专利名称：：含有针对约四种引起痤疮的抗原的混合IgY的鸡蛋及其蛋黄粉和混合IgY的生产方法
技术领域：
：该发明是关于针对痤疮发病菌的复合型特殊免疫蛋白生产方法及复合型特殊免疫蛋白的技术。
背景技术：
：在该发明中，医学上称之为寻常性痤疮的粉刺(acnevulgaris)是步入青春期的象征，每10名进入青春期的男女中，7～8人有过长青春痘的经验。随着女性进入社会的比例上升，随之而来的精神压力日益加剧，故在20多岁或30多岁时第一次长痤疮的女性也在逐渐增加。观察诱发痤疮的原因如下首先、是因为皮脂分泌过分旺盛。在内分泌腺的调节下，从皮肤皮脂腺分泌出的皮脂分泌过多直接导致皮脂腺继续生成，并从皮脂腺排管通过漏斗部，在皮肤表面分泌出皮脂，导致皮脂分泌过多。此外，睾丸激素也会促进皮脂分泌，并激活脂质的生物合成分泌，所以在第二次成长期——青少年期，皮脂腺非常发达。一般来讲，成年男性从睾丸分泌出的睾丸激素促使皮脂分泌保持稳定，而女性在排卵后的一定期间内，抗体荷尔蒙的增加会刺激皮脂腺，导致皮脂分泌增加，并在月经后会出现痤疮恶化的现象。其次、是因为毛孔闭塞。在上述第一个原因中，皮脂的过多分泌会导致漏斗部闭塞，致使毛囊孔和皮脂腺开口部闭塞或变窄，以至无法正常排泄皮脂，使皮脂留在毛漏斗部，变成黑头粉刺，增加痤疮杆菌，而杆菌的生成物又会刺激漏斗部的上皮细胞，角质化现象得到亢进，致使皮脂堵塞皮脂腺和毛囊，最终引发出疹症状。第三、随着皮脂成分变成含有黑色素的黑色凝块，厌氧性细菌——痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)也会逐渐增加。上述痤疮丙酸杆菌属于厌氧性细菌，它主要分布在毛孔周围或漏斗部，能将皮脂增殖为营养成分，并分泌出脂肪酶，分离出皮脂的主要成分——甘油三酸酯(triglyceride)，生成游离脂肪酸。上述游离脂肪酸会对皮肤上皮起作用，生成各种酵素，破坏毛囊壁，在毛囊周围的结合组织诱发炎症。皮脂腺的肥大增殖、毛囊孔的角质化亢进以及细菌的影响起到复合性作用，恶化痤疮症状，有时这些原因还会单独诱发痤疮症状。此外，容易长痤疮的体质的遗传性因素、饮食影响以及疲劳和精神压力也是诱发痤疮症状的主要原因之一。在诱发痤疮的主要原因中，痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)是其原因菌，这是滋生于皮肤里的常在菌，也是引发原发性皮肤疾病、痤疮引起的皮肤疾病和迅速恶化症状的原因菌，此外还有粘液诱发病症的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。(Francismartineauetal.，1996、ChristianC.etal.、1990)在引发皮肤及软组织感染、肺炎、菌血症等症状的G(+)球菌中，最常见的病原菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。(GordonL.Archer.、1996)此外，还有繁殖在不洁皮肤中的大肠菌。目前，治疗痤疮的方法有杀灭痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的抗生剂或遏制皮脂过多分泌的方法。除了抗生剂以外，目前正在开发约有40种痤疮治疗剂的后选物质。其中，主要有类维生素A(retinoid)和雄激素拮抗剂等16种痤疮治疗剂得到集中研究和开发。睾丸激素通过5-α-还原酶(5-α-reductase)转换成有两个氢原子的睾丸激素，而它成为在皮脂腺的细胞内生成皮脂的主要物质，促进皮脂生成，目前已有人发表了关于5-α-还原酶抑制剂(5-α-reductaseinhibitor)的研究报告。(CationsInhibitSpecificallyTypel5α-reductaseFoundinHumanSkin、J.Invest.Dermatol、104、775-778、1995)就5-α-还原酶抑制剂(5-α-reductaseinhibitor)系统，目前正由摩克制药公司(Merck&Co)开发研究两种后选物质，而在抗生剂方面，杜鹃花酸(Skinorenazelaicacid)和局部用喹诺酮(Acuatim、那氟沙星nadifloxacin)分别由德国先灵药厂(ScheringAG)和日本大冢公司(Otsuka)开发研究。