癌胚抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用的制作方法

专利名称：癌胚抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及人癌胚抗原(CEA)与人热休克蛋白70L1(以下简称Hsp70L1)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在制备CEA阳性肿瘤疫苗的方面的应用。
背景技术：
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种膜结合的180-200Kda的细胞间粘附糖蛋白，它在相当比例的人肿瘤细胞膜上高度表达，包括90％以上的结直肠癌、胃癌、胰腺癌，70％的非小细胞肺癌及50％的乳腺癌等，这些肿瘤属高发性肿瘤，其恶性程度一般较高且容易转移和复发。目前，手术、化疗、放疗等传统疗法对于早期CEA阳性肿瘤具有一定的疗效，但一方面化疗、放疗具有较大的副作用，另一方面由于许多肿瘤发现较晚，往往失去手术治疗的最佳机会，所以通过增强机体免疫系统的抗肿瘤作用杀灭肿瘤细胞、达到治疗肿瘤目的的免疫与基因疗法作为肿瘤治疗的一种新模式，成为肿瘤治疗和免疫学研究的热点。
目前对于CEA阳性肿瘤已经探讨了多种免疫和基因治疗方案，如构建CEA重组病毒疫苗、核酸疫苗、自杀基因的应用、抗独特型抗体的研制、细胞因子的应用等。随着CEA氨基酸序列中众多的T细胞表位被发现，并证实其可以在体外诱导出特异性的细胞免疫应答，以这些表位肽为基础的肿瘤疫苗受到了研究者的关注，Tsang将携带有一个HLA-A*0201限制性的九肽表位CAP-1(CEA605-613，YLSGANLNL)的重组痘苗病毒疫苗用于治疗CEA阳性肿瘤患者，也有研究者用一个独特的禽痘病毒衍生的金丝雀痘病毒载体系统ALVAC(canarypox)重组CAP-1作为疫苗。但通常认为机体对于体内肿瘤细胞所表达的CEA处于免疫耐受的状态，很少有证据表明肿瘤患者体内产生了较强的针对CEA的细胞免疫应答，所以通过某些方式使CEA所含表位得以被机体免疫系统有效的识别，从而引起机体对肿瘤的特异性细胞免疫应答，打破机体对CEA的免疫耐受是CEA阳性肿瘤免疫治疗的关键点。
近年来，肿瘤抗原的发现、肿瘤免疫逃逸和抗肿瘤免疫应答机制的逐步阐明使人们认识到，如何有效提呈肿瘤抗原、激发机体对肿瘤抗原的应答能力是影响疗效的一个关键因素。树突状细胞(Dendritic cells，DC)研究的深入不仅使基础免疫学研究取得重要进展，而且给肿瘤的免疫治疗带来了希望。DC作为机体免疫系统中功能最强的专职性抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)，能高效地摄取、加工处理和提呈抗原，并能够显著的激活初始型T细胞以启动T细胞免疫应答反应，是机体免疫反应的始动者，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。在受到抗原刺激后，DC经由循环或淋巴系统迁移至二级淋巴器官，并在此将所加工处理的抗原提呈给T细胞，在此过程中MHCI、II类分子、粘附分子等免疫相关分子的高表达对DC功能的发挥起十分重要的作用。采用肿瘤抗原或其中的某些特异性表位肽致敏的DC作为肿瘤治疗性疫苗已经在基础及临床研究中得到了证实，在前列腺癌、黑色素瘤、恶性淋巴瘤等肿瘤中取得了较好的疗效，被认为是目前疗效最有前景的肿瘤免疫治疗方案。但是，单纯采用小分子的抗原肽体外致敏DC的效率一般较低，DC在摄取小分子肽后，往往不能有效递呈抗原并激发特异性的CTL，因此如何增强DC对抗原的加工递呈，以期更有效地激发肿瘤抗原特异性的免疫应答仍然是肿瘤免疫治疗研究中亟待解决的问题。近年来有人尝试利用辅助蛋白，如KLH(钥孔虫戚血蓝蛋白)辅助肿瘤特异性的抗原去刺激DC，结果可增强抗肿瘤免疫应答。因此，发现并应用高效的辅助分子作为免疫佐剂(Adjuvant)，增强肿瘤抗原肽致敏DC的效能，从而诱导出更强的抗肿瘤免疫，是提高DC为基础的肿瘤免疫治疗的一个重要途径。
随着免疫学研究的进展，新一代佐剂不断被发现，如热休克蛋白(Heat shockprotein，HSP)、IFN-γ、IL-12、LPS、lipid A和CpG等，其中HSP以其所具有的独特的生物学效应，受到越来越多的关注。当细胞遭受严重应激时，HSP可从细胞内释放出来，成为一种内在的“危险信号”向APC发出警示信息，并可活化DC，APC被HSP趋化和激活后必将进一步激发免疫反应，引发抗原摄取和递呈，静息的T细胞由于获得APC呈递的抗原和危险信号的双重刺激而活化，从而引起抗体产生、病损细胞及感染因子的清除等一系列免疫过程。在明确了HSP的独特佐剂效应的基础上，利用HSP的佐剂作用诱导抗肿瘤和抗感染免疫成为目前免疫治疗的前沿热点，基于HSP作为佐剂的新一代疫苗也纷纷进入临床试验研究。
然而，迄今为止尚没有十分有效的CEA阳性肿瘤治疗性疫苗，因此，本领域迫切需要开发新的有效的CEA阳性肿瘤治疗性疫苗及其制备方法。

发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有CEA和Hsp70L1两者生物活性的物质，它是CEA和Hsp70L1的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述CEA-Hsp70L1融合蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供用该融合蛋白制备CEA阳性肿瘤治疗性疫苗的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)癌胚抗原元件，该元件具有人癌胚抗原或其免疫原性片段的氨基酸序列；(b)热休克蛋白元件，该元件具有人热休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)任选地位于癌胚抗原元件和热休克蛋白70L1元件之间的连接肽(较佳地，连接肽为0-20个氨基酸的连接肽序列)。
在另一优选例中，所述的癌胚抗原元件选自下组全长的癌胚抗原、含癌胚抗原的第576-669位的片段；所述的热休克蛋白元件选自下组Hsp70或Hsp70L1。
而且，所述的接头肽序列含4-10个氨基酸。
