专利名称：单纯疱疹病毒ⅱ型dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是涉及一种DNA疫苗。
背景技术：
生殖器疱疹的病原体是单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)。单纯疱疹病毒，是一种DNA病毒，人类是单纯疱疹病毒的唯一自然宿主。单纯疱疹病毒可分为I型(HSV-1)及II型(HSV-2)两种。单纯疱疹II型感染临床表现为生殖器疱疹(GH)。亚临床感染、无症状排毒、未识别症状及不典型患者是GH的主要传染源。大多数将疾病传染给性伴侣的生殖器HSV感染者通常并不知道自己感染了HSV。有临床症状或皮损时，传染性强；无症状感染者及复发性GH的复发间歇期也可能排毒，有传染性。HSV感染引起的GH往往呈慢性复发过程，尚无彻底治愈的方法。即使早期治疗初发感染，也不能阻止潜伏期感染或预防复发。
目前临床上所有用药，仅能起到以下几方面作用1)减少严重初发感染的病毒扩散和症状；2)勉强地减少复发病例的病毒扩散和症状；3)治疗免疫受损病人的慢性感染；4)预防性应用，减少复发率。
目前尚无特效药物控制单纯疱疹病毒的发生和复发。因而DNA疫苗成为国内外研制抗HSV感染的热点。目前国内外主要是将多克隆全长，或去除信号肽的HSV-1、HSV-2糖蛋白D基因，与普通真核表达载体pcDNA3或其衍生系列等连接构建DNA疫苗。其构建成功的糖蛋白D基因DNA疫苗表现为能激发体液免疫，但对细胞免疫的诱导能力弱。而在单纯疱疹II型感染中，细胞免疫扮演了重要角色。由于目前国内外构建的糖蛋白D基因DNA疫苗无法诱导强大的细胞免疫，因而不能有效预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染。
发明内容
本发明的目的在于克服以上问题提供具有预防和治疗作用的单纯疱疹病毒II型DNA疫苗。
本发明从单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因的克隆测序出发，与Gene Bank中单纯疱疹病毒II型糖蛋白D基因序列比较分析，BIMAS、SYFPEITHI软件分析糖蛋白D基因全长氨基酸序列，确定糖蛋白D基因上CTL表位和抗原保护性片段，截取基因Arg92-Ala302克隆到真核表达载体pVAX1，构建截短糖蛋白D基因DNA疫苗1；在体内、体外实验结果上进一步克隆截短糖蛋白D基因Arg92-Ala302和真核表达载体pcDNA3构建截短糖蛋白D基因DNA疫苗2。两种截短糖蛋白D基因DNA疫苗，均可诱导被免疫机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染，解决单纯疱疹II型感染反复复发的严重问题。
本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pVAX1和pcDNA3。
pVAX1购自invitrogen公司，序列和物理谱图见该公司的产品目录。
pcDNA3购自invirtrogen公司，序列和物理谱图见该公司的产品目录。
插入的外源基因Arg92-Ala302来源于单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，其结构描述如下所示(1)序列特征长度676bp类型核酸链数双链几何结构线性(2)分子类型DNA(3)来源单纯疱疹病毒II型sav株，购自中国预防科学院(4)序列描述如序列表所示。
本发明的有益效果本发明构建的这两种疫苗以基因枪介导方式、肌注方式免疫，能大大减少疫苗的用量，有效激发体液免疫和细胞免疫，同时具有免疫过程简单、接种安全、可重复性强等优点。
图1为含截短糖蛋白D基因(Arg92-Ala302)的质粒图谱；图2为截短糖蛋白D基因DNA疫苗构建流程图；图3为豚鼠血清糖蛋白D基因DNA疫苗IgG结果图；图4为免疫豚鼠外阴平均皮损统计图；图5为小鼠脾淋巴细胞刺激指数图(d28)；图6为免疫小鼠脾淋巴细胞CTL活性图(d28)；
图7为免疫小鼠抗致死量HSV-2病毒攻击结果图。
其中，附图中的gD表示糖蛋白D基因。
具体实施例方式
实施例1截短糖蛋白D基因DNA疫苗1的制备1、HSV-2基因组DNA的提取(1)收集≤160μL出现CPE为+++的Vero细胞上清，移入1.5mL离心管中。