在相关技术研究方面，作为天然物质，在鹿脚部位发现的(E)-3-十三碳烯醇-2-one((E)-3-tridecen-2-one)，能有效遏制以皮肤油作为培养基增殖的细菌，这一技术已得到有关部门验证并已注册专利。(PharmaprojectsMagazine、July1997)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液生成能力对细菌的病原性起到重要作用。粘液性物质将覆盖菌体，并通过外部多糖体形成生体膜。通过粘液性物质形成的粘液层能从抗生剂保护菌体，并阻止宿主的免疫反应——蚀菌作用。据有关资料显示，它还能遏制血球凝集素，并损坏宿主的免疫系统。对痤疮诱发菌——金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的感染，曾使用过对β-内酰胺酶(beta-lactamase)较稳定的青霉素(penicillin)，但在20世纪90年代，发现有35～66％的金黄色葡萄球菌是甲氧苯青霉素-抵抗性金黄色葡萄球菌(methilline-resistantStaphylococcusaureusMRSA)，从此普遍使用了糖肽(glycopeptide)——万古霉素(vancomycin)。(GordonL.Archer.、1996、RichardS.schwalbeetal.、1987)1996年以后，在日本、美国和法国发现了万古霉素(vancomycin)中呈现出中性耐性的万古霉素敏感性降低的黄色葡萄球菌(vancomycinintermediateresistantStaphylococcusaureus、VISA)，故在这一领域引起了更大反响。万古霉素敏感性降低的黄色葡萄球菌(VISA)在多种抗生剂中呈现出了耐性，这表明它能替代目前正在使用的抗生剂，同时还有望成为万古霉素敏感性降低的黄色葡萄球菌(VISA)感染患者的新的福音。(RichardS.schwalbeetal.、1987、Keiichihiramatsu.、1998)尽管目前已开发出了上述药剂等痤疮治疗剂，但痤疮症状仍不断出现和恶化，其原因很多，且根据不同人的特点，也有很多差别，但因毛孔在人体中起到免疫作用，故认为痤疮与人体免疫功能有着最直接的关系。
发明内容根据该发明研发的含有四种混合菌的抗-复合型特殊免疫蛋白(IgY)鸡蛋生产方法旨在解决上述问题，用氢氧化铝将痤疮丙酸杆菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原和大肠菌抗原乳化成混合菌乳液，并用该乳液给小鸡进行一次免疫接种，然后再用乳化助剂(ISA25)乳化上述四种抗原，制成混合菌乳液，并以两个星期为周期，给小鸡进行第二次免疫接种，使鸡生下含有特殊免疫蛋白的鸡蛋。此外，该发明还旨在在含有蔗糖(Sucrose)0.5％和乙二胺-DI-O-间苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)0.5％的胰酶大豆肉汤(TrypticsoybrothTSB)中制作痤疮原因菌里的表皮葡萄球菌，增加病原性的主要原因——表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液量，提供特殊免疫蛋白。图1是单独或复合接种痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌时的每种特殊免疫蛋白的效价变化所示图。图2是单独或复合接种大肠菌时的抗-大肠菌特殊免疫蛋白的效价变化所示图。图3是单独或复合接种痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌时的每种特殊免疫蛋白的平均效价所示图。图4是单独或复合接种大肠菌时的抗-大肠菌特殊免疫蛋白的平均效价所示图。具体实施方法根据该发明研发的含有四种混合菌的抗-复合型特殊免疫蛋白(IgY)鸡蛋生产方法具有如下特点为了实现上述技术课题，该发明对痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacne)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠菌(E.coli)进行抗原化处理，并同时给小鸡接种，以使每个鸡蛋均含有能够预防痤疮的复合型特殊免疫蛋白。