用，主要表现在以下方面(a)皮肤组织糖含量下降。与单纯糖尿病组相比，应用精氨酸的糖尿病大鼠皮肤组织糖含量显著降低(P＜0.05)，但仍高于正常组(P＜0.01)。说明精氨酸能够通过某种机制使局部血糖降低，但尚不能恢复正常(图2)。
(b)对表皮细胞增殖周期的影响应用精氨酸的糖尿病大鼠进入G2/M期的表皮细胞数量明显增多，并显著高于正常，说明精氨酸能逆转糖尿病皮肤组织中表皮细胞的“增而不殖”状态。
(c)对真皮细胞增殖周期的影响应用精氨酸的糖尿病大鼠由静止状态进入增殖周期的真皮细胞增多，进入S期的真皮细胞数量恢复至与正常无差异。说明精氨酸能有效改善真皮细胞的“增而不殖”。
(d)表皮厚度的增加与糖尿病大鼠相比，精氨酸喂养的糖尿病表皮厚度明显增加，而与正常组之间无统计学差异。应用精氨酸后，能明显纠正糖尿病表皮菲薄的状态。
(e)对皮肤组织炎症反应的影响应用精氨酸后，糖尿病大鼠皮肤组织仍有炎性细胞浸润，但炎性细胞相对集中于靠近基底层区域，炎症介质有所降低。这提示精氨酸通过改变炎性细胞的生物学行为来影响局部组织的炎症反应。
本发明提供了用于治疗糖尿病隐性损害的药物，其中含有安全有效量的精氨酸以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
本发明还提供了用于改善糖尿病人隐性损害的保健品，其中含有为10-900mg/克精氨酸。
A.剂量在本发明中，对精氨酸的剂量没有特别限制，可用任何合适的剂量。载体的类型以及数量也可以很不相同，这取决于温血动物或人的种类、体重、和待治疗的隐性损害程度等。一般，合适的含量是精氨酸占药物组合物总重量的0.01％-99％，较佳地0.1-90％。作为药物治疗或作为保健品保养时，精氨酸的有效剂量范围通常为0.01-800毫克/千克·天或更高，较佳地为0.1-500毫克/千克·天，更佳地为0.5-200毫克/千克·天。
剂量单元包括一种精氨酸化合物，或者该精氨酸化合物与其他糖尿病治疗剂所形成的混合物。剂量单元还可含有稀释剂、填充剂、载体等。剂量单位是固体或凝胶形式，如丸剂、片剂、胶囊等，或者是液体形式，它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药。
B.剂型本发明的经口给药的固体组合物可采用片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、滴剂等形式。这些固体组合物中混合了1种或1种以上的活性物质和至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。还可按照常用方法使组合物中含有除了惰性稀释剂之外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂、纤维素乙醇酸钙等崩解剂、乳糖等稳定剂、谷氨酸或天冬氨酸等助溶剂。如是片剂或丸剂，还可根据需要，在其外部包裹上蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、肠溶性薄膜。
经口给药的液体组合物包括药剂上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，通常使用的惰性稀释剂包括精制水、乙醇。该组合物中除了惰性稀释剂之外，还可包含湿润剂、悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。
非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳浊剂。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含丙二醇，聚乙二醇，可可脂、橄榄油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80(商品名)等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用滤菌膜过滤上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。
用于制造本发明的有用剂型的技术和组合物，在下列文献中有描述7种现代制剂(7 Modern Pharmaceutics).第9和10章(Banker & Rhodes编辑，1979)；Lieberman等人，药物剂型片剂(Pharmaceutical Dosage FormsTablets)(1981)；和Ansel，药物剂型导论(Introduction to PharmaceuticalDosage Forms)2版(1976)。
