专利名称：抗蠕虫的蒽醌及其使用方法
相关申请的交叉参照本申请要求2002年4月15日提交的临时申请系列号60/372,576和2002年6月17日提交的临时申请系列号60/389,368的优先权。关于在全联邦范围内的资助的研究或开发项目的声明不适用(Not applicable)关于“用光盘(Compact Disc)提交的计算机列出的附件”不适用发明背景(1)发明领域本发明涉及蒽醌，它是抗蠕虫的并特别用于抑制体内和体外血吸虫属虫株(Schistosoma sp.)的组合物中。优选的蒽醌具有下式 其中R1、R2、R3和R4各自为氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物或它们的组合，R为含1-12个碳原子的基团，例如甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物或它们的组合，所述卤素是I、F、Br或Cl。在具体实施方案中，所述蒽醌具有下式
其中R为含1-12个碳原子的基团，例如甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物和它们的组合。
(2)相关领域的描述血吸虫病是由血吸虫属的寄生复殖吸虫引起的一种疾病，它折磨着全世界至少2亿人，还令另外6亿人处于风险中(Chitsula等，ActaTrop.7741-51(2000))。慢性血吸虫感染可引发多种病情，包括腹泻、肝纤维化和门静脉高压、中枢神经系统疾病、肺小动脉栓塞和血尿。虽然已知大量血吸虫，但似乎只有五种主要引起人体感染，它们包括曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、湄公河血吸虫(Schistosoma mekongi)、刚果血吸虫(Schistosoma intercalatum)和埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)。
羟氨喹这些复殖血吸虫有复杂的生命周期，其中自由游动尾蚴借助淡水软体动物中间宿主来形成，它们经口吸盘或粘液分泌附着在皮肤上并通过释放分解蛋白的酶穿透真皮而感染人体。同时，该尾蚴脱去其尾部而转化为血吸虫幼虫，在进入系统循环之前，它进入静脉血管系统，由此被送到心脏和肺部。最终，所述血吸虫幼虫到达肝部，它们在此长成性成熟的成虫。雄性和雌性成为交配对，从门静脉移出，最终根据所述血吸虫的具体种类到达肠系膜或膀胱静脉，一般3-5年开始产卵。所述卵往往引起宿主免疫响应，从而导致肉芽瘤的形成，并引起具有临床症状的后遗症(Bica等，Infect.Dis.Clin.N.Am.14637-642(2000)；Elliot，Gastroenterol.Clin.N.Am.25599-624(1996)；Morris和Knauer，Sem.Respir.Infect.12159-170(1997)；Schafer和Hale，Curr.Gastroenterol.Reports 3293-303(2001))。
对血吸虫属感染的可供选择的化学治疗措施有限，选择的药物是吡嗪并异喹啉(pyrazionoisoquinoline)、吡喹酮(Elliot，出处同上)。不幸的是，最近发现的耐吡喹酮的血吸虫属的药物的全球范围的长期使用，已经引起对抗药血吸虫品系开发的关注(Cioli，Parasitol.Today14418-422(1998)和Curr.Opin.Infect Dis.13659-663(2000)；William等，Parasitol.12263-66(2001))。在没有多少其它可供选择的对抗血吸虫病的方案的情况下，迫切需要开发治疗和预防血吸虫属感染的新方法(Cioli，出处同上)。
在亚洲，萱草属根(Daylily roots)(萱草spp.(Hemerocallis spp.)，百合科(Hemerocallidaceae))已用于治疗血吸虫病(Shiao等，ActaPharma.Sinica 9218-224(1962)；Shiao等，Acta Pharma.Sinica 9217-224(1962))。然而，由于与给予人体萱草根提取物相关的对宿主的毒副作用和死亡，所述方法已不受欢迎(Wang等，Phytochem.281825-1826(1989))。以往对起治疗性作用的萱草根的活性成分鉴定的努力，导致对称为stypandrol(Wang和Yang，1993)的神经毒素联二萘四醇的分离，已表明它引起哺乳动物瘫痪、失明和死亡(Main等，Aust.Vet.J.57132-135(1981)；Colegate等，Aust.J.Chem.381233-1241(1985))。在另一篇Chen等的报告(Acta Pharma.Sinica 9579-586(1962))中，研究者分离出一种黄色粉末，作者将抑制血吸虫属的生物活性和与萱草根的使用相关的毒副作用归因于它；然而，其结构从未确定。尽管其它研究已描述发现于萱草属的其它化合物，但这些努力全都没有满足对萱草根中生物活性杀血吸虫的化学成分的完全定性的需要。
现有技术已知的有抗蠕虫活性的化合物，例如奥沙尼喹、敌百虫和4-(4-硝基苯胺基)-苯基异硫氰酸酯，描述于Loewe等的美国专利4,117,156号中。然而，奥沙尼喹只对曼氏裂体吸虫有效，对雄虫比对雌虫更有效，但对未成熟的蠕虫不起多少作用，而敌百虫只对埃及血吸虫有作用。Gulliya等的美国专利第5,091,385、5,177,073和5,489,590公开了一种治疗混合物，它包括能杀死肿瘤、细菌、病毒和寄生物例如血吸虫属的光活性化合物，使用前用光活化剂例如化学品、辐照(优先用激光辐照)、γ射线或电极电位装置产生的电子活化光活性化合物。所述光活性化合物包括对蒽醌的总的推荐。
综上所述，仍需要具有抗蠕虫活性的新化合物，以增加温血动物包括人类对抗蠕虫感染的药物贮备。
发明概述本发明提供一种通过使所述蠕虫接触抑制量的一种或多种蒽醌抑制体外或体内蠕虫例如包括血吸虫属的那些蠕虫的方法。所述蒽醌可被卤素例如I、F、Br和Cl于环上取代，特别是环上无羟基的位置上。环上的取代基也可包括一种或多种卤素。
本文所用的术语“抑制”指限制所述蠕虫或细胞的生长，使所述蠕虫或细胞停止生长，或者杀死所述蠕虫或细胞。因此，该术语包括对所述蠕虫或细胞的任何不利的作用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种抑制寄生蠕虫的方法，它包括使所述蠕虫接触抑制量的蒽醌。
具体说来，本发明提供一种抑制寄生蠕虫的方法，它包括使所述蠕虫接触抗蠕虫量的至少一种下式的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，所述卤素选自I、F、Br和Cl。
本发明还提供一种抑制寄生蠕虫的方法，它包括使所述蠕虫接触抗蠕虫量的至少一种下式的蒽醌 其中R是含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
本发明还提供一种抑制血吸虫属虫株(Schistosoma sp.)的方法，它包括使所述血吸虫属虫株接触抑制量的至少一种下式的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，所述卤素选自I、F、Br和Cl。
本发明还提供一种抑制血吸虫属虫株的方法，它包括使所述血吸虫接触抑制量的至少一种下式的蒽醌 其中R是含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
在上述方法的一个优选实施方案中，所述蒽醌为1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)、1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)或两者，所述抑制既可是体内的也可是体外的。
在上述方法的又一实施方案中，所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下具有抑制作用。
本发明还提供一种在感染致病吸虫的温血动物或人体中抑制致病吸虫的方法，它包括(a)提供一种组合物，它含有在药学上可接受的载体中的抑制量的至少一种选自1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)和1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)的蒽醌；和(b)给予所述温血动物或人体所述组合物以抑制致病吸虫。具体组合物是一种治疗血吸虫属的血吸虫皮炎的局部用组合物。
在所述方法的又一实施方案中，所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下具有抑制作用。
在所述方法的另一实施方案中，所述蒽醌经口服、皮下、腹腔内、局部、静脉内、局部、鼻内或直肠给予所述温血动物和人。
本发明还提供一种抑制受致病吸虫感染的温血动物或人体内的致病吸虫的方法，它包括(a)提供一种组合物，它含有在药学上可接受的载体中的抑制量的1，2，8-三羟基-3-甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物7)和至少一种选自1，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物4)和1，8-二羟基-2-O-丙二酰基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物5)的蒽醌；和(b)给予所述温血动物或人体所述组合物以抑制致病吸虫。
所述方法的又一实施方案中，所述组合物还包括抑制量的至少一种选自1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)和1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)的蒽醌。
在所述方法的又一实施方案中，所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下具有抑制作用。
所述方法的另一实施方案中，所述蒽醌向所述温血动物或人体口服、皮下、腹腔内、局部、鼻内、静脉内或直肠给药。
在上述方法的一个优选实施方案中，所述蒽醌选自1-羟基-2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌(化合物1)、2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌一乙酸酯(化合物1a)、1-羟基-2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌(化合物2)、2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌一乙酸酯(化合物2a)、1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)、1，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物4)、1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)和1，8-二羟基-3-羧基蒽醌(化合物8)，所述抑制可以是体内或体外抑制。