该发明中的胰酶大豆肉汤(TrypticsoybrothTSB)含有0.5％能增加表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)粘液量的蔗糖(Sucrose)和0.5％乙二胺-DI-O-间苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)。在该发明中，从根据上述方法生下的含有复合型特殊免疫蛋白的鸡蛋中分离出蛋黄，并制成含有复合型特殊免疫蛋白的蛋黄粉末。在该发明中，生产出针对痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠菌(E.coli)的特殊免疫蛋白的阶段如下利用氢氧化铝乳化而制的痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠菌(E.coli)，制成混合菌乳化液，并用该混合菌乳液给小鸡(约为12周龄)接种一次，然后用乳化助剂(ISA25)乳化上述四种同一抗原，制成混合菌乳液，并用该混合菌乳化液给小鸡第二次接种，如此共给小鸡接种三次，使其生下含有复合型特殊免疫蛋白(IgY)的鸡蛋。进一步说明抗原的混合比例和乳化液的比例如下给小鸡接种的菌体数比例为痤疮丙酸杆菌抗原∶粘液量增加的表皮葡萄球菌抗原∶金黄色葡萄球菌抗原∶大肠菌抗原∶乳化助剂＝3∶1∶1∶1∶4。为此，应将1.0×109/ml痤疮丙酸杆菌杀菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌杀菌液抗0.05ml、1.0×109/ml金黄色葡萄球菌杀菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大肠菌杀菌液抗原0.05ml与氢氧化铝0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并在小鸡的一条腿上接种一次。将上述四种抗原以同样的比例混合，并用0.2ml的乳化助剂(ISA25)乳化，制成混合菌乳液，然后以两个星期为周期，在小鸡的一条腿上进行第二次接种0.5ml的混合菌乳液，如此共接种三次。通过给小鸡接种上述四种混合抗原，使已被免疫的产蛋鸡生下同时拥有抗-痤疮丙酸杆菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黄色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大肠菌特殊免疫蛋白等复合型特殊免疫蛋白(IgY)的鸡蛋，并使鸡蛋蛋黄含有上述四种混合抗原。在该发明中，为了增加对抗表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白，在复合型特殊免疫蛋白的生产阶段，对粘液量增加的表皮葡萄球菌进行抗原化处理，共给小鸡接种三次。详细说明上述过程如下在添加了0.5％的蔗糖(Sucrose)和0.5％的乙二胺-DI-O-间苯二酚乙酸(ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)的胰酶大豆肉汤(TrypticSoyBrothTSB)中进行增菌处理，增加表皮葡萄球菌的粘液量。利用含有0.5％的蔗糖(Sucrose)和0.5％的乙二胺-di-O-间苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)的胰酶大豆肉汤(TrypticsoybrothTSB)，生成病原性的主要原因——粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，并增加影响病原性的原因——粘液的特殊免疫蛋白。该发明还在禽蛋加工厂，对通过上述方法生下的同时含有抗-痤疮丙酸杆菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黄色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大肠菌特殊免疫蛋白的鸡蛋进行分离蛋黄和喷雾干燥处理，制作蛋黄粉末。通过该发明实例及图表详细说明该发明结构如下(该发明的权利范围和请求范围并不局限于如下实例及图表。)实例1(1)制作痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)抗原痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)是从韩国典型培养物保藏中心(KCTC)购买并使用的，该菌的正规名称是Propionibacteriumacnes(KCTC3314)。