在另一优选例中，所述的癌胚抗原元件具有SEQ ID NO9所示的氨基酸序列，所述的热休克蛋白元件具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码权利要求1所述的融合蛋白。
在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
在本发明的第五方面，提供了部分所述融合蛋白的用途，它用于制备治疗CEA阳性肿瘤的治疗性疫苗药物或用于致敏树突状细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种树突状细胞，它是用权利要求1所述的融合蛋白致敏过的树突状细胞。
在本发明的第七方面，提供了一种CEA阳性肿瘤预防性或治疗性疫苗，它含有安全有效量本发明所述的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞或本发明所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供一种CEA阳性肿瘤特异性细胞免疫的诱导方法，包括以下步骤采用本发明所述的融合蛋白致敏的树突状细胞体外刺激人外周血淋巴细胞。
在另一优选例中，该刺激步骤包括(1)采用10-100μg/ml的本发明所述的融合蛋白，与105-106树突状细胞共同孵育，作用2-48小时，收集致敏的树突状细胞细胞，并放射性灭活；(2)将致敏后且灭活的树突状细胞按树突状细胞∶T细胞为1∶1-10000的比例共同孵育，在完全培养基中添加10-100U/ml的IL-2，10-100ng/ml IL-7，10-100ng/m1 IL-10，培养7±2天；重复(1)、(2)步骤3-10次，收集增殖的T细胞，即为CEA阳性肿瘤特异性T细胞。


图1显示了重组pGEM-T-CEA质粒的酶切鉴定。其中，泳道1lDNA/EcoT14I DNA分子量标准；泳道2经EcoRI酶切的pGEM-T-CEA质粒。
图2显示了重组CEA576-669-Hsp70L1质粒的酶切鉴定。其中，泳道1lDNA/EcoT14IDNA分子量标准；泳道2经ScaI-KpnI酶切的pQE30-CEA576-669-Hsp70L1质粒。
图3显示了重组CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白的诱导表达。其中，泳道1蛋白分子量标准；泳道2IPTG诱导的重组pQE30-CEA576-669-Hsp70L1/M15；泳道3IPTG诱导的pQE30/M15。
图4显示了重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白在包涵体中的表达。其中，泳道1蛋白分子量标准；泳道2IPTG诱导的重组pQE30-CEA576-669-Hsp70L1/M15超声上清；泳道3IPTG诱导的重组pQE30-CEA576-669-Hsp70L1/M15包涵体图5显示了DEAE柱纯化重组CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白。
图6显示了纯化的重组CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白的SDS-PAGE鉴定。
图7显示了在CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的结肠癌患者(CEA+，HLA-A*0201+)DC体外诱导出CEA特异性的CTL。
图8显示了抗原特异性的释放IFN-γ的T细胞的ELISPOT检测结果。
图9显示了各免疫组的小鼠脾细胞体外经不同抗原再刺激后分泌IL-2。
图10显示了各免疫组小鼠脾细胞体外经不同抗原再刺激后的IFN-γELISPOT结果。
图11显示了CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的DC免疫诱导CEA特异性CTL的检测结果。
图12显示了SW480肿瘤在各过继回输组裸鼠体内的生长情况。
图13显示了荷瘤裸鼠的存活曲线。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，将CEA基因和热休克蛋白(Hsp70L1)基因融合在一起，产生由合适的氨基酸连接臂连接的CEA-Hsp70L1的融合蛋白。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既具有肿瘤抗原CEA的免疫原性，还可以通过热休克蛋白将肿瘤抗原CEA有效地致敏树突状细胞，从而制得CEA阳性肿瘤疫苗。因此，本发明所得到的CEA-Hsp70L1融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。
定义如本文所用，术语“CEA阳性肿瘤”包括指在肿瘤细胞膜上高度表达CEA抗原的肿瘤，代表性的例子包括(但并不限于)直结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤。
如本文所用，术语“热休克蛋白”包括热休克蛋白和热休克蛋白样蛋白，代表性的例子包括(但并不限于)Hsp70、Hsp70L1(Hsp70-like protein 1)及其其他的热休克蛋白。这些热休克蛋白的序列可从Genbank数据库上获得。
以Hsp70L1(Hsp70-like protein 1)为例，它是从人外周血单核细胞来源的DCcDNA文库中通过大规模随机测序发现的一种新分子(GenBank的登录号AF143723)，生物信息学分析表明该分子有典型HSP70家族的特征，和HSP70家族成员具有较高的同源性。本发明人研究结果提示Hsp70L1具有与HSP70类似的佐剂样效应，其诱导DC产生的细胞因子，具有促使免疫反应向Th1型免疫应答偏移的特点，体内实验也表明，Hsp70L1与抗原肽交联的复合物免疫能诱导产生抗原特异性Th1型免疫应答反应。
如本文所用，术语“癌胚抗原和热休克蛋白70L1的融合蛋白”、“CEA-Hsp70L1融合蛋白”等可互换使用，都指由癌胚抗原元件的氨基酸序列和热休克蛋白70L1元件的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。