在上述方法的又一实施方案中，所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下具有抑制作用。
本发明还提供一种抗蠕虫的组合物，它包括(a)至少一种下式的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，所述卤素选自I、F、Br和Cl；和(b)药学上可接受的载体，优选其中所述组合物含有每毫升或每克所述载体约1-1,000微克所述蒽醌。
优选地，所述蒽醌具有下式
其中R是含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
更优选地，所述蒽醌选自1-羟基-2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌(化合物1)、2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌一乙酸酯(化合物1a)、1-羟基-2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌(化合物2)、2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌一乙酸酯(化合物2a)、1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)、1，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物4)、1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)和1，8-二羟基-3-羧基蒽醌(化合物8)。
本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
本发明还提供一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式 目的因此，本发明的目的是提供组合物，例如本文公开的具有抗蠕虫活性的蒽醌。
本发明的另一目的是提供使用所述蒽醌抑制蠕虫感染温血动物包括人体的方法。
本发明的又一目的是提供使用所述蒽醌抑制致病吸虫例如感染温血动物包括人体的那些血吸虫属的方法。
参考下列附图和优选的实施方案，本发明的这些和其它目的将变得更加明显。
图1是表明从重瓣萱草Kaempferi(hemerocallis fulva“Kwanzo”Kaempfer)(1712)的萱草根分离出的化合物1-12的化学结构图。Ac指乙酰基例如-COCH3。
图2A表明用于确立化合物1(kwanzoquinone A)结构的差向NOE(difference NOE)(→)和远程COSY(long-range COSY)(-)相关性。
图2B表明用于确立化合物2(kwanzoquinone B)结构的差向NOE(→)和远程COSY(-)相关性。
图3表明用于确定化合物5(kwanzoquinone D)结构的选择的HMBC相关性。
图4表明用于确定化合物6(kwanzoquinone E)结构的选择的HMBC相关性。
图5表明用于确定化合物11(5-羟基dianellin(5-hydroxydianellin))结构的选择的HMBC相关性。
图6表明化合物3(2-羟基大黄酚)和化合物6(kwanzoquinone E)对曼氏裂体吸虫尾蚴的活动性的剂量反应效果。根据侵入性水生幼虫阶段的运动和游动行为确定活动性。
图7是表明尾蚴活动性的抑制百分率与化合物3(B)和6(F)浓度的函数关系的图。
发明详述本说明书中引用的所有的专利、专利申请、官方出版物、官方条例和参考文献通过引用全文结合到本文中。有冲突时，可对照本说明书，包括定义。
本发明提供蒽醌及其用作抗蠕虫化合物，以对抗温血动物包括人体的蠕虫感染的方法。具体说来，所述蒽醌是羟基蒽醌，其与普通蒽醌一起，本身被用于抗蠕虫用途，相信是现有技术中未知的。羟基取代的蒽醌可如Khan等在Synthesis 255-257(1994)和Cameron等在Tetrahedron Letters 274999-5002(1986)中所述经合成生成，或如下所述从植物来源例如萱草属(萱草)根中分离。
本文实施例描述了用己烷、EtOAc和MeOH萃取重瓣萱草(H.Fulva(Kwanzo))根。选择所述己烷和MeOH萃取物进一步研究，接着用包括硅胶MPLC和PTLC、ODS MPLC和制备型HPLC的层析和结晶法结合处理，从而发现和分离出九种新蒽醌，kwanzoquinoneskwanzoquinone A(化合物11-羟基-2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌)、kwanzoquinone A单乙酸酯(化合物1a2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌一乙酸酯)、kwanzoquinone B(化合物21-羟基-2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌)、kwanzoquinone B单乙酸酯(化合物2a2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌一乙酸酯)、kwanzoquinone C(化合物41，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌)、kwanzoquinone D(化合物51，8-二羟基-2-丙二酰基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌)、kwanzoquinone E(化合物61，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌)、kwanzoquinone F(化合物71，2，8-三羟基-3-羟基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌)和kwanzoquinone G(化合物91，8-二羟基-2-甲基-3-羧基蒽醌)及新萘苷(化合物115-羟基dianellin)。这些新化合物和已知化合物3(称作1，2，8-羟基-3-甲基蒽醌或2-羟基大黄酚)、10(dianellin)和12(6-甲基藤黄菌素)的那些化合物的结构和完整的1H和13C NMR光谱排列根据完全的1D和2D NMR研究确定，并由本文首次公开。上述化合物的结构示于图1中。所述蒽醌溶解于各种质子和非质子溶剂，它包括但不限于，DMSO、醇例如乙醇、碱性氢氧化物水溶液、Na2CO3溶液和NH3溶液。
当测试所述蒽醌的抗蠕虫活性时，发现化合物3和6有抗蠕虫活性。发现浓度约25μg/mL的化合物3在接触约15秒内快速固定血吸虫属尾蚴，并在接触24小时后杀死约50％的尾蚴。在3.125μg/mL浓度时，在接触约45分钟的时间内固定尾蚴。也发现约25μg/mL浓度的化合物6固定尾蚴，但超过约12-14分钟的时间范围。然而，在接触24小时后化合物6杀死所有尾蚴。化合物4和5可水解为化合物3，化合物7可水解为化合物6。这些结果表明蒽醌，特别是化合物3和6具有不同的作用模式，但两者单独或结合都可用于治疗蠕虫感染。
因此，本发明的用作抗蠕虫化合物的蒽醌，既包括本身有抗蠕虫活性的特殊蒽醌化合物，又包括在蠕虫或温血动物包括人体的肠道内水解或体外水解生成有抗蠕虫活性的化合物的蒽醌化合物。例如，带糖取代基的蒽醌(化合物4、5和7)可在所述化合物给予蠕虫或温血动物包括人体后，在其肠道内水解生成有抗蠕虫活性的蒽醌。
所述蒽醌尤其用于抑制蠕虫，特别是那些在人类医学中重要的那些蠕虫的治疗方法。这些蠕虫包括残存于肠道的那些蠕虫，例如钩虫具体为钩虫属或板口线虫属，和残存于血液中的那些蠕虫例如血吸虫属的寄生复殖吸虫，具体为埃及血吸虫、曼氏裂体吸虫、湄公河血吸虫、刚果血吸虫和日本血吸虫。
有抗蠕虫活性并因此而用作抗蠕虫化合物的蒽醌具有下列化学通式 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，所述卤素选自I、F、Br和Cl。
在一具体实施方案中，所述蒽醌具有下面的化学通式 其中R是含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
有抗蠕虫活性的上述化学通式的优选蒽醌是1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌，它是从萱草属分离出的化合物3，其俗名为2-羟基大黄酚，其化学式如下
，及1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌，它是从萱草属分离出的新化合物6，已给出其俗名kwanzoquinone F，其化学式如下 蒽醌可在体外或体内例如蠕虫或温血动物或人体的肠道内水解成有抗蠕虫活性的蒽醌，其也用作抗蠕虫化合物。这些蒽醌有化学通式A 或化学通式B 各式中，R选自含1-12个碳原子的低级烷基、取代的低级烷基，醛基、碳水化合物和酸基。
能水解成有抗蠕虫活性的蒽醌、具有化学通式A的优选蒽醌包括1，8-二羟基-2-O-β-吡喃葡萄糖苷-3-甲基蒽醌，它是从萱草属分离出的新化合物4，已经给出其俗名kwanzoquinone D，其化学式如下
及1，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷((1→6)丙二酰基)-3-甲基蒽醌，它是从萱草属分离出的新化合物5，已给出其俗名kwanzoquinone E，其化学式如下 能水解成有抗蠕虫活性的蒽醌的具有化学通式B的优选蒽醌是1，2，8-三羟基-3-甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-蒽醌，它是从萱草属分离出的新化合物7，已给出其俗名kwanzoquinone F，其化学式如下 从化合物4和5的化学式可明显看出，当其任一化合物体内或体外水解时，都被水解为化合物3。当化合物7体内或体外水解时，它水解为化合物6。如本文所显示的，化合物3和6都有抗蠕虫活性。
治疗感染蠕虫特别是致病吸虫例如血吸虫的温血动物或人(患者)的方法包括向所述温血动物或人体提供抗蠕虫组合物，它包含作为活性成分的抑制量的一种或多种蒽醌，优选一种或多种选自化合物3、4、5、6和7的蒽醌。
例如，在一实施方案中，向所述温血动物或人体提供抑制量的化合物3或6。在另一优选实施方案中，向所述温血动物或人体提供抑制量的化合物3或6。在又一实施方案中，向所述温血动物或人体提供抑制量的至少一种选自化合物4、5和7的化合物。在又一实施方案中，向所述温血动物或人体提供抑制量的化合物7和抑制量的至少一种选自化合物4和5的化合物。在又一实施方案中，向所述温血动物或人体提供抑制量的化合物3和抑制量的化合物7。在又一实施方案中，向所述温血动物或人体提供抑制量的化合物7和抑制量的至少一种选自化合物4和5的化合物和抑制量的至少一种选自化合物3和6的化合物。显而易见，包括前述化合物的具体组合的其它实施方案可在抗蠕虫组合物中作为活性成分抑制蠕虫，特别是致病吸虫例如血吸虫属的那些。在前述组合物中，所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下有抑制作用。