C.给药方法配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、或局部给药。此外，精氨酸还可与其他治疗糖尿病及其并发症的治疗剂(如胰岛素等)一起使用。
现阶段，我国糖尿病患者约880万，预计在到2025年将达到3,800万。因此精氨酸具有广泛的市场前景。本发明的主要优点在于(1)精氨酸可有效改善皮肤组织“隐性损害”，从而纠正皮肤变薄症状，使得糖尿病患者下肢溃疡发生率下降。
(2)精氨酸是一种条件氨基酸，故使用时安全性好。
(3)精氨酸可与其它治疗糖尿病药物合并使用，并可经常规途径给药，使用方便。
(4)精氨酸是一种被广泛接受的营养素，并具有一定的药理作用，因此适用于药品和保健品的商品化。
(5)精氨酸是一种经典药品，使用安全。本发明扩大了精氨酸的使用适应症。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1糖尿病的隐性损害特征1.1、皮肤组织糖含量方法对26只大鼠用链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射诱导，形成糖尿病大鼠。诱导不同时间后处死大鼠，用生化法测定大鼠皮肤组织中的糖含量。
结果诱导后14天处死的糖尿病大鼠皮肤组织糖含量为1.0699mg/g皮肤组织，8周处死的糖尿病大鼠皮肤组织糖含量为2.099mg/g皮肤组织，两组差异明显(P＜0.01)；与正常大鼠(0.3963mg/g皮肤组织)相比，糖尿病大鼠的皮肤组织糖含量显著升高(P＜0.01)。
1.2、皮肤组织糖基化终末产物检测方法方法同1.1，诱导8周后处死大鼠，用皮肤胶原提取液荧光强度测定法及免疫组化法检测大鼠皮肤组织中的糖基化终末产物。
结果正常大鼠为22.6±5.1μ/mg羟脯氨酸，诱导后8周处死的糖尿病大鼠为33.9±4.2μ/mg羟脯氨酸，两相比较有显著差异(P＜0.01)(图3，图4)。
1.3、表皮厚度变薄
方法用显微测距法在皮肤组织HE切片上对表皮厚度进行测量。
结果与正常大鼠相比，糖尿病大鼠表皮明显变薄(P＜0.05)。
1.4、表皮、真皮细胞“增而不殖”方法应用流式细胞计数仪对皮肤组织表皮、真皮细胞增殖周期进行检测。
结果表皮细胞处于S期的细胞比例正常，处于G2/M期的细胞比例低于正常值(低于2.22％)，真皮细胞中处于S期的细胞比例高于正常值(高于17.17％)；处于G2/M期的细胞比例正常。
在适宜的刺激下，静止态细胞被触发进入增殖状态，即进入细胞增殖周期。细胞依次经过G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有丝分裂期)完成一次分裂。在某些病理状态下，细胞能够顺利进入S期(DNA合成期)，但不能进入M期(有丝分裂期)或进入M期的细胞不足，称之为“增而不殖”现象。糖尿病大鼠皮肤中进入处于S期(DNA合成期)的表皮细胞百分比能够达到正常水平，而进入G2/M期(有丝分裂期)的表皮细胞则显著低于正常，呈现“增而不殖”。而糖尿病大鼠皮肤中进入S期的真皮细胞数量显著高于正常大鼠，但进行有丝分裂的真皮细胞并未相应增多，表现为另一种形式的“增而不殖”。
1.5、皮肤组织炎症反应启动方法在皮肤组织HE切片上对糖尿病皮肤进行组织学观察；应用ELISA法对糖尿病皮肤组织块培养液中的炎性介质TNFa、MIP-2进行检测。
结果HE染色下可见糖尿病大鼠皮肤组织中炎性细胞弥散浸润，与正常对照组相比，糖尿病大鼠皮肤组织中的炎症介质TNFa、MIP-2水平明显升高。
实施例2精氨酸对糖尿病隐性损害的治疗作用在本实施例中，对糖尿病大鼠通过灌胃方式施用不同剂量的精氨酸，给药方案是25mg、50mg、100mg、200mg/Kg体重。并在给药后的不同时间处死大鼠，用实施例1中相同的方法进行各项测定。
2.1、皮肤组织糖含量测定结果如图2所示。糖尿病大鼠皮肤组织糖含量为2.0994mg/g皮肤组织，正常大鼠为0.3963mg/g皮肤组织，应用精氨酸的糖尿病大鼠为1.3808mg/g皮肤组织。与单纯糖尿病组相比，应用精氨酸的糖尿病大鼠皮肤组织糖含量显著降低(P＜0.05)，但仍高于正常组(P＜0.01)。说明精氨酸能够通过某种机制使局部血糖降低，但尚不能恢复正常(图2)。