上述抗原是革兰氏细菌(Gram)培养杆菌，其大小为0.3～1.3μm×1～10μm。该抗原的部分菌体膨大，菌端为尖而多形性，并排列成“V”形。(甲)革兰氏细菌(Gram)的染色性状利用棉棒将已增菌的菌体涂抹在载片上面，并在空气中晾干涂抹的菌体标本，然后又将干燥的标本在火花中通过2～三次予以固定。利用结晶紫试液(alkalinecrystalviolet)染色剂进行两分钟处理，并在Kopeloffiodine媒染剂反应两分钟，制成丙酮(acetone)和酒精(alcohol)的比例为3∶7的混合试剂。利用盐基性红色染料(safranin)进行20秒的对照染色处理，并通过检镜，确定是革兰氏细菌(Gram)培养的杆菌。(乙)固体培养基中的性状将其涂抹在GAM半固体培养基(GAMsemisolid)上，并在含有二氧化碳(CO2)10％的恒溫器的厌氧性条件下培养4～5天，使其增殖为圆形隆起并具有非透明光泽的菌落。经过一段时间后，菌落的颜色逐渐变成了橙红色(Salmonpink)。(丙)制作痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)抗原在5ml的放线菌培养基(Actinomycesbroth)中，对痤疮丙酸杆菌进行为时3个小时的第一次增菌处理。将第一次增菌液接种到大量放线菌培养基(Actinomycesbroth)中，并在含有10％的二氧化碳(CO2)，温度为37℃的恒溫器中进行增菌处理。在恒溫器中培养72个小时的菌液中添加甲醛(formaldehyde)，使菌液的浓度变成0.2％，并在室内温度下进行24个小时的不活化处理。在4,000rpm的条件下，对进行不活化处理的菌液进行20分钟的离心处理，以获得细菌，并用灭菌生理盐水(pH7.2)进行了三次稀释。将进行不活化处理的菌液涂抹在固体培养基上，确定其为不能增菌的菌体。用灭菌生理盐水对上述进行不活化处理的菌体进行三次稀释，并在-20℃的温度下冷藏，用作抗原。(2)制作表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)抗原表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是从韩国典型培养物保藏中心(KCTC)购买并使用的，该菌的正规名称是Staphylococcusepidermidis(KCTC1917)。该抗原是直径为0.8～1.0μm的球菌，在染色标本属于革兰氏细菌(Gram)培养球菌，一般排列成葡萄串形状，在液体培养基培养的染色标本呈双球菌、连锁状、四分染色体等不规则的葡萄串排列状。(甲)革兰氏细菌(Gram)的染色性状采用与痤疮丙酸杆菌相同的方法，这也是葡萄串形状的革兰氏细菌(Gram)培养球菌。培养初期，其革兰氏细菌(Gram)培养的性质非常强烈，但在经过一段时间后，逐渐呈革兰氏细菌(Gram)阴性。(乙)固体培养基中的性状在寒天培养基和半固体培养基培养24个小时后，菌落的圆形平滑，变成有光泽的半球状菌落，其直径为1～2mm。菌落的色素呈白色，在食盐培养基中显示出耐盐性。(丙)在表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)特殊培养基制作抗原在含有5ml的0.5％蔗糖(Sucrose)和0.5％乙二胺-DI-O-间苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-o-hydroxyphenolaceticacid)的TSB(Trypticsoybroth)特殊培养基中，对表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)进行了3个小时的第一次增菌处理，并将增菌的第一次增菌液接种到大量特殊培养基中，然后在37℃恒溫器里进行了摇晃增菌处理。在恒溫器中培养36个小时的菌液中，添加甲醛(formaldehyde)，使菌液的浓度变成0.2％，并在室内温度下进行了24个小时不活化处理。在4,000rpm的条件下，对进行不活化处理的菌液进行20分钟的离心处理，获得细菌，并用灭菌生理盐水(pH7.2)进行了三次稀释。将进行不活化处理的菌液涂抹在固体培养基上，确定其为不能增菌的菌体。