因为从萱草属分离出的蒽醌是抗蠕虫的，无须在向温血动物或人体给药前活化，所以含蒽醌的抗蠕虫组合物可包括各种向温血动物或人体给予蒽醌的方案。而且，可在非医疗环境下(医院和诊所外)向温血动物或人体给予所述抗蠕虫组合物，而能获得活化剂的医疗环境是有限的、昂贵的，或不存在的。
在一优选实施方案中，为治疗温血动物包括人的蠕虫感染或抑制感染，向所述温血动物或人体提供抑制量的在药学上可接受的载体中的一种或多种蒽醌。因此，与药用载体物质一起的蒽醌经本领域熟知的方法例如通过常规混合、制粒、包衣、悬浮和包胶囊方法加工成用于口服、直肠或其它给药方式的常规制剂。例如，可通过使一种或多种蒽醌与固体药物载体相混合；任选对所生成的混合物制粒；如果需要和/或任选在加入适用的辅助剂后将所述混合物或颗粒加工成片剂或糖衣丸芯的形式，得到口服应用的抗蠕虫蒽醌制剂。
适用于固体制剂的药物载体具体有填充剂例如糖例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇、纤维素制剂和/或磷酸钙例如磷酸三钙或磷酸氢钙；和粘合剂，例如在用玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉的情况下的例如淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮、带部分游离官能团的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯；和/或，如果需要，泡腾剂，例如上述淀粉，及羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。辅料主要有流动调节剂和润滑剂，例如，硅酸、滑石、硬脂酸或其盐，例如硬脂酸镁或硬脂酸钙。提供带有适当包衣的糖衣丸芯，以任选抵抗胃液，其中尤其任选采用含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮和/或二氧化钛、在含水溶剂中的漆溶液的浓缩糖液，或含部分游离官能团的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯的溶液，或含或不含适用软化剂例如邻苯二甲酸酯或三醋精的适用纤维素制剂例如乙酰基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯的溶液，制备抵抗胃液的包衣。例如，为区分或标记活性成分的各种剂量可在所述片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素。
可口服给药的包括一种或多种蒽醌的其它抗蠕虫制剂有硬明胶胶囊，以及由明胶和，如果需要，软化剂例如甘油或山梨醇制备的硬或软密封胶囊。所述硬明胶胶囊可含有一种或多种，例如与填充剂例如玉米淀粉、任选成颗粒的小麦淀粉、粘合剂或润滑剂例如滑石、硬脂酸镁或胶态硅酸，和任选的稳定剂相混合的呈颗粒状的蒽醌。在密封胶囊内，一种或多种蒽醌呈粉末或颗粒状；或优选以在适用溶剂中的悬液的形式存在，为稳定所述悬液可加入例如甘油单硬脂酸酯。
口服给药的其它抗蠕虫制剂有，例如，经常规方法制备的含水悬液，所述悬液含一种或多种呈悬浮态的蒽醌，其浓度使单剂量充分满足要求。所述含水悬液包含最小量的稳定剂和/或调味剂，例如增甜剂例如糖精钠，或作为糖浆含有一定量的糖和/或山梨醇或类似物质。适用的还有，例如，shakes制剂的浓缩液或浓缩悬液。这样的浓缩液也可以单剂量包装。
直肠给药的适用的抗蠕虫制剂有，例如，由一种或多种蒽醌与栓剂基质的混合物组成的栓剂。这类物质具体有天然或合成的甘油三酯混合物。适用的还有明胶直肠胶囊，它由在基质中的一种或多种蒽醌的悬液组成。适用的基质有，例如，高级或尤其是中级饱和脂肪酸的液体甘油三酯。
同样特别关注的有含细研过的一种或多种蒽醌的制剂，优选5μm或更小的平均粒径的蒽醌，它与淀粉，特别是玉米淀粉或小麦淀粉，还有，例如马铃薯淀粉或大米淀粉相混合。所述制剂优选采用在带有锋利叶片搅拌装置的高速混合器中快速混合的方法制备，例如，混合时间在3-10分钟之间，有大量组分时，如果需要时冷却。在此混合过程中，随着部分颗粒的尺寸的不断减小，一种或多种所述蒽醌的颗粒被均匀沉积到所述淀粉颗粒上。所述混合物可与常用的例如上述的辅助剂一起被加工成固体剂量单位形式；即，例如被压制成片剂或糖衣丸或装入胶囊中。然而，它们也可作为含水悬液制剂的浓缩液(例如含5-20倍的量的水)直接，或加入辅助剂(例如，药学上可接受的湿润剂和分散剂，例如聚氧乙烯失水山梨醇与高级脂肪酸的酯或月桂基硫酸钠，和/或调味物质)后使用。除了使所述蒽醌/淀粉混合物与表面活性物质或与其它辅助剂混合外，还可将这些物质加入水中以用于制备所述悬液。由一种或多种蒽醌/淀粉混合物和任选辅助剂组成的用于制备悬液的浓缩液可以单一剂量，如果需要以密闭和防潮的方式包装。
而且，所述抗蠕虫制剂可腹腔内、鼻内、皮下或静脉给药。一般说来，对腹腔内、鼻内、皮下或静脉给药，要提供经溶解、悬浮或乳化于含水或非水溶剂例如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中的一种或多种抗蠕虫蒽醌；并且如果需要，还可含常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。优选地，以在温血动物，尤其是人的腹腔内、皮下或静脉应用可接受的组合物形式提供一种或多种抗蠕虫蒽醌。
本发明的抗蠕虫制剂包括适于向温血动物尤其是人体给药的浓度的一种或多种蒽醌，根据给药方式，其浓度约为0.3％-95％，优选约2.5％-90％。对悬液，该浓度通常不高于30％，优选约2.5％；相反，在含一种或多种所述蒽醌的片剂、糖衣丸和胶囊的情况下，其浓度优选不低于约0.3％，以确保所需剂量的一种或多种蒽醌的容易吸收。用包含一种或多种蒽醌的制剂治疗感染寄生蠕虫的温血动物或人优选通过单一的口服、直肠、腹腔内、鼻内、皮下或静脉给药的量进行，所述量含有足以实际上使温血动物或人体完全免受寄生蠕虫感染的一种或多种蒽醌剂量，即该量足以治疗由寄生蠕虫引起的温血动物或人体感染或抑制寄生蠕虫在温血动物或人体内的生长。如果需要，该治疗剂量可分成以几小时至几天的时间间隔给药的几个分剂量。一种或多种蒽醌的给药量取决于待治疗的温血动物或人的种类和总的疾病状况及感染所述温血动物或人的蠕虫的属和种类。
所述蒽醌用于治疗或抑制温血动物和人体的鸡蛔虫(Ascaridiagalli)、毛圆线虫科(trichostrongylidae)例如日本圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)或Nematospiroides dubius、钩虫科(ancylostomatidae)例如美洲钩虫(Necator americanus)和锡兰钩虫(ancylostoma ceylanicum)，及圆线虫科(Strongylidae)；抑制多节绦虫(Cestoda)例如短膜壳绦虫(Hymenolepsis nana)、裸头绦虫科(Anoplocephalidae)和带科(Taeniidae)；尤其是抑制吸虫纲(Trematoda)例如片吸虫属(Fasciolida)例如肝片形吸虫(Fasciola hepatica)，以及特别是血吸虫属(Schistosoma)，例如，曼氏裂体吸虫、日本血吸虫、湄公血吸虫、刚果血吸虫和埃及血吸虫；也抑制丝虫病病原体例如，棘唇线虫(dipetalonema witei)和棉鼠丝虫(Litomosoides carinii)的感染。因此，本发明的抗蠕虫制剂可用于治疗例如上述的寄生蠕虫感染的温血动物和人，尤其用于治疗被血吸虫病、钩虫感染或丝虫病感染的温血动物和人体。
所述蒽醌也用于处理淡水以固化和/或杀死致病蠕虫，尤其是水中的血吸虫尾蚴。因此，所述蒽醌用于减少淡水湖、塘、溪、河、池等中的血吸虫属的数量或消灭其中的血吸虫属的灭除步骤。一般说来，通过向水面喷洒或向水面下的水体注入的方式将包含一种或多种蒽醌的溶液应用于水体。或者，以干燥形式的所述一种或多种蒽醌应用于所述水体。
下列实施例旨在进一步增加对本发明的理解。
实施例1本实施例说明从萱草属提取和分离kwanzoquinones。
于1999年8月，从Perennial Patch(Wade，North Carolina)购得重瓣萱草(Kwanzo)植物。2001年4月收割前，该植物生长于密执安州州立大学校园(Michigan State University Campus)区。除去124株植物的叶子，洗涤其树根和树冠并于-4℃冷冻。将冷冻过的根冻干并于WARING搅拌器中研磨得到2.2kg的浅棕色细粉。
为分离和纯化化合物1-12，要用到SEPHADEX LH-20(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)、Fischer Scientific(Pittsburgh，Pennsylvania)的硅胶(40-63μm粒径)、Supelco(Bellafonte，Pennsylvania)的AMBERLITE XAD-16树脂、Dychrom(Santa Clara，California)的LC-SORB SP-A-ODS胶(25-40μm粒径)和Ahaltech，Inc.(Newark，Delaware)的硅胶PTLC板(20×20cm；250、500和1000μm厚)。用日本Analytical Industry公司的型号为LC-20带JAIGEL-C18柱(10μm，20mm×250mm)的再循环制备型HPLC进行制备型HPLC。所有的溶剂和化学品购自Spectrum Laboratory Products，Inc.(New Brunswick，New Jersey)并达到ACS分析级。
用3×8L份的己烷、乙酸乙酯和甲醇相继萃取冻干的根(2.0kg)，分别得到25、23和130g萃取物。使己烷萃取物再溶解于500mL己烷中，并分配于3×500mL份的甲醇中。汇集该甲醇的流分，得到15g萃取物，将其用于硅胶VLC并用4L己烷、3L己烷-丙酮(9∶1)和3L己烷-丙酮(3∶2)洗脱。在采用100％己烷-100％丙酮的梯度条件下，使己烷洗脱液(8.5g)经硅胶MPLC，收集到200mL流分。用TLC分析所有流分，根据其分布的相似性汇集，得到流分A1-A4。
在100％己烷至己烷-丙酮(1∶1)的梯度条件下，使得自硅胶VLC的己烷-丙酮(9∶1)洗脱液经硅胶MPLC，得到流分B1-B4。
在100％己烷至100％EtOAc梯度条件下，经硅胶MPLC再层析流分B2(1.5g)，收集到200mL流分，根据TLC分布汇集，得到流分C1-C4。
基于TLC的进一步检测汇集流分A3(1g)、A4(1g)、C2(300mg)和C3(300mg)，并施加于硅胶MPLC。在100％己烷至100％CHCl3至CHCl3-乙醇(1∶1)梯度条件下洗脱，收集18mL流分D1-D90。