(2)加入3倍样品体积的BufferG-AV，漩涡震荡混合均匀，冰浴5min。
(3)加入1.8倍体积的BufferG-BV，用力混合均匀。
(4)将混合溶液转入Filter(置于2mL Microfuge Tube中)，12 000×g离心1min。
(5)将Filter置于另一新的2mL Microfuge Tube中，吸弃上相，将下相溶液转入原滤器中，12 000×g离心1min。
(6)弃Filter，在滤液中加入2倍体积的Buffer G-CV，混合均匀。
(7)将Nucleic acid-prep Tube置于2mL Microfuge Tube中，将步骤(6)中的混合液加入Nucleic acid-prep Tube中，1 000×g离心1min。
(8)弃滤液，将Nucleic acid-prep Tube置回到原2mL Microfuge Tube中，加入500μL Buffer W1，1 000×g离心1min。
(9)弃滤液，将Nucleic acid-prep Tube置回到原2mL Microfuge Tube中，加入700μL已加无水乙醇的Buffer W2，1 000×g离心1min，以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次。
(10)将Nucleic acid-prep Tube置于1.5mL离心管中，12 000×g离心1min。
(11)将Nucleic acid-prep Tube置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加入40μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12 000×g离心1min洗脱DNA。
2、全长糖蛋白D基因的PCR扩增(1)特异性引物P1、P2的稀释P1核酸序列5′-AAATACGCCTTAGCAGACCCCT-3′P2核酸序列5’-CTAGTAAAACAATGGCTGGTGC-3’分别以500μL双蒸水溶解上下游引物，得到浓度约为20μmol/L的引物溶液。计算公式如下分子量＝碱基数×324.5。质量数＝OD值×33。摩尔数＝质量数/分子量。添加的水体积＝摩尔数/所要的摩尔浓度。
(2)PCR反应体系10×PCR Buffer 5μLHSV-2基因组模板DNA 5μL10mmol/L dNTP Mix 1μL上游引物P1(20pmol/L)1μL下游引物P2(20pmol/L)1μL无菌双蒸水 36.75μLQIAGEN Taq DNA Polymerase 0.25μL总体积 50μL(3)PCR扩增条件第一步，96℃变性10min。第二步，按下列参数重复35个循环，94℃变性1min，65℃退火2min，72℃延伸2min。第三步，65℃退火5min，72℃延伸5min。冷至室温。
PCR产物经胶纯化。
3、PCR产物的纯化(1)在紫外灯下，用干净、锋利的解剖刀将DNA片段从琼脂糖凝胶中切出。
(2)无色小管中称胶块重。按每1μg胶块加3μL加入Buffer QG。
(3)50℃水浴10min(或直到胶块全部熔解)，期间每隔2～3min可漩涡振荡助熔。
(4)胶块熔解完全后，目测混合物的颜色是否为接近于Buffer QG的黄色。
(5)将QIAquick spin柱放入提供的收集管中。
(6)将样品移入QIAquick spin柱，离心(≥12 000×g)1min。
(7)弃滤液，把QIAquick spin柱放回原收集管。
(8)加入0.75mL的Buffer PE到QIAquick spin柱中，离心(≥12 000×g)1min。
(9)弃滤液，13 000r/min(约17900×g)离心1min。
(10)将QIAquick spin柱放到干净的1.5mL离心管中。
(11)加50μL的Buffer EB或水到QIAquick spin柱的膜中心，离心1min。
4、PCR产物与T载体的连接
PCR产物与pUCm-T载体连接反应体系10×Ligation Buffer 1μLPEG4000 1μLpUCm-T vector 1μL纯化后的PCR产物 3μL无菌ddH2O 3μLT4 DNA连接酶1μL总体积 10μL在16℃水浴中连接过夜，用于随后的转化实验。