如本文所用，术语融合蛋白中“癌胚抗原元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长癌胚抗原或其免疫原性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然癌胚抗原基本上相同的生物活性。优选的癌胚抗原元件是人癌胚抗原或其免疫原性片段，更佳地是全长的人癌胚抗原(如SEQ ID NO9)或其免疫原性片段(如含576-669位的CEA氨基酸序列的片段)。
如本文所用，术语融合蛋白中“热休克蛋白70L1元件”或“Hsp70L1元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长热休克蛋白70L1或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然热休克蛋白70L1基本上相同的生物活性。优选的Hsp70L1元件是人热休克蛋白70L1，更佳地是全长的热休克蛋白70L1(如SEQ ID NO10)或其活性片段。
癌胚抗原和热休克蛋白70L1的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。然而，优选的是人的天然序列。
如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于癌胚抗原元件的氨基酸序列和热休克蛋白元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸，较佳地为3-10个氨基酸，最佳地为4-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS 1998；955929-5934；Protein Eng，2000；13(5)309-312；Protein Eng，2003；15(11)871-879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响癌胚抗原元件的氨基酸序列和Hsp70L1元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。
优选的连接肽例子包括(但并不限于)为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用SGGGGSGGGG等序列作为连接臂是合适的；为了有利于蛋白酶把CEA-Hsp70L1切割两个独立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位点(IEGR)作连接臂。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；为了有利于纯化，可把6His作为连接臂，以用金属亲和层析纯化CEA-Hsp70L1融合蛋白；上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK连接臂就是融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His。
此外，另一种优选方式是将癌胚抗原元件和热休克蛋白元件直接连接，而不含任何连接肽。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得癌胚抗原和或热休克蛋白70L1的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是家蚕细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的CEA-Hsp70L1融合蛋白既具有CEA的抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长的功能，又具有Hsp70L1的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型CEA-Hsp70L1融合蛋白、或用该融合蛋白致敏的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。对于含细胞的组合物，优选形式为液态剂型。
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或相应的树突状细胞或T细胞施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克融合蛋白/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克融合蛋白/千克体重，较佳地该剂量是约1微克-1毫克融合蛋白/千克体重；或者，通常为105-1014细胞/人/次，更佳地为106-1012细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5-Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。
综上所述，本发明的主要优点如下(1)CEA-Hsp70L1融合蛋白，既具有CEA的免疫原性，又具有Hsp70L1的免疫佐剂效应的作用，是一种具有双重优点的治疗肿瘤的新型药物，因而可以更显著地诱导出抗原特异性的T细胞免疫应答反应。
(2)本发明融合蛋白致敏DC，可使CEA特异性抗原肽得到有效的识别、加工、处理，并递呈至体内的T细胞激发更强的CEA特异性的T细胞免疫应答反应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白的表达及纯化
1.1人CEA cDNA的克隆收集CEA阳性人结肠癌细胞LS 174T(ATCC NumberCL-188)，利用细胞总RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen公司)制备细胞总RNA，利用AMV逆转录酶(Promega公司)合成第一链，以其为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，得到编码CEA的DNA片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-CACGGTACCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC-3’(SEQ ID NO1)该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译起始子和CEA的部分编码序列；3’端引物序列为5’-CTCGTCGACTATCAGAGCAACCCCAACCAG-3’(SEQ ID NO2)该引物含有Sal I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和CEA的部分编码序列。