用灭菌生理盐水对上述进行不活化处理的菌体进行三次稀释，并在-20℃的温度下冷藏，用作抗原。(丁)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液染色用阿新蓝(alcianblue)对利用特殊培养基增殖的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)粘液进行染色处理并确认。(3)制作金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抗原金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是从韩国典型培养物保藏中心(KCTC)购买并使用的，该菌的正规名称是金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusKCTC1621)。该抗原为典型的圆形菌，是形成不规则的葡萄串排列状的非孢子形成革兰氏细菌培养(0.5～1.5μm)菌，有时其外表带有胶囊状粘液层，作为人体病原性菌，是一种非运动性需氧或通性厌氧性菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抗原制作过程如下将金黄色葡萄球菌接种到胰酶大豆肉汤(Difco)上，并在37℃温度下培养24个小时。将菌体涂抹在固体培养基上，然后在4℃温度下保管，并在每7天继代培养和使用一次。在60℃恒温水槽中，对培养的菌体进行30分钟的热处理，杀灭活的抗原，然后在10,000xg条件下进行15分钟的离心处理，获得菌体，并在该菌体中添加生理盐水，进行三次离心处理，去除菌体内的培养基成分。利用血球计算仪，测定灭活菌体原液的细菌数量。(4)大肠菌(EnterotoxigenicE.coli)的分离同定和抗原制作(甲)从人体分离并同定大肠菌(EnterotoxigenicEscherichiacoliETEC)用于该实验的大肠菌(EnterotoxigenicE.coli)是从患有腹泻症状的小儿粪便中分离出来的。人体中的大肠菌具有标准微生物特性，只要是该
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的研究人员，均可轻松分离出大肠菌(EnterotoxigenicE.coli)。抗原分离方法如下在汉城大学附属儿童医院提取小儿的腹泻粪便，并将部分样本涂抹在半固体培养基上，然后在37℃恒溫器中培养18个小时，并选定一个呈现出α-溶血性的大肠菌菌落。该菌落在麦康凯琼脂(MacConkeyagar)中培养成粉红色，将其涂抹在EMB培养基(EMBagar)上，通过呈绿色(metalicgreen)的大肠菌特殊菌落性状进行确认。将如此分离的大肠菌命名为EB-E01。(乙)确认毒素(Toxin)生产能力通过聚合酶链反应(Polymerasechainreaction以下简称PCR)法，确认了大肠菌(E.coli)肠毒素(enterotoxigenicity)的主要原因——肠毒素(Entrotoxin)的生产能力。通过采用对热稳定毒素(以下简称STheatstabletoxin)STa1基因和热不稳定毒素(以下简称LTheatlabletoxin)LTh基因的特殊引物(Primer)的多重(multiplex)PCR方法，进行了扩增。ST毒素确认用引物为有义引物CCCCTCTTTTAGTCAGTC反义引物CCAGCACAGGCAGGATTACA采用了能够扩增到165bps最终产物的引物。LT毒素确认用引物为有义引物CAGACTATCAGTCAGAGGTTG反义引物TTCATACTGATTGCCGCA采用了能够扩增到417bps最终产物的引物。在PCR条件中，在预变性温度(Pre-denaturationtemperature)95℃下进行5分钟、在变性温度(Denaturationtemperature)94℃下进行1分钟、在退火温度(Annealingtemperature)56℃下进行1分钟、延伸温度(Elongationtemperature)72℃下进行1分钟、在后-延伸温度(Post-elongationtemperature)72℃下进行了10分钟扩增。对扩增的产物，以利用琼脂糖胶(agarosegel)2％的电泳方式进行了确认。经确认，用于该发明的分离菌株能够生成ST毒素。