5、糖蛋白D基因(Arg92-Ala302)的扩增(1)特异性引物P3、P4的稀释P3核酸序列ATTGAATTCAGCATGGCGTGCTCCTACATGCCCP4核酸序列TTATCTAGATTCAGGGCCGAGTCCTCGGGGTC稀释方法参照上述引物P1、P2的稀释方法。
(2)在洁净的PCR用Ep管中加入下列各组分10×PCR Buffer 5μLpUCm-gD 1μL10mmol/L dNTP Mix1μL上游引物P3(20pmol/L) 1μL下游引物P4(20pmol/L) 1μL无菌双蒸水 40μLTaq DNA Polymerase 1μL
总体积50μL(3)充分混匀，按下列程序进行PCR扩增第一步，96℃变性10min。第二步，按下列参数重复35个循环，94℃变性1min，58℃退火2min，72℃延伸2min。第三步，58℃退火5min，72℃延伸5min。冷至室温。
(4)PCR产物经胶纯化。
6、PCR产物及载体的酶切用EcoR I、Xba I分别对PCR产物和载体pVAX1进行双酶切，酶切反应体系PCR产物/载体15μL/10μLEcoR I 1μLXba I 1μL酶缓冲夜(10×) 2μL无菌蒸馏水 1μL/6μL总反应体积 20μL37℃水浴2～4h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。
7、酶切产物连接将纯化后PCR酶切产物与同样酶切纯化的线性载体pVAX1连接，同时做3个连接反应。
反应体系 R1R2R3载体酶切产物3μL 3μL 2μLPCR的酶切产物 3μL 9μL 12μL
10连接缓冲液 2μL 2μL 2μLT4连接酶 1μL 1μL 1μL无菌蒸馏水11μL 5μL 3μL总体积 20μL在16℃水浴中连接过夜。
8、大肠杆菌感受态细胞的制备(1)以无菌铂丝直接蘸取大肠杆菌菌株培养液在基本培养基(LB)平板上划板，37℃培养12～16h。
(2)挑取单菌落，转移到含有3mL LB培养基的试管中，37℃振荡过夜培养(3)取1mL菌液接种到含有100mL的LB培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h，待培养2h后每隔20min测定OD600值来检测培养物的生长情况，待OD600值达到0.3～0.4时立即将锥形瓶冰浴15min，使培养物冷却至0℃。
(4)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50mL离心管中。
(5)在4℃条件下，以4 000r/min离心10min，回收细胞。
(6)倒出培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。
(7)用约20mL(每管10mL)预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体(重悬时操作要轻)，冰浴30min。
(8)在4℃条件下，以4 000r/min离心10min，回收细胞。
(9)弃去上清液，倒置于滤纸上1min，以使最后残留的液体流尽。
(10)再加4mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻轻振荡重悬菌体。
(11)将感受态细胞分装于EP管中，每份100μL，加入30％体积的甘油保存液，置于-70℃冰箱冻存。
9、大肠杆菌的转化实验(1)100μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
(2)加入5～10μL连接液，轻轻旋转混匀，冰上放置30min。
(3)42℃水浴热激90s，冰上放置2min。
(4)加800μL LB培养基，37℃，150r/min温和振荡培养1h。
(5)取100μL菌液涂布在预先用20μL 100mmol/L IPTG和100μL20mg/mL X-gal涂布的Ampr平板(T载体连接时)或仅含kanr(pVAX载体连接时)的平板上。
(6)平板在37℃下正向放置20min，然后倒置培养12～16h。