汇集流分D1-D10(500mg)，于100％己烷至己烷-丙酮(97∶3)梯度条件下进一步经硅胶MPLC，收集到15mL流分E1-E40。
流分E6-E20(200mg)基本上由一种主要组份组成，故收集后经硅胶PTLC，相继用己烷-EtOAc(10∶1)(72mg)、己烷-乙醚(6∶1)(51mg)和苯-CHCl3(20∶1)洗脱，得到30mg透明油状的α-生育酚，它表现出的光谱特性与文献(Baker和Myers，Pharmacol.Res.8763-770(1991))中报道的那些相同。
合并流分D12-D45(300mg)，施加于硅胶PTLC板上，于苯-CHCl3(10∶1)中展开两次。得到亮黄色条(44mg)，从硅胶萃取后，使其溶解于最小体积的CHCl3中，逐滴加入己烷，直到仅见轻微程度的混浊。所述溶液贮存于-20℃，得到黄色细针状晶体的化合物1和2的不可分的1∶1混合物(基于1H NMR)(12mg)。使两种化合物1和2及其单乙酸酯1a和2a(由Ac2O/吡啶制备)经各种层析技术包括其它硅胶TLC和MPLC，以及ODS MPLC和ODS制备型HPLC，但都不能分离这两种化合物。
使所述根的MeOH萃取物溶解于800mL MeOH-H2O(3∶1)并置于4℃直到生成沉淀。离心(16,000xg，15分钟，4℃)所述混合物，滗析上清液，得到30g萃取物。将其施加于XAD-16树脂柱，用10L H2O、6L 25％MeOH水溶液和8L 100％MeOH洗脱。使该MeOH洗脱液(18g)溶解于500mL H2O中，用CHCl3(3×300mL)分配。汇集CHCl3流分，干燥，得到2g萃取物，将其施加于ODS MPLC，并用50-100％MeOH洗脱，收集到16mL流分F1-F166。汇集流分F116-F125，得到100mg残余物，使其溶解于MeOH-丙酮(3∶1)，并于-20℃贮存，得到7mg化合物8，为黄色粉末。将其物理和光谱数据与文献(Danielsen和Aksnes，Magn.Reson.Chem.30359-360(1992))所报道的那些数据相比，确定化合物8为大黄酸。
使经CHCl3分配的含水相(16g)溶解于50mL MeOH中，边搅拌边缓慢加入450mL丙酮，将该混合物于4℃放置。将上清液(14g)施加于ODS MPLC，在梯度条件下用45-100％MeOH洗脱，得到750mL流分G1-G6。将流分G3(1g)再次施加于ODS MPLC，在梯度条件下用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(25∶25∶50∶0.1-30∶30∶40∶0.1)洗脱，得到流分H1-H6。将流分H5(170mg)施加于SEPHADEX LH-20，用MeOH洗脱。洗脱出的主要组分为黄色条状物(25mg)，经ODS制备型HPLC进一步纯化，用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(50∶20∶30∶0.1)洗脱，得到16mg化合物9，为黄色粉末。
在梯度条件下，将流分G1(10g)施加于ODS MPLC，用10-50％CH3CN洗脱，收集到550mL流分11-17。将流分13(410mg)经SEPHADEX LH-20层析，用MeOH洗脱，得到80mg黄色非晶形固体。所述原料经连续硅胶PTLC层析进一步纯化，用EtOAc-CHCl3-MeOH-H2O-HCOOH(65∶25∶10∶0.8∶0.1)(75mg)和CHCl3-MeOH-H2O(8∶2∶1)(70mg)先后洗脱。经ODS制备型HPLC的最终纯化，用60％MeOH洗脱，得到61mg化合物10，为透明黄色玻璃状固体。
将流分14(1.5g)施加于SEPHADEX LH-20，经MeOH洗脱，得到150mL流分11-16。汇集流分13-16(400mg)、17(300mg)和H2-H4(700mg)，在梯度条件下经ODS MPLC，用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(20∶20∶60∶0.1-40∶40∶20∶0.1)洗脱，收集到16ml流分K1-K105。合并流分K22-K38(430mg)，经SEPHADEX LH-20层析，用MeOH洗脱，得到流分L1-L2。将流分L1(300mg)施加于硅胶PTLC，用CHCl3-MeOH-H2O(8∶2∶0.1)展开两次，得到单一谱带，其经ODS制备型HPLC进一步纯化，用60％MeOH洗脱，得到31mg化合物11，为透明玻璃状固体。
将流分L2(130mg)施加于SEPHADEX LH-20，用MeOH洗脱，得到80mg黄色非晶形固体。使该原料溶解于MeOH，置于-20℃下，得到62mg沉淀。该沉淀经ODS制备型HPLC层析两次，用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(40∶15∶45∶0.1)洗脱得到30mg黄色固体。在梯度条件下用60-100％MeOH进一步纯化(制备型HPLC)，得到单一流分，真空下还原，并置于-20℃下，得到1mg化合物7的黄色粉末。
合并流分K50至K55(98mg)，经SEPHADEX LH-20层析，用MeOH洗脱，收集到125mL流分M1-M5。使流分M5(40mg)溶解于MeOH，并置于室温下，得到25mg化合物4的黄色细针状晶体。
收集流分K56-K62(130mg)，并施加于SEPHADEX LH-20，用MeOH洗脱，得到流分N1-N3。流分N1(50mg)再经SEPHADEX LH-20层析，用MeOH洗脱，得到流分(35mg)，经ODS制备型HPLC层析，用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(50∶20∶30∶0.1)洗脱。收集到单一流分，真空浓缩，置于-20℃，得到6mg化合物5的金黄色针状晶体。流分N2(7mg)经ODS制备型HPLC进一步纯化，用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(50∶20∶30∶0.1)洗脱，得到1mg化合物12的黄色玻璃状固体。
汇集流分K63-K77，经SEPHADEX LH-20，用MeOH洗脱，得到100mL流分01-05。流分03(30mg)经ODS制备型HPLC，用CH3CN-MeOH-H2O-TFA(50∶20∶30∶0.1)洗脱，得到6mg黄色非晶体固体。该原料经同样条件下的ODS制备型HPLC进一步纯化，真空还原所生成的流分，并置于-20℃，得到4mg化合物6的黄色细针状晶体。
真空浓缩流分K94-K100至干，得到13mg橙色非晶体固体。使该原料溶解于最小体积的MeOH，置于-20℃，得到7mg化合物3的橙色针状晶体。
所得的12种化合物的产量示于表1中。
表1从重瓣萱草“Kwanzo”根分离的12种化合物的产量化合物产量(mg/kg)化合物产量(mg/kg)1 4.8 7 0.92 4.8 8 4.73 11.1 9 8.24 18.0 10 30.55 5.7 11 15.56 3.8 12 0.5表2表明己烷、乙酸乙酯和甲醇对2.0kg冻干根的萃取物的产量和各萃取物中化合物的产量。
表2
2.0kg冻干根的萃取物中化合物的产量产量己烷萃取物乙酸乙酯萃取物 甲醇萃取物化合物 (25g) (23g)(130g)总产量1+2 19mg- - 19mg3- 15.4mg 16.7mg 22.1mg8- 9.3mg - 9.3mg4- 1.0mg 34.9mg 35.9mg5- - 11.4mg 11.4mg6- 3.4mg 4.1mg 7.5mg1a+2aNA NA NA NA9- - 16.3mg 16.3mg10 - - 31mg31mg11 - - 61mg61mg7- - 1.8mg 1.8mg实施例2化合物1和2的物理特征鉴定如下。
1H NMR谱分别在Varian VRX(500MHz)和Varian INOVA(600MHz)装置(Palo Alto，California)上500和600MHz处纪录。用VarianVRX装置在125MHz处得到13C NMR谱。用CDCl3得到化合物1和2的NMR谱。标准脉冲程序用于所有1D(1H、13C、DEPT、选择性1H去偶合和差向NOE)和2D(DQF-COSY，远程COSY、NOESY、HMQC和HMBC)NMR实验。用JOEL AX-505H双聚焦质谱仪在70eV处运行分析EIMS和用JOEL HX-110双聚焦质谱仪(Peabody，Massachusetts)以阳离子模式进行FABMS实验，用密执安州州立大学质谱设备(Mass Spectrometry Facility)得到质谱。用Shimadzu UV-260记录分光光度计(Kyoto，Japan)纪录EtOH中的UV光谱。经用WinFIRST软件的Mattson Galaxy Series FTIR 3000(Thermo Nicolet，Madison，Wisconsin)得到IR光谱。用Perkin-Elmer Polarimeter 341(Shelton，Connecticut)测定旋光性。用Thomas Model 40 Hot Stage(Philadelphia，Pennsylvania)测定熔点。
己烷萃取物经一系列层析步骤，从而在从CHCl3-己烷结晶后，分离出12mg黄色细针状晶体。该产物的1H和13C NMR谱的最初检测表明大部分质子与碳原子信号成对，这意味着它可能是由多于31个独特碳原子核组成的大二聚化合物。然而，正FABMS表明，在m/z295[M+H]+的主要信号提示该产物是分别具有式C18H14O4的两个结构相关的异构体的混合物。这从m/z 273[M+H-H2O]+的明显的碎片离子的出现得到支持。HMBC实验也提供了其它证据，表明两套代表各由18个碳和14个质子自旋组成的两个化合物的2-3JCH连结(connectivities)的轮廓(contours)。采用硅胶MPLC和TLC、ODS MPLC和制备型HPLC，和采用多种溶剂系统的结晶法分离此两种化合物的大量努力证明是不成功的。还进行过彼此分离乙酰化产物(1a和2a)的其它尝试，但该方法也是失败的。因此，针对这两种结构异构体的不可分开的1∶1混合物作出化合物1和2的结构阐明和完整1H和13CNMR排布。
确定化合物1和2各由取代的1-羟基蒽醌基团构成。其证据来自m/z295.0971的[M+H]+(计算值为295.0970)HRFABMS和分光镜检研究的结合。化合物1和2在3438(宽，O-H伸展)、1670(C＝O伸展，非螯合)和1633cm-1(C＝O伸展，螯合)处的IR光谱显示出大量的鉴定吸收谱带。显示λ最大＝403nm的UV光谱表明单一迫位羟基官能团的存在(Schripsema等，Phytochem.5155-60(1999))。这得到δH12.90和12.95处显示的两个尖单峰被D2O交换消除的1HNMR谱的支持。化合物1和2中存在单羟基官能团的其它证据来自它们的乙酰化产物1a和2a，两者都在m/z 337.1068[M+H]+(C20H17O5的计算值为337.1076)表现出相同的分子离子，这意味着乙酰基的加入。1a和2a的1H NMR谱在δH12和13之间不再显示任何低磁场峰，而13CNMR谱在δC19.6(-COCH3)和169.0(-COCH3)显示出新信号。