(丙)制作大肠菌ETEC(EnterotoxigenicE.coli)抗原将大肠菌ETEC菌株接种到胰酪蛋白胨大豆琼脂(Trypticasesoyagr)上，并在37℃恒溫器中培养18个小时，然后将一个菌落(colony)接种到5ml的胰化酪蛋白大豆培养基(Trypticasesoybroth)中。经2个小时后，又接种到大量胰化酪蛋白大豆培养基上，并在37℃恒溫器中放置培养了48个小时。在培养的菌液中添加菌液的0.2％的甲醛(formaldehyde)，并在室内温度下进行了24个小时的不活化处理。在4,000rpm的条件下，再对进行不活化处理的菌液进行20分钟的离心处理，获得细菌，并用灭菌生理盐水(pH7.2)进行了三次稀释。将菌体浮游在生理盐水上，使其从410nm变成1.2～1.3的O.D.(OculusDexter)后使用。(5)给小鸡接种四种复合抗原(甲)在给12周龄的小鸡接种的抗原中，痤疮丙酸杆菌抗原∶粘液量增加的表皮葡萄球菌抗原∶金黄色葡萄球菌∶大肠菌抗原∶乳化助剂的比例为3∶1∶1∶1∶4，并将1.0×109/ml痤疮丙酸杆菌杀菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌杀菌液抗0.05ml、1.0×109/ml金黄色葡萄球菌杀菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大肠菌杀菌液抗原0.05ml与氢氧化铝0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并在小鸡的一条腿上接种一次，并从第二次开始，用于增压的助剂采用乳化助剂(ISA25)，将上述四种抗原乳化成混合菌乳液，然后以两个星期为周期，在小鸡的一条腿上第二次接种0.5ml的混合菌乳液，如此共接种三次。本发明人通过图1、图2、图3、图4说明了接种上述四种混合菌乳液的产蛋鸡生下的鸡蛋，具有富含抗-痤疮丙酸杆菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黄色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大肠菌特殊免疫蛋白等复合型特殊免疫蛋白(IgY)的特点。通过实例2和实例3对此详细说明如下实例2.蛋黄分离及经过喷雾干燥处理的蛋黄粉末(1)蛋黄分离在禽蛋加工厂，以业内人士广知的技术，分离了通过上述方法生下的鸡蛋的蛋清和蛋黄。(2)蛋黄粉末利用喷雾干燥器，对分离的新鲜蛋黄进行喷雾干燥处理，生产蛋黄粉末。实例3.特殊免疫蛋白的分离及效价测定(1)特殊免疫蛋白的分离(甲)分离磷脂和水溶性特殊免疫蛋白(IgY)在禽蛋加工厂，分离通过上述方法生下的鸡蛋的蛋清和蛋黄，并为在含有抗-复合型特殊免疫蛋白(IgY)的蛋黄中分离出脂肪和脂蛋白(lipoprotein)，以1∶1的比例混合蛋黄和蒸馏水。即，准备稀释成两倍的10个蛋黄样本，并在每个样本里添加1～10％的硫酸铵，使其完全熔化，然后将完全熔化的10个样本置于温度为5℃的室内24个小时，那么根据每个样本的浓度，将分离为上层和下层。这时，上层浮有脂质和部分蛋白质，而下层出现微量沉淀。使用硫酸铵的常规蛋白质分离方法(Mathews1990)是在蛋白质沉淀法中最常见的方法，它是通过添加大量硫酸铵来提高样本浓度，使蛋白质沉淀量增多，并通过对此进行离心处理制作蛋黄粉末。为将精制度提高到10～20％，通过对其进行离心处理排除沉淀的方法来去除没用的粗蛋白质，然后添加20％以上的硫酸铵，并采用沉淀的蛋白质。但在该发明中，为了分离出蛋黄中的脂质，并未采用各种溶媒或溶剂(沉淀剂)，而是利用脂质的浮游性和硫酸铵的凝聚性，解决了分离蛋黄内的脂蛋白或免疫蛋白的难题。(乙)去除脂质、水溶性蛋白质和色素(蛋黄)为了去除留在已分离出脂质的液体中的部分脂质、水溶性蛋白质和色素(蛋黄)，进行了如下实验制作6个样本，并分别向每个样本添加6倍、12倍、18倍、30倍、42倍、48倍、60倍的蒸馏水进行稀释，然后将它们置于温度为5℃的室内一天。这时应注意，不能让已被分离的上清液与沉淀物混淆。稀释为6倍的样本出现了沉淀，但上清液中仍残留着蛋黄特有的黄色，而其沉淀物迅速与上清液混淆；稀释为12倍、18倍、30倍的样本也出现了沉淀，而且沉淀物也未与上清液混淆；稀释为42倍、48倍、60倍的样本虽然出现了沉淀，但出现了沉淀物与上清液混淆的现象。最合适的沉淀稀释率为12倍和18倍，其粘度极高，需要用热水清洗，就像粘有油漆渣一样，以至于用流淌的自来水也洗不净。