反应参数为95℃30秒，62.5℃30秒，72℃50秒，28循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为2109bp。反应体积为50μl，引物浓度为200nM，dNTP的浓度为200μM，镁离子浓度为1.5mM。扩增产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物按常规方法与市售的pGEM-T载体(购自Promega公司)重组并转化至感受态大肠杆菌BL21，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。进行全自动DNA测序。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的CEA编码序列。重组子记为pGEM-T-CEA。
酶切鉴定结果显示，经EcoRI(位于pGEM-T多克隆位点两端)酶切鉴定，电泳结果显示，阳性克隆被切下一条约2109bp的插入片段(图1)。
1.2 CEA576-669-Hsp70L1重组表达质粒的构建以如上制备的全长质粒pGEM-T-CEA为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得CEA576-669DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-ATTGAGCTCGTGAGTGCAAACCGCAGTGACC-3’(SEQ ID NO3)。该引物含有ScaI限制性内切酶的酶切位点；3’端引物序列为5’-TATGTCGACGACTATGGAATTATTGCGGCC-3’(SEQ ID NO4)。该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点。
反应参数95℃15秒，56.5℃30秒，72℃45秒，29循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为276bp，PCR产物纯化后经SalI单酶切，然后纯化酶切产物。
同时，收集经41℃热诱导1h的HeLa细胞(ATCC NumberCCL-2)，利用细胞总RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen公司)制备细胞总RNA，利用AMV逆转录酶(Promega公司)合成第一链，以其为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，得到编码Hsp70L1的DNA片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-CTCGTCGACGCGGCCATCGGAGTTCACCTG-3’(SEQ ID NO5)该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点；3’端引物序列为5’-GGGGTACCAGATGCTATCTCAATAGAGATTGCT-3’(SEQ ID NO6)该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点。
反应参数95℃15秒，53℃30秒，72℃40秒，29循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为1527bp，PCR产物纯化后经SalI单酶切，酶切产物使用试剂盒进行纯化。
将CEA576-669与Hsp70L1的酶切纯化产物在T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)的作用下16℃水浴过夜连接，所得的连接产物1∶500稀释后作为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，得到编码CEA576-669-Hsp70L1的DNA片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-ATTGAGCTCGTGAGTGCAAACCGCAGTGACC-3’(SEQ ID NO7)该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点；3’端引物序列为5’-GGGGTACCAGATGCTATCTCAATAGAGATTGCT-3’(SEQ ID NO8)该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点。
反应参数为95℃30秒，64.9℃30秒，72℃45秒，30循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为1830bp。将获得的PCR产物纯化后经ScaI-KpnI酶切再与质粒pQE30(购自Qiagen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌宿主菌M15(pREP4)(购自Qiagen公司)，挑取阳性克隆，经ScaI-KpnI酶切鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的CEA576-669-Hsp70L1编码序列，插入位置与读框也全部正确。重组子记为pQE30-CEA576-669-Hsp70L1。
酶切鉴定结果显示，经ScaI-KpnI酶切鉴定，电泳结果显示，阳性克隆被切下一条约1830bp的插入片段(图2)。其中CEA576-669和Hsp70L1氨基酸序列分别如SEQ ID NO9和10所示。