1H NMR和DEPT实验显示在化合物1和2中都存在两个芳基(δC20.2q×2，21.9q和22.0q)和一个乙酰基(δC31.9q×2)甲基。HMBC实验(表3)的数据提供了列出的化合物1和2的这些官能团排布的证据。从远程COSY和差向NOE实验图2A和2B中得到与该结论一致的其它支持。对C-12(两者δH2.59)和1-OH′s(各δH12.95和12.90)的甲基质子辐照，化合物1和2都表现出彼此相反的NOE相关性。此外，注意到C-13(两者δH2.37)的甲基质子和H-4芳族单峰(两者δH7.61)间的NOE增强和远程COSY相关性。总之，这些数据证实了提出的化合物1和2的环B排布。
在C-14(δH2.51s)甲基质子和H-7和H-5(δH8.04s)位质子间，化合物1也在H-7(δH7.58d，J＝7.5Hz)和H-8(δH8.15d，J＝7.5Hz)中表现出NOE增强和COSY的彼此相反的相关性(图2A)。这些证据证实芳族甲基C-14(δH21.9)连在化合物1的环A的6位上。化合物2不同之处在于表明C-14(δH2.51s)的甲基质子和质子H-6(δH7.58d，J＝7.5Hz)和H-8(δH8.05s)间的彼此相反的NOE增强和远程COSY相关性(图2B)。H-6和H-5(δH8.13d，J＝7.5Hz)间的类似的NOE和COSY相关性引起注意。因此，确定芳族甲基C-14(δC22.0)的排布在化合物2的环A的7位上。化合物1和2都是新发现的化合物，已被分别命名为kwanzoquinones A和B，以表示其生物来源。
kwanzoquinones A和B(化合物1和2)黄色针状结晶；熔点165-167℃；UVλ最大(EtOH)212，262，287，403nm，IR(KBr)ν最大3438，1700，1696，1691，1685，1670，1652，1630，1595，1559cm-1；1HNMR13C NMR数据，见表3；HRFABMS m/z 295.0971[M+H]+(C18H15O4的计算值为295.0970)。
表3kwanzoquinones A(1)和B(2)在CDCl3a中的NMR光谱数据1 2位置δh(J，Hz)bδccHMBCdδh(J in Hz)bδccHMBCd1 159.6(s)1-OH 159.6(s) 1-OH1-OH， H- 1-OH，H-2 114.4*(s) 13，H-4 114.5*(s) 13，H-43 144.7f(s) H-4，H-13 144.9f(s) H-4，H-134 7.61(s) 121.5(d)H-13 7.61(s)121.5(d) H-134a 133.1(s)H-4 133.19(s)H-45 8.04(s) 127.8(d)H-14 8.13(d，7.5) 127.7(d) H-66 146.2(s)H-8，H-14 7.58(d，7.5) 135.6(d) H-8，H-147 7.58(d，7.5) 135.1(d)H-5，H-14 145.6(s) H-5，H-148 8.15(d，7.5) 127.1(d)H-78.05(s)127.2(d) H-148a 133.4(s)H-8 131.2(s) H-89 188.1(s)H-8 188.5(s) H-89a 135.7g(s) 1-OH，H-4 135.8g(s) 1-OH，H-410 182.3(s)H-4，H-5 181.9(s) H-4，H-510a130.9(s)H-5 133.0(s) H-511 203.0(s)H-12 203.0(s) H-12122.59(s) 31.9(q)2.59(s)31.9(q)132.37(s) 20.2(q) H-42.37(s)20.2(q) H-4142.51(s) 21.9h(q) H-5，H-7 2.51(s)22.0h(q) H-6，H-81-OH 12.95(s)12.90(s)a于25℃用12mg溶解于带5mm探针的1mL CDCL3的化合物1和2的1∶1混合物纪录所有光谱.b在500MHz纪录.c在125MHz纪录.通过DEPT实验确定峰裂数。dHMBC数据用nJCH＝8Hz纪录，并表示为显示2-3JCH对所示碳偶合的质子.e-h排布可以互换.
实施例3除所有NMR谱纪录于DMSO-d6(Cambridge Isotope Laboratories，Inc.，Andover，Massachusetts)外，如同实施例2确定化合物3的物理特征。所述特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，生成化合物3-12。纯化后，从MeOH中得到化合物3的橙色针状晶体。HREIMS(m/z 270.0532[M]+(C15H10O5的计算值为270.0528))和光谱证据(IR、UV、ID和2D NMR)证实化合物3(1，2，8-三羟基3-甲基蒽醌)先前已经从铁仔(Myrsine africana L.)(紫金牛科)中分离出来，并给出其俗名2-羟基大黄酚(Li和McLaughlin，J.Nat.Prod.52660-662(1989)；Midiwo和Arot，Int.J.BioChemiPhysics 2115-116(1993))。先前的研究只给出了该化合物的部分1H但无13C NMR排列；因此，我们对化合物3进行彻底研究以确定其推定的结构。这是对得自萱草属的化合物3的首次报告以及对其完整的13C NMR光谱数据(表4)的首次报告。
2-羟基大黄酚(化合物3)橙色针状晶体；熔点239-240℃；UVλ最大(EtOH)(logε)208(4.19)，235(4.05)，258(4.11)，426(3.73)nm；IR(KBr)νmax3408，1653，1620，1560，1473，1456，1434，1310，1271，1190，1023cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δH12.04(1H，brs，1-OH)，11.90(1H，s，8-OH)，10.34(1H，brs，2-OH)，7.76(1H，dd，8.0，7.5，H-6)，7.66(1H，dd，7.5，1.0，H-5)，7.55(1H，s，H-4)，7.31(1H，dd，8.0，1.0，H-7)，2.26(1H，s，3-CH3；13C NMR，见表4；EIMS m/z 270[M]+(100)，253(2)，242(8)，213(4)，196(3)，185(2)，168(5)，139(11)；HREIMS m/z270.0532[M]+(C15H10O5的计算值为270.0528)(文献值参照Li和McLaughlin，出处同上；Midiwo和Arot，出处同上)。
表4化合物3-7和9a的13C NMR排布位置 3 4 5 6 7 91194.4s153.9s153.9s149.1s153.4s158.6s2150.2s147.7s147.7s148.4s146.0s131.2s3132.3s141.4s141.5s136.7s145.3s140.4s4122.8d121.5d121.4d119.0d117.9d112.0d4a 123.1s128.02128.0s123.3s128.2s136.2s5119.0d119.0d119.0d119.1d119.1d118.1d6137.3d137.1d137.1d137.4d137.2d135.9d7123.7d124.1d124.0d123.7d124.0d124.2d8161.2s161.2s161.2s161.3s161.2s161.3s8a 115.9s115.9s115.9s116.0s116.1s116.7s9192.2s191.5s191.4s192.3s191.7s189.2s9a 114.3s115.2s115.2s114.6s115.7s122.4s10 180.1s180.8s180.6s180.2s180.8s181.8s10a 133.7s133.2s133.1s133.8s133.3s132.3s11 16.4q 17.2q 17.2q 57.8t 58.1t 19.5q12 167.8s1′102.9d102.8d 102.7d2′74.2d 74.0d 74.1d3′76.3d 76.0d 76.2d4′69.7d 69.7d 69.7d5′77.3d 73.8d 77.2d6′60.8t 63.7t 60.7t1″166.4s2″41.1t3″167.4sa于25℃、125MHz处，以DMSO-d6纪录数据。通过DEPT实验确定峰裂数。并通过HMQC谱分析证实。
实施例4如同实施例3确定化合物4的物理特征。其特性如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物4。所得化合物4呈黄色针状晶体，显示出类似于3的光谱特性。4的IR谱显示3455(宽，O-H伸展)、1671(C＝O伸展，非螯合)和1624cm-1(C＝O伸展，螯合)处的吸收谱带。UV谱出现λ最大＝429nm，这与两个迫位羟基官能团的存在是一致的(Schripsema出处同上；Brauers等，J.Nat.Prod.63739-745(2000)；Li等，J.Nat.Prod.63653-656(2000))。此外，1H NMR光谱显示与D2O可互换的两个低磁场峰(δH12.00s和12.04brs)。这些证据共同支持化合物4的1，8-二羟基蒽醌chromaphore的存在。
FABMS给出的m/z 433[M+H]+表示C21H21O10的分子组成。1HNMR为化合物4中环B和A的取代模式提供了重要的证据。表示在δH7.70(dd，J＝1.0，7.5Hz)，7.79(dd，J＝7.5，8.0Hz)和7.36(dd，J＝1.0，8.0Hz)的ABC自旋系统的三个质子被认为是在化合物4的环A上分别占据连接C-5、C-6和C-7的邻位。13C NMR和DEPT实验(表4)提供了经一个次甲基(δC121.5)、一个C-连接(δC141.4)甲基(δC17.2)，及与一杂原子相连的两个季碳(δC147.7和153.9)连接于化合物4的环B上的取代基的鉴定的其它证据。根据各自的化学位移和HMBC及HMQC实验的结果排列出这些碳在化合物4的环B上的位置。观察到的另外五个次甲基(δC69.7、74.2、76.3、77.3和102.9)和一个亚甲基(δC60.8)自旋表现出的化学位移值与吡喃葡萄糖基团相符。根据H-1′偶合(δH5.07，d，J＝7.5Hz)将吡喃葡萄糖排列为β-构型。根据HMBC实验确定化合物4的完整结构。化合物4是新发现的蒽醌苷，其被命名为kwanzoquione C。