如表1所示，对去除沉淀物的上清液进行特殊免疫蛋白(IgY)效价测定的结果显示，仅用效价标示的稀释率中，60倍和6倍的产率(yield)分别为109％和10％，高于标准值。估计这是因为受到水溶性蛋白质等影响，导致稀释后的效价高于原液中的效价。除了稀释为12倍和18倍的样本以外，其余样本也均超过了100％。最终选定了未出现沉淀物，色素也被完全去除的稀释率18倍的样本。表1表2(丙)实验结果此前，秋田(Akita，1993年)曾采用过利用蒸馏水的稀释法，在稀释后，利用右旋糖苷(dextran)、黄原胶(xanthangum)、聚氧乙烯(PEG)、乙醇(ethanol)、硫酸钠(sodiumsulfate)等沉淀剂进行沉淀，并用离心处理器分离，但该发明先用少量硫酸铵去除蛋黄中的脂质，将脂质和蛋白质部分凝集到上层，通过其他发明人经常使用的硫酸铵沉淀法，颠倒顺序分离出了蛋白质。即，此前是通过利用硫酸铵的沉淀法进行了分离处理，而该发明则采用浮游、凝集的方式进行了分离处理。在该发明中，仅用5％的硫酸铵、蛋黄和蒸馏水(1∶1)，通过脂质和部分蛋白质的重力差别，将它们凝集并去除，然后再用蒸馏水稀释，使蛋黄的色素和水溶性蛋白质凝集并沉淀。(2)特殊免疫蛋白的效价测定在通过上述过滤方式收集的水溶性蛋白质中，利用如下方式测定出了特殊免疫蛋白(IgY)的含量特殊免疫蛋白(IgY)含量的测定方式采用了酶免法(ELISA)，用缓冲溶液对每个抗原(痤疮丙酸杆菌、粘液量增加的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌)进行稀释处理，以使吸光度(O.D.)值从660nm变成0.05。将稀释的菌体涂抹在微量滴定盘上放置16个小时，然后稀释该微量滴定盘，并添加过滤的水溶性特殊免疫蛋白，进行反应和稀释，并添加了以1∶10,000稀释的IgGAb-HRP。这时，将TMB用作HRP的培养基，并将2Normal-硫磺酸(2N-H2SO4)用作反应终止液，在450nm条件下测定了吸光度。如图1、图2、图3、图4所示，特殊免疫蛋白(IgY)的含量测定结果如下如图1和图3所示，复合接种表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和大肠菌时，痤疮丙酸杆菌的特殊免疫蛋白效价要比单独接种痤疮丙酸杆菌时多，而复合接种痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠菌时，表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白效价也比单独接种表皮葡萄球菌多。此外，复合接种痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和大肠菌时，金黄色葡萄球菌的特殊免疫蛋白效价要比单独接种金黄色葡萄球菌多。如图2和图4所示，复合接种痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌时，大肠菌特殊免疫蛋白的平均效价要比单独接种时高。发明效果综上所述，该发明同时对痤疮诱发菌——痤疮丙酸杆菌、皮肤疾病诱发菌——表皮葡萄球菌、诱发化脓性炎症的金黄色葡萄球菌和大肠菌进行抗原处理，并制成同时含有上述四种抗原的特殊免疫蛋白的复合型特殊免疫蛋白，因而添加了复合型特殊免疫蛋白的防痤疮化妆品能有效治疗皮肤疾病。详细说明该发明效果如下首先、在给小鸡(约为12周龄)陆续接种(三次接种×四种菌＝共一二次接种)上述四种痤疮诱发菌时，通过一二次痤疮诱发菌接种，最大限度地减少压力，并能增加产蛋鸡的产蛋量。据相关报告内容显示，如给产蛋鸡直接接种上述诱发菌，就会降低50～60％的产蛋量。如该发明实例所示，如果鸡蛋产量增加，鸡蛋内的复合型特殊免疫蛋白也能达到最高值。其次、给小鸡接种根据该发明研发的病原性主要原因——粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，为其进行免疫，能有效增加抗-表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白。