1.3重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白的表达及纯化挑取转化有pQE30-CEA576-669-Hsp70L1质粒的M15(pREP4)菌的单一克隆，接种至含50μg/ml氨卞青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB，37℃摇床过夜生长，按1∶100接种至含氨卞青霉素和卡那霉素的2YT培养基中，37℃摇床生长到OD600为1左右，加IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4小时，离心收获菌体行SDS-PAGE电泳，观察重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白的表达情况。
SDS-PAGE电泳结果显示，1mM IPTG诱导4小时后pQE30-CEA576-669-Hsp70L1质粒的M15(pREP4)菌中可观察到一条明显的重组蛋白表达带，分子量约为65kD，与预测的His-CEA576-669-Hsp70L1目的蛋白的分子量相近。而经IPTG诱导的载体pQE30质粒转化的M15菌中没有这一蛋白条带(图3)。
将超声后离心所得的包涵体用包涵体洗涤液A(2M尿素，0.1％TritonX-100)充分洗涤，然后再经洗涤液B(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，pH8.0)洗涤1-2次。洗涤后的包涵体用BufferA(100mM NaH2PO4，10mM Tris.Cl，8M尿素，pH8.0)充分溶解，调整蛋白浓度至约5mg/ml，过滤。
结果显示，表达CEA576-669-Hsp70L1重组蛋白主要存在于包涵体中(图4)。
先将HSP70L1单克隆抗体(用常规方法表达HSP70L1，然后制备获得的单克隆抗体)与CNBr活化的Sepharose 4B交联制成亲和层析柱，将上述已过滤的蛋白样品以pH7.2，0.15M PBS透析过夜，，上样于经pH7.2，0.150.15M PBS平衡的亲和层析柱，流速0.5ml/分，然后用大量PBS流洗至流出液OD2800.02，再用pH2.4，0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脱，洗脱液立即转至pH7.2，0.15MPBS中透析过夜。经过HSP70L1单克隆抗体亲和层析初步纯化的目的蛋白，通过透析降低离子强度后，进一步上DEAE层析柱，用20-500mM NaCl梯度得到纯化的目的蛋白，并通过透析的方法最后溶于PBS，保存于-80℃待用。
结果显示，包涵体经过充分洗涤，变性，经HSP70L1单克隆抗体亲和层析，洗脱后用DEAE层析进一步纯化，经SDS-PAGE分析发现重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白出现在P1峰，P0及P2峰的蛋白为杂质蛋白(图5)。
1.4纯化的重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白的鉴定通过行SDS-PAGE慢速银染得到CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白凝胶，DTS扫描仪扫描蛋白凝胶，ImageMster软件对融合蛋白进行纯度和分子量的计算。
按说明书操作用鲎试剂盒检测重组CEA576-669-Hsp70L1蛋白的内毒素含量。使用无LPS的注射用水稀释样品，LPS标准作为参照。
采用Lowery法测定蛋白质浓度蛋白定量标准和待测定蛋白分别用蒸馏水稀释到0.5ml，加入2.5ml新鲜配制的碱性铜溶液(25ml4％碳酸钠，25ml0.2M氢氧化钠，0.04M硫酸铜和0.5ml2％酒石酸钾用前混匀)，摇匀，置于室温10分钟；加入酚试剂0.25ml，摇匀置于室温30分钟，650nm比色。根据各管的吸光度值和标准曲线计算样品的蛋白浓度。
结果显示，纯化的重组CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白经SDS-PAGE电泳，慢速银染，显示单一的蛋白条带，分子量约65KD，凝胶扫描分析，纯化的重组CEA576- 669-Hsp70L1融合蛋白纯度＞95％。内毒素含量小于0.1EU/μg。测定蛋白浓度为0.45mg/ml(图6)。
实施例2 新的CEA阳性肿瘤的治疗性树突状细胞疫苗的制备2.1 DC和T淋巴细胞的分离培养取新鲜分离的结肠癌患者(CEA+，HLA-A*0201+)的外周血白细胞，通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Histopaque 1.077)(Sigma公司)密度梯度离心分离外周血单个核细胞。置37℃、5％CO2孵育2小时，贴壁的单核细胞在含人重组GM-CSF(500U/ml)(先灵宝雅公司)和人重组IL-4(10ng/ml)(Promega公司)的完全培养基中37℃、5％CO2进行培养，获得外周血单核细胞来源的DC。非贴壁细胞用5％胎牛血清的RPMI 1640培养基悬浮，过尼龙毛柱(37℃孵育1小时)，获得纯化的T淋巴细胞。
2.2 DC的致敏收集上述培养至第六天的CEA阳性结肠癌患者外周血单核细胞来源的DC，调整细胞浓度为2×105细胞/ml浓度，1ml/孔分入24孔板，分别加入10μg/ml加入CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白、对照重组CEA576-669蛋白和对照重组Hsp70L1蛋白孵育4小时后收集细胞，洗涤后悬浮在完全培养基中，用于刺激同体的T淋巴细胞。
纯化的T淋巴细胞与致敏的同体DC于37℃、5％CO2条件下共培养(T∶DC＝10∶1)，第五天加入20U/ml rhIL-2(Sigma公司)，培养7天后收集上述淋巴细胞，同样以10∶1的比例再与新鲜制备的2×105/ml蛋白致敏的同体DC共培养进行第二轮的刺激，共培养7天，并依此法进行第三轮的刺激，培养过程中每隔3天加入一次20U/ml rhIL-2，2-3天半量更换新鲜培养基。末轮刺激后的7天收集细胞，使用免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)阳性选择分选CD8+T细胞，方法严格依照厂商提供的说明书进行。