10、转化子筛选选择在IPTG/X-gal或Kanr平板上的白色菌落，用接种环挑至含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
11、大肠杆菌质粒的提取(1)将过夜培养的3mL细菌，高速离心1min，彻底去除上清液。
(2)加入100μL溶液I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
(3)加入200μL溶液II，立即上下颠倒离心管，使细胞裂解，室温放置至溶液变成澄清。
(4)加入400μL溶液III，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，室温放置2min。
(5)14 000r/min高速离心10min。
(6)取出样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤(5)中的上清液全部转移到3S柱中，12 000r/min离心1min。
(7)取下3S柱，弃去收集管中废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700μL Wash Solution到3S柱，高速离心1min，重复一次。
(8)取下3S柱，弃去废液，将3S柱放入同一支收集管中，高速离心2min。
(9)将3S柱放入干净的1.5mL的离心管中，在3S柱子膜中央加入50μL水，室温放置2min，盖上离心管盖，室温高速离心1min，洗脱质粒置于-20℃保存备用。
12、阳性克隆的鉴定(1)小量单酶解反应①在洁净的0.5mL的Ep管中加入下列各组分质粒DNA 10μL10×缓冲液H/M 2μL去离子水 7μLEcoR I1μL总体积20μL②混匀后，37℃水浴2h，取出琼脂糖电泳鉴定或4℃保存。
(2)小量双酶解反应
①在洁净的0.5mL的Ep管中加入下列各组分质粒DNA10μL10×缓冲液(M) 2μL去离子水 6μLEcoR I 1μLXba I 1μL总体积 20μL②混匀后，37℃水浴2h，取出琼脂糖电泳或4℃保存。
实施例2截短糖蛋白D基因DNA疫苗2的制备方法同实施例1，只是所用的真核表达载体pVAX1用pcDNA3代替。
实施例3豚鼠免疫实验(1)免疫方法Hartley白化豚鼠30只，雌性，体重275±25g，随机分成空白、载体、实验三组，每组10只，于免疫前一周于豚鼠股四头肌注射100μg/mL盐酸布比卡因预处理。分别用生理盐水100μL、pVAX 100μL(含100μg对应质粒)，pVAX-gD 100μL(含100μg对应质粒)于d0、d7、d28免疫豚鼠右后肢股四头肌，共免疫三次。
(2)间接ELISA检测IgG方法豚鼠于初次免疫的d0，d7，d14，d21，d28，d56，d84，d112，d126，d137，d144眼眶取血。间接ELISA检测血清IgG。
1)抗原包被后，37℃水浴2h，然后4℃过夜包被(抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释)。
2)PBS(含0.05％吐温20，V/V)洗5次。
3)每孔加10％小牛血清100μL，37℃水浴30min。
4)PBS洗5次，加待测血清，37℃水浴30min。
5)PBS洗5次，加100μL HRP标记等抗体(二抗)37℃水浴30min。
6)PBS洗5次，加显色液100μL，37℃水浴15min。
7)加1mol/L H2SO4100μL终止反应。
8)酶标仪波长595nm出OD值。
结果将pVAX-gD、pVAX、NS肌注免疫豚鼠，pVAX-gD组在第三次免疫前(d21)即检测到较高滴度的gD2 IgG，同同期的其它两组比较有显著性差异(P＜0.01)，在免疫d28天接近最高水平。高滴度的IgG可维持近三个月，当外源特异性抗原再刺激时，IgG水平又迅速升高，迅速发生再次免疫应答反应。如图3所示。
*同同期的pVAX组或NS组相比，P＜0.01#标志的几组数据之间没有显著性差异。
(3)抗病毒实验方法于d56生理盐水清洗豚鼠外阴，0.1mol/L NaOH擦拭后，用干棉签擦干，用1mL注射器吸取0.2mL HSV-2 sav病毒(含106TCID50)，配上灌胃针头，将针头伸入阴道内约3～4cm，将病毒液注入阴道穹隆后缓慢退出。同样操作进行两次，避免出现感染不上的情况。于接种后连续每日观察21d，记录豚鼠感染情况。