序列表<110>鸡蛋高新技术有限公司(EggBiotechIncorporation)<120>含有针对约四种引起痤疮的抗原的混合IgY的鸡蛋及其蛋黄粉和混合IgY的生产方法(THEPRODUCTIONMETHODOFEGGCONTAININGMIXIGYABOUTFOURANTIGENCAUSINGACNESANDTHEREOFEGGYOLKPOWDERANDMIXIGY)<130>SPI033238-47<140><141><160>4<170>PatentInversion3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1cccctcttttagtcagtc18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccagcacaggcaggattaca20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cagactatcagtcagaggttg21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4ttcatactgattgccgca18权利要求1.含有四种混合菌的抗-复合型特殊免疫蛋白(IgY)鸡蛋生产方法应具有如下特点用氢氧化铝将痤疮丙酸杆菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原和大肠菌抗原乳化成混合菌乳液，并用该乳液给小鸡进行一次免疫接种；再用乳化助剂(ISA25)乳化上述四种抗原，制成混合菌乳液，并以两个星期为周期，给小鸡进行第二次免疫接种，使得生下含有特殊免疫蛋白的鸡蛋，是一种含有四种混合菌的抗-复合型特殊免疫蛋白(IgY)鸡蛋生产方法。2.在第1项中，给小鸡接种的菌体数比例应为痤疮丙酸杆菌抗原∶表皮葡萄球菌抗原∶金黄色葡萄球菌抗原∶大肠菌抗原∶乳化助剂＝3∶1∶1∶1∶4。为此，应将1.0×109/ml痤疮丙酸杆菌杀菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌杀菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml金黄色葡萄球菌杀菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大肠菌杀菌液抗原0.05ml与氢氧化铝0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并给小鸡进行一次免疫接种的阶段；再用乳化助剂(ISA25)乳化上述四种同一比例的同一抗原，制成混合菌乳液，并以两个星期为周期，给小鸡进行第二次免疫接种，使得生下含有特殊免疫蛋白的鸡蛋。3.在第1项或第2项中，表皮葡萄球菌利用含有蔗糖0.5％和乙二胺-DI-O-间苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-o-hydroxyphenolaceticacid)0.5％的胰酶大豆肉汤(TrypticSoyBrothTSB)增菌培养，使其粘液量增加。4.将从利用第3项方法生下的鸡蛋提取蛋黄，进行分离和喷雾干燥处理，制成蛋黄粉末。5.将从利用第3项方法生下的鸡蛋提取的蛋黄，用蒸馏水稀释的阶段在上述稀释溶液中，添加含有特殊免疫蛋白(IgY)的水溶性蛋白质和足以分离磷脂的3～10％的硫酸铵，以分离磷脂和水溶性蛋白质的阶段；然后用蒸馏水稀释上述分离的溶液，然后置于4～10℃的温度中进行沉淀。全文摘要该发明是关于针对痤疮发病菌的复合型特殊免疫蛋白生产方法及复合型特殊免疫蛋白的技术。进一步说明如下用氢氧化铝将痤疮丙酸杆菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原和大肠菌抗原乳化成混合菌乳液，并用该乳液给小鸡进行一次免疫接种，然后再用乳化助剂(ISA25)乳化上述四种抗原，制成混合菌乳液，并以两个星期为周期，给小鸡进行第二次免疫接种，使鸡生下含有特殊免疫蛋白的鸡蛋，是一种含有四种混合菌的抗－复合型特殊免疫蛋白(IgY)的鸡蛋生产方法。此外，在添加蔗糖和乙二胺－D－O－间苯二酚乙酸的培养基中增加表皮葡萄球菌的粘液量，然后给小鸡进行抗原、免疫处理，增加抗体能力。根据上述方法生下的鸡蛋蛋黄粉末或复合型特殊免疫蛋白能有效预防痤疮。文档编号A61P17/00GK1611514SQ20031010455公开日2005年5月4日申请日期2003年10月31日优先权日2003年10月31日发明者李南珩,郑顺姬,金美铉,金相兑,李吉成申请人:鸡蛋高新技术有限公司