kwanzoquione C(化合物4)黄色细小针状结晶；熔点233-234℃； 20D-46°(c0.031，EtOH)；UVλmax(EtOH)(logε)206(4.20)，227(4.23)，260(4.17)，429(3.78)nm；IR(KBr)νmax3422，1671，1624，1559，1473，1382，1373，1293，1263，1067cm-1；1HNMR(DMSO-d6)δH12.04(1H，brs，8-OH)，12.00(1H，s，1-OH)，7.79(1H，dd，J＝7.5，8.0Hz，H-6)，7.70(1H，dd，J＝1.0，7.5Hz，H-5)，7.61(1H，s，H-4)，7.36(1H，dd，J＝1.0，8.0Hz)，5.07(1H，d，J＝7.5Hz，H-1′)，3.60(1H，ddd，J＝2.0，5.5，12.0Hz，H-6a′)，342(1H，ddd，J＝6.0，11.5，11.5Hz，H-6b′)，3.31(1H，m，H-2′)，2.35(1H，m，H-3′)，3.16(1H，m，H-4′)，3.13(1H，m，H-5′)，2.42(3H，s，H-11)；13C NMR数据，见表4；HRFABMS m/z 433.1139[M+H]+(对C21H21O10的计算值，433.1135)。
实施例5如同实施例3确定化合物5的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物5。根据显示m/z 519[M+H]+的FABMS分析，确定化合物5的分子式为C24H22O13。化合物5的谱数据与化合物4得到的那些数据极为相似。在1H和13C NMR谱(表4)中观察到最大区别，以及δH41.1、166.4和167.4处的三个新的碳信号和在δH3.23对两个氢的积分的新的质子共振。这些化学位移是丙二酰基的期望位移的特征。根据观察到的C-6′的低磁场位移至δC63.7相当于对化合物4观察到位移(Δ＝+2.9ppm)确定化合物5中的丙二酰基键合为丙二酰基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。这些观察被HMBC分析所证实(图3)，它表现出从H-6a′(δH4.12)和H-6b′(δH4.27)到C-1″(δC41.1)和H-2″(δH3.23)到C-6′(δC63.7)的弱4JCH相关性。这证实了化合物5是新的蒽醌丙二酰-苷，其被命名为kwanzoquinone D。
kwanzoquinone D(化合物5)金黄色针状结晶；熔点174-175℃； 20D-313°(c 0.008，EtOH)；UV λmax(EtOH)(logε)205(4.28)，227(4.35，260(4.31)，290sh(3.91)，430(3.96)nm；IR(KBr)νmax3430，1434，1717，1699，1670，1653，1559，1457，1268，1066cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δH12.57(1H，brs，1-OH)，11.96(1H，s，8-OH)，7.77(1H，dd，J＝7.5，8.0Hz，H-6)，7.67(1H，dd，J＝1.0，7.5Hz，H-5)，7.57(1H，s，H-4)，7.33(1H，dd，J＝1.0，8.0Hz)，5.06(1H，d，J＝7.5Hz，H-1′)，4.27(1H，dd，J＝2.5，11.9Hz，H-6a′)，4.12(1H，dd，J＝6.5，11.9Hz，H-6b′)，3.38(1H，m，H-5′)，3.33(1H，m，H-2′)，3.28(1H，m，H-3′)，3.23(2H，s，H-2″)，3.21(1H，m，H4′)，2.37(3H，s，H-11)；13C NMR数据，见表4；HRFABMS m/z 519.1139[M+H]+(对C24H23O13的计算值，59.1151)。
实施例6如同实施例3确定化合物6的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物6。化合物6的EIMS分析给出了m/z 286[M]+的分子离子，它表明分子式为C15H10O6。UV(λ＝426nm)和IR(3469(宽，O-H伸展)、1667(C＝O伸展，非螯合)和1620cm-1(C＝O伸展，螯合)处的吸收谱带)谱显示化合物6的1，8-二羟基蒽醌chromaphore。1H NMR谱提供了δ12.06、11.92、10.47和5.40处的四种可交换质子的证据，它表示三个芳基和一个脂肪羟基官能团。观察到δH7.70(dd，J＝0.5，7.8Hz)、7.78(重叠dd，J＝7.8，7.8Hz)和7.33(dd，J＝0.5，7.8Hz)的质子分别占据着连接于化合物6的环A的C-6、C-6和C-7的邻位的ABC自旋系统。
化合物6的1H和13C NMR和DEPT实验(表4)给出了环A具有带邻羟基官能团(δ149.1s和148.4s)的季碳原子、连着季碳原子(δC136.7)的羟基亚甲基(δH4.59s，2H和δC57.8t)和次甲基(δC119.0)的证据。用HMBC实验排出如对化合物6所示(图4)的这些质子和碳自旋的完整排布。已命名为kwanzoquinone E的化合物6是新发现的。
kwanzoquinone E(化合物6)黄色细针状晶体；熔点196-197℃；UVλmax(EtOH)(logε)209(4.32)，235(4.10)，258(4.27)，354(3.72)，426(3.76)nm；IR(KBr)νmax3469，1652，1619，1559，1473，1458，1382，1321，1273，1092cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δH12.06(1H，brs，1-OH)，11.92(1H，s，8-OH)，10.47(1H，brs，2-OH)，7.87(1H，d，J＝0.5Hz，H-4)，7.78(1H，dd，J＝7.8，7.8Hz，H-6)，7.70(1H，dd，J＝0.5，7.8Hz，H-5)，7.33(H，dd，J＝0.5，7.8Hz，H-7，5.40(1H，brs，11-OH)，4.59(2H，s，H-11)；13C NMR数据，见表4；EIMS m/z 286[M]+(62)，268(89)，240(56)，212(100)，184(50)，155(14)，128(19)，120(19)；HREIMS m/z286.0479[M+H]+(对C15H10O5的计算值，286.0477)。
实施例7如同实施例3确定化合物7的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物7。化合物7显示类似于化合物6的光谱数据，以及显示化学位移值与吡喃葡萄糖基团的那些数据相符的五个次甲基(δC69.7、74.1、76.2、77.2和102.7)和一个亚甲基(δC60.7)自旋。吡喃葡萄糖基团的加入经HRFABMS证实，它给出表示化合物7的分子式为C21H20O11的m/z 449.1082[M+H]+(对C21H20O11的计算值为449.1084)。由于碳信号低磁场位移到δC58.1(Δ＝+0.4)和所连接质子的裂解方式的变化，确定所述吡喃葡萄糖基团是邻位连接于11位。在手性溶剂(含两滴D2O的0.75mL DMSO-d6)中，虽然化合物6的对映异位的(enantiotopic)C-11质子(δH4.59，2H)表现出单峰，但化合物7的非对映异位的C-11质子(δH4.65，1H和4.73，1H)分别为双峰(J＝16.0Hz)。经HMBC实验证实化合物7中的所有质子和碳(表4)自旋的排布。化合物7是新发现的共轭蒽醌苷，其被命名为Kwanzoquinone F。
Kwanzoquinone F(化合物7)黄色粉末；熔点204-206℃；[α]20D-38°(c0.01，EtOH)；UVλmax(EtOH)(logε)228(4.04)，259(4.03)，291(3.57)，432(3.68)nm；IR(KBr)νmax3450，1698，1684，1652，1635，1559，1540，1457，1262，1027cm-1；1H NMR(0.75mL DMSO-d6/2 drops D2O)δH7.88(1H，s，H-4)，7.79(1H，dd，J＝7.5，8.0Hz，H-6)，7.71(1H，dd，J＝1.0，7.5Hz，H-5)，7.36(1H，dd，J＝1.0，8.0Hz，H-7)，5.07(1H，d，J＝7.5，H-1′)，4.37(1H，d，J＝16.0Hz，H-11a)，4.65(1H，d，J＝16.0Hz，H-11b)，3.60(1H，d，J＝3.0，12.5Hz，H-6a′)，3.40(1H，dd，J＝5.5，12.0Hz，H6-b′)，3.26(1H，m，H-2′)，3.25(1H，m，H-3′)，3.15(1H，m，H-4′)，3.12(1H，m，H-5′)；13C NMR数据，见表4；HRFABMS m/z 433.1132[M+H]+(对C21H21O10的计算值，433.1135)。
实施例8反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物8。所得化合物8呈非晶形黄色粉末，发现其光谱数据与对已知蒽醌大黄酸所报道的那些相符(Danielsen和Aksnes，Magn.Reson.Chem.30359-360(1992))。
实施例9如同实施例3确定化合物9的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物9。化合物9显示的光谱数据类似于化合物8，主要差别是在1H NMR谱中缺少芳族双峰(约δH8.15，1H，J＝1.5Hz)和δH7.59(s，1H)的质子信号中分裂也同时缺少，这表明化合物9的环B的2位被取代。这些观察与芳香甲基(δH2.67s，3H和δC19.5q)的出现和化合物8中的C-2从δC124.2向低磁场位移至化合物9中的131.2(Δ＝+7.0ppm)相符(表4)。根据C-11甲基质子对C-2(δC131.2)和C-3(δC140.4)的远程偶合，HMBC实验能确定该甲基是C-2取代基。化合物9是新发现的蒽醌，其被命名为Kwanzoquinone G。
Kwanzoquinone G(化合物9)黄色粉末；熔点235-236℃；UVλmax(EtOH)(logε)219(4.25)，283(4.19)，413(3.63)nm；IR(KBr)νmax3420，1717，1700，1670，1634，1577，1365，1320，1261，1223cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δH12.82(1H，s，8-OH)，12.81(2H，brs，1-OH and 12-OH)，7.67(1H，dd，J＝8.1，8.1Hz，H-6)，7.57(1H，dd，J＝1.2，8.1Hz，H-5)，7.56(1H，s，H-4)，7.28(1H，dd，J＝1.5，8.1Hz，H-7)，2.67(3H，s，H-11)；13C NMR数据，见表4；HRFABMS m/z 299.0547[M+H]+(对C16H11O6的计算值，299.0556)。