实施例3 CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏树突状细胞体外诱导CEA特异性的T淋巴细胞3.1 CTL杀伤试验采用4小时51Cr释放法检测CTL杀伤能力。用SW480细胞(CEA+，HLA-A*0201+)、LoVo细胞(CEA+，HLA-A*0201-)、T2细胞分别作为靶细胞。一部分T2细胞悬浮在200μl不含胎牛血清的RPMI1640培养基中，先与10μg/ml CAP-1(CEA605-613，YLSGANLNL，为CEA576-669中所含的一个HLA-A*0201限制性的表位)或无关肽Tyr368-376共孵育60分钟。加入200μCi51Cr(Amersham Pharmacia公司)，置37℃水浴标记90分钟，每间隔15分钟轻混匀一次，然后用培养基彻底洗去残余的51Cr，用作杀伤的靶细胞，按10∶1、5∶1、2.5∶1三个不同效靶比加入相应的制备好的效应细胞(分选出的各组CD8+T细胞)培养4小时，离心收集各孔上清，用γ计数仪检测cpm值。最大释放组各孔为单独的靶细胞加100μl 0.1％的NP40；自发释放组为单独的靶细胞加完全培养基。各组均设三个复孔。
杀伤率(％)＝(实验组cpm-自发释放组cpm)/(最大释放组cpm-自发释放组cpm)×100。
结果如图7所示。在图7A中，CEA576-669-Hsp70L1组的效应细胞显示了对SW480细胞的杀伤活性，而且杀伤能力显著高于CEA576-669组(P＜0.05)，而对照组Hsp70L1组的效应细胞未显示显著的杀伤活性(P＜0.05)。对LoVo细胞(图7B)，CEA576-669-Hsp70L1组及CEA576-669组的效应细胞均无明显的杀伤效应，表明以上两组的效应细胞对靶细胞的杀伤是HLA-A*0201限制性的，而对表面递呈非HLA-A*0201限制性抗原表位的靶细胞无杀伤作用。对于负载CAP-1(CEA605-613，YLSGANLNL)的T2细胞，结果(图7C)显示其可被CEA576-669-Hsp70L1组及CEA576-669组的效应细胞杀伤，而且前者的杀伤效应显著高于后者(P＜0.05)，而Hsp70L1对照组的效应细胞没有显著杀伤活性(P＜0.05)。图7D显示所有实验组的效应细胞均不能杀伤本身不表达CEA抗原但表达HLA-A*0201分子的T2细胞。对于将结合有无关肽Tyr368-376的T2细胞，结果发现所有实验组的效应细胞对其均未显示显著的杀伤活性(图7E)，表明效应细胞的杀伤活性只针对CEA抗原。该结果证明CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的肿瘤患者外周血单个核细胞来源的DC体外诱导出了HLA-A*0201限制性的CEA特异性的CTL。
3.2人IFN-γELISPOT的检测经免疫磁珠分选出的CD8+T细胞作为反应细胞，直接转入包被有抗IFN-γ抗体的ELISPOT检测板。SW480(CEA+，HLA-A*0201+)；LoVo(CEA+，HLA-A*0201-)；T2cells三种细胞用4000rad钴60照射去增殖后作为刺激细胞，一部分T2 cells结合CAP-1抗原肽或无关肽Tyr368-376。将刺激细胞分别加入已含有反应细胞的检测孔中。参照IFN-γELISPOT检测试剂盒说明书的方法检测分泌IFN-γ的T细胞集落。以上每一检测均设3个复孔。
结果显示，对于CEA576-669-Hsp70L1致敏的DC所诱导出的T细胞，当刺激细胞为SW480(CEA+，HLA-A*0201+)或负载有CAP-1的T2(CEA+，HLA-A*0201+)细胞时，分泌IFN-γ的细胞的数量显著高于刺激细胞为LoVo(CEA+，HLA-A*0201-)或未负载抗原肽的T2细胞的组(P＜0.05)，SW480和负载有CAP-1的T2细胞对于反应细胞的刺激结果没有明显差异(P＞0.05)；CEA576-669致敏的DC所诱导出的T细胞经SW480或负载CAP-1的T2细胞的刺激后分泌IFN-γ的细胞数量明显低于CEA576- 669-Hsp70L1致敏的DC所诱导出的T细胞组(P＜0.05)；对于Hsp70L1组，几种刺激细胞的诱导均未能观察到分泌IFN-γ的T细胞数量的显著增加；当刺激细胞为负载有无关抗原肽Tyr368-376的T2细胞时，所有实验组的反应细胞均未显示释放IFN-γ的T细胞频数增加。该结果表明经CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的DC所诱导出的T细胞是CEA抗原特异性的，且具有HLA-A*0201限制性(图8)。
实施例4 CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的DC体内诱导抗原特异性抗肿瘤效应4.1小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)分离
颈椎脱位法处死HLA-A*0201/Kb转基因小鼠(The Jackson Laboratory)，无菌取股骨，无血清培养基冲洗出骨髓细胞，溶除红细胞，加入抗Ia、B220、CD4、CD8单抗(终浓度均为10μg/ml)及补体(10∶1稀释)，37℃水浴45分钟溶除T、B及Ia+细胞，随后加10ng/ml mGM-CSF(Promega公司)、1ng/ml mIL-4(Promega公司)培养3天后，贴壁细胞重新加入新鲜完全培养基及mGM-CSF、mIL-4继续培养3天后，吹打收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体置新瓶培养，3天后收集悬浮细胞即为富集的BMDC。
4.2蛋白体外致敏BMDC上述培养至第六天的小鼠DC，分别加入10μg/ml CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白、对照重组CEA576-669蛋白和对照重组Hsp70L1蛋白，并设置未刺激的DC作为空白对照组，孵育4小时后收集细胞，用于免疫小鼠。
4.3 HLA-A*0201/Kb转基因小鼠的免疫以蛋白体外致敏的HLA-A*0201/Kb转基因小鼠的BMDC对同系小鼠进行免疫。每只小鼠后腿皮下注射1×106经10μg/ml蛋白致敏的同系小鼠的BMDC或未未经任何因素致敏的同系小鼠的BMDC。每只小鼠共免疫三次，间隔一周。