结果接种并感染病毒的豚鼠均出现类似于人类的疱疹症状红肿、起疱、溃疡、结痂。皮损症状严重程度从0-4分为5个等级，0表示无感染；1表示局部红肿，无水疱或初发愈合后结痂；2表示红肿并有单个小水疱；3表示大水疱并有局部溃烂；4表示溃疡，糜烂，后肢瘫痪。将pVAX-gD、pVAX、NS肌注免疫豚鼠，HSV-2 sav病毒攻击。载体质粒pVAX组、空白对照NS组均表现出严重的初发感染和复发，pVAX-gD组仅有1只出现复发，且程度较轻。可见pVAX-gD能有效地保护豚鼠抵抗HSV-2病毒感染，延缓初发感染，减少复发感染。结果如图4所示。
实施例4小鼠实验(1)免疫方法30只BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只1)载体质粒pVAX组；2)重组质粒pVAX-gD组；3)空白对照NS组。每只小鼠于免疫前一周于胫前肌注射100μg/mL盐酸布比卡因预处理。小鼠后肢胫前肌肌注0.1mL(1mg/mL)质粒，1次/1周，连续3周。分别于末次加强免疫后两、三周、四周后取小鼠血清及脾细胞测定多项免疫学指标。
(2)MTT测脾淋巴细胞增殖方法
免疫完成后d28时，无菌条件下制备小鼠脾细胞悬液，10％NCS-RPMI1640培养液重悬，取样计数，调整细胞至5×106/mL，于96孔板每孔各加50μL细胞(2.5×105/孔)用，每个样本分三组1)培养液空白对照，2)实验组pVAX-gD。3)阳性对照PHA(20μg/mL)，各三复孔，37℃，5％CO2培养68h，各加MTT(5μg/mL)，继续培养4h，小心吸弃上清，用100μL DMSO溶解质粒，置酶标仪上测490nm值，计算刺激指数SI。
结果免疫完成28天后，检测各组免疫小鼠脾淋巴细胞增殖活性，以刺激指数SI(SI＝实验孔OD490值/培养液对照孔OD490值)表征，如图5所示，用gD蛋白抗原刺激时，d28天时pVAX-gD组小鼠脾淋巴细胞刺激指数SI较同期空白对照NS组明显升高(P＜0.01)，较同期载体质粒pVAX组亦明显升高(P＜0.01)，较同期阳性对照PHA组(2.231)低。表明pVAX-gD对小鼠脾淋巴细胞增殖活性有一定的促进作用。
*pVAX-gD组小鼠脾淋巴细胞SI较同期NS组明显升高，P＜0.01(3)CTL活性测定方法以L929为靶细胞用LDH法测定。
于末次加强免疫后一周取5×106/mL脾细胞悬液1.5mL于24孔板，各3复孔，加2μg/mL PHA，37℃、5％CO2培养24h后，再加20μg/mLIL-2和2μg/mL HSV-gD2抗原培养5d，收未贴壁细胞，106/mL。取生长良好的L929靶细胞于实验前用gD2抗原蛋白共育过夜，10％NCS-RPMI1640培养液洗涤并重悬至1×105/mL。
实验设四组1)靶细胞自发释放孔。2)靶细胞最大释放孔。3)脾细胞自发释放孔。4)实验孔(效应细胞+靶细胞)。脾效应细胞为5×105/100μL/孔，L929为1×104/100μL/孔，效应细胞∶靶细胞(E∶T)＝50∶1，加样于96孔板，各3复孔，总体积200μL。1 000r/min离心5min，37℃、5％CO2培养24h，培养结束前1h同上离心，小心吸取上清液0.1mL，加LDH底物混合液0.1mL室温下反应30min后加0.1mol/L柠檬酸30μL终止反应，呈蓝色，置BIORAD550型酶标仪测OD490值。
计算CTL活性。CTL细胞活性(％)＝(实验孔OD490值-效应细胞自发释放孔OD490值-靶细胞自发释放孔OD490值)/(靶细胞最大释放孔OD490值-靶细胞自发释放孔OD490值)×100结果将pVAX-gD、pVAX、NS肌注免疫小鼠。免疫完成d28，效应细胞∶靶细胞为50∶1时，pVAX-gD组小鼠脾脏CTL活性为37.5％，较载体质粒pVAX组及空白对照NS组明显增高。表明pVAX-gD有较明显的促CTL活性作用。如图6所示。
*同pVAX组或NS组相比，P＜0.01(4)抗HSV-2保护率测定方法
小鼠免疫完成4周后，各组小鼠腹腔接种0.2mL HSV-2 sav病毒稀释液(100LD50)，每天观察其死亡情况，统计小鼠死亡率。