2.2、对表皮细胞增殖周期的影响结果如图5所示。应用精氨酸的糖尿病大鼠进入G2/M期的表皮细胞数量明显增多，并显著高于正常。说明精氨酸能逆转糖尿病皮肤组织中表皮细胞的“增而不殖”状态。
2.3、对真皮细胞增殖周期的影响结果如图6所示。应用精氨酸的糖尿病大鼠由静止状态进入增殖周期的真皮细胞增多，进入S期的真皮细胞数量恢复至与正常无差异。说明精氨酸能有效改善组织修复细胞的“增而不殖”。
2.4、精氨酸对表皮厚度的影响结果如图4所示。与糖尿病大鼠相比，精氨酸喂养的糖尿病表皮厚度明显增加(0.026mm)，而与正常组(0.0318mm)之间无统计学差异。这表明，应用精氨酸后，能明显纠正糖尿病表皮菲薄的状态。
2.5、精氨酸对皮肤组织炎症反应的影响结果如图5和图6所示。应用精氨酸后，糖尿病大鼠皮肤组织仍有炎性细胞浸润，但炎性细胞相对集中于靠近基底层区域，炎症介质有所降低。提示精氨酸通过改变炎性细胞的生物学行为来影响局部组织的炎症反应。
实施例3含精氨酸的药物组合物在本实施例中，制备用于口服的含精氨酸的药物组合物，剂型为颗粒剂。
口服颗粒剂的配方
实施例4含精氨酸和其他糖尿病治疗剂的药物组合物在本实施例中，在磺脲类、双胍类药物、胰岛素药物的片剂配方中，分别添加5wt％含量的精氨酸，制得含精氨酸和其他糖尿病并发症治疗剂的口服片剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种精氨酸的用途，其特征在于，用于制备治疗糖尿病皮肤隐性损害的组合物，其中所述的隐性损害选自下组(a)皮肤组织糖含量高于正常值，即大于0.3963mg/克皮肤组织；(b)皮肤组织糖基化终末产物含量高于正常值，即大于22.6±5.1μ/mg羟脯氨酸；(c)皮肤组织的表皮厚度小于正常值，即小于0.0318±0.007mm；(d)皮肤组织中表皮细胞处于G2/M期的细胞比例低于正常值，即小于2.22％；真皮细胞中处于S期的细胞比例高于正常值，即高于17.17％；(e)无创伤皮肤组织出现炎症反应。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物含有占组合物总重量0.01％-99％的精氨酸。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物含有占组合物总重量0.1％-90％的精氨酸。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还含有选自下组的物质胰岛素、生长因子、生长激素、其它各种氨基酸、微量元素、维生素。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物用量为每天0.01-10mg/kg体重，按精氨酸计。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物用量为每天0.1-5mg/kg体重，按精氨酸计。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为保健品。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为药物组合物。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、或酏剂。
10.一种糖尿病保健品，其特征在于，含有10-900mg/g的精氨酸和可接受的载体或稀释剂。
全文摘要
本发明公开了一种精氨酸的用途，它用于制备治疗糖尿病皮肤隐性损害的组合物，其中所述的隐性损害包括(a)皮肤组织糖含量高于正常值；(b)皮肤组织糖基化终末产物含量高于正常值；(c)皮肤组织的表皮厚度小于正常值；(d)皮肤组织“增而不殖”；(e)无创伤皮肤组织出现异常炎症反应。“隐性损害”是导致糖尿病患者皮肤变薄的重要原因，而精氨酸能够显著改善治疗这种隐性损害，使糖尿病患者的皮肤回复至接近正常厚度。
文档编号A61P17/00GK1568957SQ0314158
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月14日 优先权日2003年7月14日
发明者陆树良, 谢挺, 葛奎 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院