4.4免疫小鼠脾细胞的制备以及IL-2ELISA、IFN-γ ELISPOT检测末次免疫7天后，无菌操作摘取小鼠脾脏，溶除红细胞，制成单细胞悬液。一部分以CEA576-669，CAP-1 peptide，Con A，无关肽Tyr368-376或PBS再刺激24小时，收集细胞上清用于ELISA检测上清中IL-2的水平，以及细胞用于ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾细胞集落。以上每一检测均设3个复孔。
结果显示，CEA576-669-Hsp70L1组IL-2水平和IFN-γ分泌细胞的数量显著高于CEA576-669组(P＜0.05)；同时Hsp70L1组小鼠脾细胞分泌IL-2的水平和IFN-γ分泌细胞的数量未见升高，无关的抗原肽Tyr368-376对各免疫组的小鼠脾细胞的刺激均不能显著诱导产生IL-2和IFN-γ(图9和图10)。
4.5 CTL杀伤试验以上每组免疫小鼠的脾细胞加入5μg/ml的重组CEA576-669蛋白作为抗原进行再刺激，补加25U/ml IL-2，培养7-9天，用作CTL测试其杀伤靶细胞的能力。靶细胞同实施例6。51Cr释放法检测CTL杀伤能力同实施例6。
结果如图11所示。来自CEA576-669-Hsp70L1组及CEA576-669组的效应细胞显示了对SW480细胞的显著杀伤(图11A)，而且CEA576-669-Hsp70L1组的效应细胞杀伤SW480的能力明显高于CEA576-669组(P＜0.05)，而另两个对照组包括Hsp70L1组、未致敏的DC免疫组的效应细胞对靶细胞SW480没有明显杀伤活性。对于负载CAP-1的T2细胞，结果(图11B)发现CEA576-669-Hsp70L1组及组的效应细胞对CAP-1致敏的T2细胞具有杀伤活性，而且前者的杀伤效应明显高于后者(P＜0.05)，而另两个对照组包括Hsp70L1组、未致敏DC免疫组的效应细胞对负载CAP-1的T2细胞没有明显杀伤活性。对于LoVo细胞，结果(图11C)显示CEA576-669-Hsp70L1组及单独的CEA576-669组的效应细胞对LoVo细胞均无明显的杀伤效应，表明以上两免疫组的效应细胞对靶细胞的杀伤是HLA-A*0201限制性的，而对表面递呈非HLA-A*0201限制性抗原表位的靶细胞无杀伤作用。图11D显示，所有实验组的效应细胞均不能杀伤T2细胞。对于结合有无关肽Tyr368-376的T2细胞，结果(图11E)显示所有实验组的效应细胞对其也均未显示显著的杀伤活性，表明效应细胞的杀伤活性只针对CEA抗原，说明CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的DC免疫HLA-A*0201/Kb转基因小鼠诱导其产生了CEA特异性的CTL(图11)。
4.6裸鼠荷瘤及过继回输治疗效果的观察6-8周龄的雌性裸鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，右侧腹部皮下一点接种体外培养扩增的SW480肿瘤细胞。三天后进行过继回输治疗。分组同实施例6中免疫HLA-A*0201/Kb转基因小鼠，另外设置单独腹腔注射IL-2的对照组。如前述经体外抗原再刺激7-9天后的免疫小鼠的脾细胞收集后尾静脉回输至荷瘤裸鼠体内，回输后第二天腹腔注射IL-22000U，以后隔天同样方法注射同样剂量的IL-2，第一次回输后7天进行第二次回输，方法相同。接种肿瘤细胞后每隔两天观察肿瘤出现及生长情况。记录各鼠肿瘤出现的时间，测量肿瘤的直径，观察各组小鼠的存活情况。
结果显示，CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏的DC免疫的HLA-A*0201/Kb转基因小鼠的脾细胞过继回输至负荷SW480肿瘤的裸鼠，可以显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长，而且提高了小鼠的存活率。如图12，回输CEA576-669-Hsp70L1组小鼠脾细胞的裸鼠，肿瘤出现时间明显晚于其它几个对照组(P＜0.05)。观察至第27天时，此组中出现肿瘤生长的小鼠的肿瘤平均直径明显的低于各个对照组小鼠的肿瘤平均直径(P＜0.05)。由图13可见，几个对照组裸鼠在荷瘤第27天至第44天之间全部死亡，而在第44天过继回输CEA576-669-Hsp70L1组小鼠脾细胞的裸鼠存活率为62.5％，观察至第60天此组中小鼠的存活率仍为37.5％，且存活的小鼠体内均未观察到有肿瘤生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>癌胚抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用<130>045430<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cacggtacca ccatggagtc tccctcggcc cc32<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>8ggggtaccag atgctatctc aatagagatt gct 33<210>9<211>93<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>9Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly1 5 10 15Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly20 25 30Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln35 40 45Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu50 55 60Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe65 70 75 80Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val85 90<210>10<211>508<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Ala Ala Ile Gly Val His Leu Gly Cys Thr Ser Ala Cys Glu Ala Val1 5 10 15Tyr Lys Asp Gly Arg Ala Gly Val Val Ala Asn Asp Ala Gly Asp Arg20 25 30Val Thr Pro Ala Val Val Ala Tyr Ser Glu Asn Glu Glu Ile Val Gly