结果免疫完成d28时，对免疫小鼠采用致死量病毒攻击，评价pVAX-gD对小鼠的保护效率。小鼠接受病毒攻击后第5天开始出现死亡，第10天后剩余小鼠全部存活。死亡率统计如图7所示。NS组和载体质粒pVAX组小鼠死亡率分别为100％和80％，而pVAX-gD组死亡率仅20％，80％的小鼠存活，表明pVAX-gD能有效减轻免疫小鼠免受致死量病毒的攻击，具有明显的保护作用。
单纯疱~1SEQUENCE LISTING<110>广州军区广州总医院<120>单纯疱疹病毒II型DNA疫苗<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>676<212>DNA<213>疱疹病毒<400>1attctcgaga agagatgccg cagcgtgctc ctacatgccc catcggaggc cccccagatc 60gtgcgcgggg cttcggacga ggcccgaaag cacacgtaca acctgaccat cgcctggtat120cgcatgggag acaattgcgc tatccccatc acggttatgg aatacaccga gtgcccctac180gacaagtcgt tgggggtctg ccccatccga acgcagcccc gctggagcta ctatgacagc240tttagcgccg tcagcgagga taacctggga ttcctgatgc acgcccccgc cttcgagacc300gcgggtacgt acctgcggct agtgaagata aacgactgga cggagatcac acaatttatc360ctggagcacc gggcccgcgc ctcctgcaag tacgctctcc ccctgcgcat ccccccggca420gcgtgcctca cctcgaaggc ctaccaacag ggcgtgacgg tcgacagcat cgggatgcta480ccccgcttta tccccgaaaa ccagcgcacc gtcgccctat acagcttaaa aatcgccggg540tggcacggcc ccaagccccc gtacaccagc accctgctgc cgccggagct gtccgacacc600accaacgcca cgcaacccga actcgttccg gaagaccccg aggactcggc cgatgacgat660gacaagtatc tagatt67权利要求
1.一种单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，包括真核表达载体和截短糖蛋白D基因，其特征在于所述截短糖蛋白D基因为Arg92-Ala302，来源于单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，Arg92-Ala302基因的核苷酸序列如序列表所示。
2.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为pVAX1。
3.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为pcDNA3。
全文摘要
本发明公开了一种单纯疱疹病毒II型DNA疫苗。本发明应用分子克隆等基因工程技术，从单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因中，分离克隆出截短糖蛋白D基因Arg92－Ala302，与真核表达载体pVAX1连接构建成截短糖蛋白D基因DNA疫苗1；与真核表达载体pcDNA3连接构建成截短糖蛋白D基因DNA疫苗2。这两种截短糖蛋白D基因DNA疫苗，均可诱导被免疫机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染，解决单纯疱疹II型感染反复复发的严重问题。
文档编号A61P31/00GK1651081SQ200410052460
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月1日 优先权日2004年12月1日
发明者杨慧兰 申请人:广州军区广州总医院