实施例10如同实施例3确定化合物10的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物3-12。化合物10的FABMS提供分子离子的m/z 525[M+H]+，13C NMR谱显示在110-155ppm间有10个SP2碳信号，以及12个另外的SP3碳信号，这是芸香糖基团的特征。由于表示芳族甲基(δC19.0)和乙酰基(δC31.9和204.4)的三个另外的碳信号的出现，确定化合物10是取代的萘二苷。HMQC和HMBC实验确定化合物10的苷元部分为2-乙酰基-3-甲基-1，8-二羟基萘(dianellidin)。根据从H-1′(δH5.04，d，J＝7.5Hz)到C-8(δC154.2s)的相关性进一步仔细检查HMBC数据，得到8-O-连接芸香糖苷基团的排列。根据这些数据，化合物10被鉴定为先前从山菅spp.(Dianella spp.)(百合科(Liliace))分离的dianellin(Batterham等，Aust.J.Chem.14637-642(1961))。这是显示化合物10存在于萱草属的首次报道，并且首次详细报道了其1H和13CNMR谱数据。
Dianellin(化合物10)白色针状晶体；熔点156-157℃；[α]20D-137°(c0.01，EtOH)；UVλmax(EtOH)(logε)225(4.75)，301(3.80)，334(3.78)nm；IR(KBr)νmax3416，2923，1651，1633，1579，1467，1443，1356，1270，1067cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δH9.53(1H，brs，1-OH)，7.47(1H，dd，J＝1.0，8.0Hz，H-5，7.40(1H，dd，J＝8.0，8.0Hz，H-6)，7.30(1H，dd，J＝1.0，8.0Hz，H-7)，7.21(1H，s，H-4，5.04(1H，d，J＝7.5Hz，H-1′)，4.62(1H，d，J＝1.5Hz，H-1″)，3.93(1H，dd，J＝1.5，11.0Hz，H-6a′)，3.68(1H，m，H-2″)，3.59(1H，m，H-5′)，3.50(2H，m，H-4′)，3.18(1H，m，H-4′)，2.52(3H，s，H-12)，2.25(3H，s，H-13)，1.12(3H，d，J＝6Hz，H-6′)；13C NMR(DMSO-d6)δC204.4(s，C-11)，154.2(s，C-8)，150.2(s，C-1)，135.7(s，C-10)，132.8(s，C-3)，127.3(d，C-6)，125.2(s，C-2)，122.3(d，C-5)，119.4(d，C-4)，113.2(s，C-9)，110.7(d，C-7)，102.6(d，C-1′)，100.7(d，C-1″)，76.2(d，C-3′)，76.0(d，C-5′)，73.3(d，C-2′)，71.9(d，C-4″)，70.7(d，C-3″)，70.4(d，C-2″)，70.1(d，C-4′)，68.4(d，C-5″)，66.6(t，C-6′)，31.9(q，C-12)，19.0(q，C-13)，17.7(q，C-6″)；HRFABMS m/z 525.1970[M+H]+(对C25H33O12的计算值，525.1972)。
实施例11如同实施例3确定化合物11的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物11。化合物11的1H和13C NMR和DEPT数据在缺失一个芳香次甲基自旋方面与化合物10观察到的那些数据极其相似，所述次甲基被连接杂原子的季碳(δC148.3)取代。FABMS分析得到m/z541[M+H]+的分子离子，它说明了氧原子的加入，得到分子式C25H32O13。化合物11的苷元部分的1H和13C NMR数据和以往对萘苷stelladerol报道的那些数据比较，表明两者具有同样的苷元部分。然而，这些化合物的苷部分不同。化合物11的HMBC相关数据(图5)表明它具有8-O-β-D-鼠李吡喃糖基(rhamnopyranosyl)-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷部分。用于推论这些连结的重要的HMBC相关性包括对H-1′(δH4.87，d，J＝7.5Hz)到C-8(δC146.7s)、H-6a′(δH3.92m)和H-6b′(δH3.52)到C-1″(δC100.7d)，和从H-1″(δH4.61m)到C-6′(δC66.6t)观察到的那些。根据这些数据，化合物11，5-羟基dianellin(1-(1，5，8-三羟基-3-甲基-萘-2-基)-乙酮-8-O-β-D-鼠李吡喃糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，被确认为新发现的萘苷。
5-羟基dianellin(化合物11)黄色非晶体固体；熔点152-153℃； 20D-212°(c0.01，EtOH)；UVλmax(EtOH)(logε)224(4.92)，318(4.13)，346(4.15)nm；IR(KBr)νmax3420，1698，1684，1653，1635，1559，1457，1364，1257，1059cm-1；1HNMR(DMSO-d6)δH9.71(2H，brs，1-OH and 5-OH)，7.43(1H，s，H-4)，7.16.(1H，d，J＝8.0，H-7)，6.76(1H，d，J＝8.0，H-6)，4.87(1H，d，J＝7.5，H-1′)，4.61(1H，m，H-1″)，3.92(1H，m，H-6a′)，3.69(1H，brs，H-2″)，3.52(1H，m，H-6b′)，3.51(1H，m，H-5′)，3.50(1H，m，H-3″)，3.48(1H，H-5″)，3.34(2H，m，H-2′and H-3″)，3.21(1H，m，H-4″，3.18(1H，m，H-4′)，2.51(3H，s，H-12)，2.26(3H，s，H-13)，1.14(3H，d，J＝6Hz，H-6″)；13C NMR(DMSO-d6)δC204.7(s，C-11)，150.2(s，C-1)，148.3(s，C-5)，146.7(s，C-8)，131.3(s，C-3)，126.4(s，C-10)，125.6(s，C-2)，114.2(s，C-9)，113.8(d，C-4)，111.9(d，C-7)，108.6(d，C-6)，103.5(d，C-1′)，100.7(d，C-1″)，76.3(d，C-3′)，75.9(d，C-5′)，73.3(d，C-2′)，72.0(d，C-4″)，70.8(d，C-3″)，70.5(d，C-2″)，70.0(d，C-4″)，68.4(d，C-5″)，66.6(t，C-6′)，31.9(q，C-12)，19.3(q，C-13，17.7(q，C-6″)；HRFABMSm/z 541.1910[M+H]+(对C25H33O13的计算值，541.1921)。
实施例12如同实施例3确定化合物12的物理特征。其特征如下。
反复用ODS和SEPHADEX LH-20胶柱层析MeOH萃取物，得到化合物12。得到透明玻璃状固体化合物12，经鉴定为5，7，3，4-四羟基-6-甲基黄酮(6-甲基藤黄菌素)，它先前发现于鼠尾草(Salvianemorosa L)(Lammiace)(Milovanovic等，J.Serb.Chem.Soc.61423-429(1996))。根据对1D和2D NMR的全面研究和将其UV和IR谱数据与现有技术报道的那些数据作比较，确定其结构。这是显示化合物12存在于萱草属中的首次报道，也是对其1H和13C NMR谱数据的首次详细报道。
6-甲基藤黄菌素(化合物12)黄色玻璃状固体；UV和IR数据与Milovanovic等(出处同上)的数值相同；1H NMR(DMSO-d6)δH10.92(1H，s，5-OH)，9.71(1H，s，，7-OH)，9.55(1H，s，4′-OH)，9.23(1H，s，3′-OH)，7.40(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，7.16(1H，dd，J＝2.0，8.5Hz，H-6′)，6.80(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，6.47(1H，s，H-3)，6.32(1H，s，H-8)，1.92(3H，s，-CH3)；13C NMR(DMSO-d6)δC180.1(s，C-4)，165.0(s，C-5)，164.2(s，C-9)，154.5(s，C-7)，147.4(s，C-4′)，145.6(s，C-3′)，145.3(s，C-2)，123.9(d，C-6′)，123.5(s，C-1′)，117.5(d，C-2′)，115.8(d，C-5′)，109.8(d，C-3)，105.8(s，C-6)，102.8(s，C-10)，90.2(d，C-8)，7.5(q，-CH3)；HRFABMS m/z 301.0709[M+H]+(对C16H13O6的计算值，301.0712)。
实施例13对化合物1-11包括化合物1a和2a对抗人体致病吸虫曼氏裂体吸虫的多个生命阶段(尾蚴、血吸虫幼虫和成虫)的抑制活性进行了测定。对蒽醌对血吸虫尾蚴的毒性进行了测定。结果表明化合物3和6具有抑制性。所述测定如下进行。
从被感染的扁卷螺(Biomphalaria glabrate)小螺中通过Salter等在J.Biol.Chem.27538667-38673(2000)中所述的光诱法(light induction)收集曼氏裂体吸虫(波多黎各虫株(Puerto Rican strain))尾蚴将各化合物1mg分别溶解于100μL DMSO中。向该溶液中加入19.9mL蒸馏水，得到1∶200该溶液的稀释液，以制备含50μg/mL所述化合物的贮备溶液。
为测试各化合物的抑制作用，将100μL含50μg/mL所述化合物的贮备溶液加入96孔测定板的孔中的100μL刚脱落的曼氏裂体吸虫尾蚴(约50条)中，得到最终体积200μL，其中所述化合物的浓度为25μg/mL。始终监测尾蚴的游动和移动。
浓度为25μg/mL时，化合物3在加入含化合物3的溶液后的10-15秒内固化沉到孔底的尾蚴。在接触化合物2、5、10、15和30分钟后，从孔内取出溶液换成200μL新鲜水。16小时后，接触化合物3各时间段的50％尾蚴仍存活并相当活跃。活着的尾蚴的肠道是黑色的(在对照孔中没发现此现象)。24小时后，死亡率保持在50％。因此，尾蚴接触化合物3的时间的长短对尾蚴的存活无显著作用。甚至当化合物3稀释到3.25μg/mL时，尾蚴在接触45分钟后固化。
浓度为25μg/mL时，化合物6在加入含化合物6的溶液后的12-14秒内固化沉到孔底的尾蚴。在接触化合物6达2、5、10、15和30分钟后，从孔内除去溶液，换成200μL新鲜水。16小时后，接触化合物6处理的尾蚴在各接触时间后，25-30％尾蚴仍存活但并不活跃。活着的尾蚴的肠道也是黑色的。24小时后，用化合物6处理过的所有尾蚴在各接触时间后全部死亡(死亡率100％)。因此，尾蚴接触化合物6的时间的长度对尾蚴的存活无显著作用。
其它化合物，包括化合物3和6的苷(分别为化合物4和7)都没有表现出对曼氏裂体吸虫的任何抑制活性。
结果表明，化合物3比化合物6在固化尾蚴上更有效，但在长时间的观察下显示更小的毒性和致命性。根据此结果，治疗感染人体致病性吸虫的患者的方法应包括提供包含化合物3(以快速固化尾蚴)和化合物6(以杀死所有尾蚴)的组合物。在0.25ppm时，化合物3和6如图2中所示在整个过程中产生基本100％的尾蚴死亡率。