35 40 45Leu Ala Ala Lys Gln Ser Arg Ile Arg Asn Ile Ser Asn Thr Val Met50 55 60Lys Val Lys Gln Ile Leu Gly Arg Ser Ser Ser Asp Pro Gln Ala Gln65 70 75 80Lys Tyr Ile Ala Glu Ser Lys Cys Leu Val Ile Glu Lys Asn Gly Lys85 90 95Leu Arg Tyr Glu Ile Asp Thr Gly Glu Glu Thr Lys Phe Val Asn Pro100 105 110Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Phe Ser Lys Met Lys Glu Thr Ala His115 120 125Ser Val Leu Gly Ser Asp Ala Asn Asp Val Val Ile Thr Val Pro Phe130 135 140Asp Phe Gly Glu Lys Gln Lys Asn Ala Leu Gly Glu Ala Ala Arg Ala145 150 155 160Ala Gly Phe Asn Val Leu Arg Leu Ile His Glu Pro Ser Ala Ala Leu165 170 175Leu Ala Tyr Gly Ile Gly Gln Asp Ser Pro Thr Gly Lys Ser Asn Ile180 185 190Leu Val Phe Lys Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ser Leu Ser Val Met Glu195 200 205Val Asn Ser Gly Ile Tyr Arg Val Leu Ser Thr Asn Thr Asp Asp Asn210 215 220Ile Gly Gly Ala His Phe Thr Glu Thr Leu Ala Gln Tyr Leu Ala Ser225 230 235 240Glu Phe Gln Arg Ser Phe Lys His Asp Val Arg Gly Asn Ala Arg Ala245 250 255Met Met Lys Leu Thr Asn Ser Ala Glu Val Ala Lys His Ser Leu Ser260 265 270Thr Leu Gly Ser Ala Asn Cys Phe Leu Asp Ser Leu Tyr Glu Gly Gln275 280 285Asp Phe Asp Cys Asn Val Ser Arg Ala Arg Phe Glu Leu Leu Cys Ser290 295 300
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1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括(a)癌胚抗原元件，该元件具有人癌胚抗原或其免疫原性片段的氨基酸序列；(b)热休克蛋白元件，该元件具有人热休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)位于癌胚抗原元件和热休克蛋白70L1元件之间的0-20个氨基酸的连接肽序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的癌胚抗原元件选自下组全长的癌胚抗原、含癌胚抗原的第576-669位的片段；所述的热休克蛋白元件选自下组Hsp70或Hsp70L1。而且，所述的接头肽序列含4-10个氨基酸。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的癌胚抗原元件具有SEQ ID NO9所示的氨基酸序列，所述的热休克蛋白元件具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
4.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
8.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗CEA阳性肿瘤的治疗性疫苗药物。
9.一种树突状细胞，其特征在于，它是用权利要求1所述的融合蛋白致敏过的树突状细胞。
10.一种CEA阳性肿瘤治疗性疫苗，其特征在于，它含有安全有效量权利要求9所述的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞或权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了人癌胚抗原与热休克蛋白70L1的融合蛋白(CEA－Hsp70L1融合蛋白)，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及含该融合蛋白的组合物。本发明还提供了一种CEA阳性肿瘤的治疗性疫苗的制备方法及用途，该疫苗是用该融合蛋白致敏的树突状细胞，体内应用可以有效激发CEA抗原特异性的免疫应答，有效地应用于CEA阳性肿瘤包括直结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤的防治。
文档编号A61K39/00GK1727362SQ20041005331
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月30日 优先权日2004年7月30日
发明者万涛, 吴艳峰, 周向阳, 李楠, 陈国友, 曹雪涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学