由于化合物4和5可在肠道中水解成化合物3，化合物7可在肠道中水解成化合物6。治疗感染人体致病性吸虫的患者的方法应包括提供包含化合物7和至少一种选自化合物4和化合物5的化合物的组合物。其它方案将包括包含化合物3和化合物6和化合物7和至少一种选自化合物4和化合物5的化合物的组合物。
实施例14用化合物1-11包括1a和2a测试抗人体致病吸虫曼氏裂体吸虫的多个生命阶段(尾蚴、血吸虫幼虫和成虫)的活性。
如下进行尾蚴试验。通过光诱法得到来自受感染扁卷螺小螺的曼氏裂体吸虫(波多黎各虫株)尾蚴。关于维持曼氏裂体吸虫和扁卷螺培养所用的方法的的细节描述于Saler等，J.Biol.Chem.27538667-38673(2000)中。收集100μL蒸馏水中的共50-100条尾蚴，置于COSTAR96-孔乙烯基测定板(COSTAR Corp.，Acton，Massachusetts)中。在100μL DMASO和19.9mL蒸馏水中溶解1mg测试化合物制备化合物1-11包括1a的2a的贮备溶液。按需要进一步稀释该贮备溶液，按100μL等份加入各孔中。在解剖显微镜下观察尾蚴移动(即，尾巴运动和游动行为)。约十小时后，移出测试化合物，用新鲜水替换，测定尾蚴的生存力。
血吸虫幼虫测试如下进行。切断曼氏裂体吸虫的尾部并在含青霉素和链霉素和胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在平底COSTAR 96孔CELL CULTURE CLUSTER组织培养板中培养该生物，从曼氏裂体吸虫的尾蚴孵育血吸虫幼虫，将如上制得的测试化合物加入所述培养基中，观察血吸虫幼虫在运动、进食和生存力方面的变化。
成虫测试如下进行。如Davies等在Science 2941358-1361(2001)中所述从叙利亚金色仓鼠收集成年蠕虫。于37℃在24-孔FALCON板中，用加有2g/L葡萄糖、0.3g/L L-谷氨酸、2.0g/L NaHCO3、15％热灭活的胎牛血清、1X青霉素/链霉素和15μL已用RPMI-1640培养液洗过的仓鼠红细胞的1mL RPMI-1640培养基中培养二十条雄和雌性的成年蠕虫。将5μL等份量的测试化合物的DMSO溶液(制备同上)或DMSO对照液加入各孔中。监测成年蠕虫的运动、进食和生存力24小时。之后，除去所述培养基，用新鲜培养基替换已加入测试化合物或DMSO培养基，再观察成年蠕虫24小时。最后，再除去培养基，用没有测试化合物或DMSO的新鲜培养基替换，再对回收的成年蠕虫进行另外24小时的监测。
在25μg/mL浓度时，化合物3(2-羟基大黄酚)和6(kwanzoquinoneE)表现出极大的活性，分别在15秒和14分钟内完全固化所有的尾蚴。这些化合物的剂量效应示于表5及图6和7中。
表5浓度 固化尾蚴百分率(μg/mL)化合物3误差化合物6 误差0 0 0 0 01.56 401040 103.125 904 40 106.25 962 40 1012.5 100 0 92 225100 0 94 2对每一化合物测试总共10次，每次测试10分钟。
即使稀释到3.1μg/mL的浓度，化合物3的效果仍没有消失。接触测试化合物30分钟后，除去含测试化合物的溶液，用新鲜介质替换。用化合物3处理24小时后的尾蚴死亡率为50％，而接触化合物6的尾蚴则全部死亡。从萱草根分离出的其它所有化合物包括化合物3和化合物6，化合物4和7的苷分别在25μg/mL浓度时，均未显示出任何活性。成年蠕虫也在16小时内被50μg/mL浓度的化合物3和5固化。除去这些化合物后，接触化合物3和6成年蠕虫分别有35％和55％被杀死。相对于对尾蚴和成虫的作用，血吸虫幼虫中间阶段对35μg/mL的所有化合物是顽固的。
虽然参照所列举的实施方案在本文中叙述本发明，但应理解本发明不受其所限。本领域的普通技术人员和理解本文意思的人应该了解本发明范围内的其它修饰和实施方案。因此，本发明只受本文所附的权利要求书的限制。
权利要求
1.一种抑制寄生蠕虫的方法，它包括使所述蠕虫接触抑制量的蒽醌。
2.一种抑制寄生蠕虫的方法，它包括使所述蠕虫接触抗蠕虫量的至少一种下式的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，及所述卤素选自I、F、Br和Cl。
3.权利要求2的方法，其中所述蒽醌具有下式 其中R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
4.权利要求1或2的方法，其中所述蒽醌是1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌。
5.权利要求1或2的方法，其中所述蒽醌是1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌。
6.权利要求1或2的方法，其中所述抑制是体外抑制。
7.权利要求1或2的方法，其中所述抑制是体内抑制。
8.一种抑制血吸虫属虫株(Schistosoma sp.)的方法，它包括使所述血吸虫属虫株接触抑制量的至少一种下式的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，所述卤素选自I、F、Br和Cl。
9.权利要求8的方法，其中所述蒽醌具有下式 其中R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
10.权利要求8的方法，其中所述蒽醌是1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌。
11.权利要求8的方法，其中所述蒽醌是1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌。
12.权利要求8的方法，其中所述蒽醌以每毫升或克1-1,000微克的剂量抑制。
13.权利要求8的方法，其中所述抑制是体外抑制。
14.权利要求8的方法，其中所述抑制是体内抑制。
15.一种在感染致病吸虫的温血动物或人中抑制致病吸虫的方法，它包括(a)提供一种组合物，它含有在药学上可接受的载体中的抑制量的至少一种选自1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)和1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)的蒽醌；和(b)将所述组合物给予所述温血动物或人以抑制致病吸虫。
16.权利要求15的方法，其中所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下具有抑制作用。
17.权利要求15的方法，其中所述蒽醌经口服、皮下、腹腔内、静脉内、局部、鼻内或直肠给予所述温血动物或人。
18.一种在感染致病吸虫的温血动物或人中抑制致病吸虫的方法，它包括(a)提供一种组合物，它含有在药学上可接受的载体中的抑制量的1，2，8-三羟基-3-甲基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物7)和至少一种选自1，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物4)和1，8-二羟基-2-O-丙二酰基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物5)的蒽醌；和(b)给予所述温血动物或人体所述组合物以抑制致病吸虫。
19.权利要求18的方法，其中所述组合物还包括抑制量的至少一种选自1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)和1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)的蒽醌。
20.权利要求18的方法，其中所述蒽醌在每毫升或每克1-1,000微克的剂量下具有抑制作用。
21.权利要求18的方法，其中所述蒽醌经口服、皮下、腹腔内、静脉内、局部、鼻内或直肠给予所述温血动物或人。
22.一种抗蠕虫组合物，它包括(a)至少一种下式的蒽醌 其中R1、R2、R3和R4各自选自氢、羟基、卤素、烷基、取代的烷基、烯烃、取代的烯烃、炔烃、芳基、取代的芳基、环基、取代环基、酸基、碳水化合物及其结合，R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合，及所述卤素选自I、F、Br和Cl；和(b)一种药学上可接受的载体，其中所述组合物含有每毫升或每克载体约1-1,000微克的所述蒽醌。
23.权利要求22的抗蠕虫组合物，其中所述蒽醌具有下式 其中R为含1-12个碳原子的基团，选自甲基、烷基、取代的烷基、醛、羟基、羟基甲基、酸基、碳水化合物及其结合。
24.权利要求22的抗蠕虫组合物，其中所述蒽醌选自1-羟基-2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌(化合物1)、2-乙酰基-3，6-甲基蒽醌一乙酸酯(化合物1a)、1-羟基-2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌(化合物2)、2-乙酰基-3，7-甲基蒽醌一乙酸酯(化合物2a)、1，2，8-三羟基-3-甲基蒽醌(化合物3)、1，8-二羟基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷蒽醌(化合物4)、1，2，8-三羟基-3-羟基甲基蒽醌(化合物6)和1，8-二羟基-3-羧基蒽醌(化合物8)。
25.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
26.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
27.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
28.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
29.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
30.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
31.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
32.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
33.一种分离和纯化的蒽醌，它具有下式
全文摘要
本文描述了抗蠕虫的蒽醌，具体用于体外或体内抑制血吸虫属的组合物。优选的蒽醌具有右式，其中R
文档编号A61P33/00GK1658757SQ03813697
公开日2005年8月24日 申请日期2003年4月11日 优先权日2002年4月15日
发明者R·H·西切维茨, M·G·奈尔, J·H·麦克罗 申请人:密执安州大学, 加州大学评议会, 美国退伍军人部