羊水分析方法和装置的制作方法

专利名称：羊水分析方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及确定胎儿健康状况或胎儿健康状况风险的方法和装置。本发明还涉及监测母亲健康状况的方法和装置。本发明进一步涉及通过分析羊水来确定一个或多个生物标志物的方法和装置。
背景技术：
评估胎儿出生体重是胎儿出生前护理的一个重要部分。所以在分娩前尽早准确测定胎儿体重能显著改善围产期结果。因此也就需要一种快速简便的方法来预测子宫内胎儿、尤其是可能出现以下极端情况之一的婴儿体重(1)巨大胎儿(macrocosmia)(又称大于胎龄或LGA)或(2)小于胎龄(SGA)或宫内发育迟缓(IUGR)。
目前，预测婴儿出生体重的最可靠的手段是超声波检查，根据最近的一篇综述文章，用超声波检查方法预测的出生体重能达到300-400克以内(表12，Nahum eMedicine杂志)，不过文章作者引证说，超声波检查及其他技术的精确度仍然较差，他们建议说，在来源不同的临床和超声波记录信息基础上，使用多种预测手段来预测胎儿体重仍是合理之举。另外，他们还指出，即使使用超声波也不容易预测出巨大胎儿。用超声波检查和临床触诊法预测巨大胎儿的灵敏度小于60％，阳性结果错误率远超过40％。同样利用超声波预测体重小于1800克的小胎儿，其错误率常达25％之多。超声波检查的缺点在于该方法复杂，具有劳动密集型特点，而且经常受胎儿器官可视性不佳的制约。另外该方法还需要配备昂贵的仪器和训练有素的操作人员。正是由于缺乏后一必备要件，所以现代技术常在发展中国家难以推广应用。
2004年4月29日公开的专利国际申请WO2004/036359中披露，将胎儿超声波检查和胎儿母亲的信息结合起来确定胎儿出生体重。
目前美国和加拿大指南均推荐所有孕妇应在怀孕24-28周时作妊娠糖尿病(GDM)筛查。只有孕妇存在年龄较大、孕前体重较重、糖尿病高危种族成员或有明显糖尿病家族史等危险因素，或者存在之前曾诊断有GDM或分娩过巨大婴儿的情形时，才进行早期筛查。但是一些研究承认基于这些标准进行选择性筛查仍可能发生GDM漏诊情况。
目前GDM的筛查和诊断标准是以口服葡萄糖耐受试验(OGTT)异常和伴随出现的妊娠高血糖症的观察结果为根据，而这种异常会增加围产期和大人的发病率和死亡率。一种论辩认为，穿过胎盘的葡萄糖流量增加是刺激子宫内分化的胰岛细胞分泌胰岛素的因素，是出现胎儿高胰岛素血症、继而导致胎儿腹围增加、巨大胎儿、肥胖和新生儿高血糖症以及诊断GDM的前提。

发明内容
根据本发明的一个主要方面，在不破坏羊膜囊情况下，对羊水进行原位分析。
根据本发明的另一主要方面，在不改变羊水成分情况下，对羊水进行分析以查明羊水基质的浓度和/或其他成分的相关信息。
根据本发明的又一主要方面，羊水的分析结果与母亲和其后代中至少之一的健康状况风险相关。
根据本发明的再一主要方面，怀孕期间尽早预测胎儿出生体重，或者提高预测精确度，会使根据羊水分析结果获得的出生体重预测值更为理想。
本发明提供一种分析羊水的方法，在该方法中，配备有用于测定羊水中一个或多个生物标志物的仪器，将仪器对准羊膜囊进行羊水原位测定，无需向羊膜囊插入任何器械。用该仪器获取测定数据，数据经处理后得到对应羊水中一个或多个所选生物标志物的数值。
本发明提供一种对孕妇患者羊膜囊中所含羊水进行原位分析、无需向羊膜囊内插入任何器械的装置。该装置包括用于测定羊水内一个或多个所选生物标志物的仪器、适于将该仪器对准羊膜囊进行羊水原位测定而无需向羊膜囊内插入任何器械的连接器，以及用于处理来自该仪器的测定数据以得到对应羊水内一个或多个所选生物标志物的数值的处理单元。
本发明提供一种治疗怀孕母亲和其胎儿中至少之一的方法，该方法包括提供用于测定羊水内一个或多个所选生物标志物的仪器，将该仪器对准羊膜囊进行羊水原位测定而无需向羊膜囊内插入任何器械，使用该仪器获得测定数据，处理该测定数据后得到对应一个或多个所选生物标志物的数值，以及根据该数值来决定是否采取饮食干预和药物干预中至少一项措施。
本发明提供一种预测母亲和其后代中至少之一的健康状况风险的方法，该方法包括提供用于分析母亲羊水的仪器，使用该仪器获得羊水的分析数据，以及处理该分析数据后得到患病风险的预测值。
本发明提供一种预测母亲和其后代中至少之一的健康状况风险的装置，该装置包括羊水分析仪器和处理该仪器获得的分析数据以得到风险预测值的处理单元。
本发明可以应用于任何具有羊膜囊、允许靠近其羊水进行分析的动物，尤其是本发明可应用于人。除非另外明确指明，本文术语“患者”、“母亲”、“后代”、“胎儿”和其他涉及目标对象和其身体部分的类似术语均与人和人以外的动物有关。
本说明书和权利要求书中，术语“健康状况”指的是或可能是与母亲、胎儿或后代健康有关的状况。如后代出生时的体重、即出生体重，小于胎龄(SGA)或宫内发育迟缓(IUGR)、适于胎龄(AGA)或健康，以及大于胎龄(LGA)或巨大胎儿等胎儿体重。一般认为体重异常是各种健康并发症的起因。“健康状况”还包括不存在健康问题的情况，如AGA，这一信息可让孕妇安心，保持心情愉悦。再例如，母亲患有糖尿病，又称为母亲糖尿病(maternal diabete)，再具体一点称为妊娠糖尿病(GDM)。又例如早产。
本说明书和权利要求书中，术语“生物标志物”包括一个或多个如葡萄糖、乳酸盐或其他代谢酸等生化指标，一个或多个包括但不限于胰岛素、胰岛素样生长因子(IGFs)及其结合蛋白的蛋白质，和/或一个或多个脂肪酸。生物标志物还可包括能在羊水内鉴定和计数的细胞以及羊水的其他物理特性，如无论体外还是原位都能测定的粘滞度。


通过以下几个实施例的详细说明并参照附图，可以更好地理解本发明。
图1a是使用NIR拉曼Raman)光谱测量系统测定对应出生体重在1-5.3kg大范围的羊水得到的用于预测出生体重的典型光谱和波长区。
图1b是针对出生体重在1-5.3kg大范围内的样本人群所作的预测出生体重和实际出生体重之间的适配关系图。
图1c是使用NIR拉曼光谱测量系统测定对应出生体重在1-3.5kg低范围的羊水得到的用于预测出生体重的典型光谱和波长区。
图1d是针对出生体重在1-3.5kg低范围的样本人群所作的预测出生体重和实际出生体重之间的适配关系图。
图1e是使用NIR拉曼光谱测量系统测定对应出生体重在3.5-5.3kg高范围的羊水得到的用于预测出生体重的典型光谱和波长区。
图1f是针对出生体重在3.5-5.3kg高范围的样本人群所作的预测出生体重和实际出生体重之间的适配关系图。
图2是在NIR或IR范围操作的阴道内光学拉曼光谱仪。
图3是图2实施例中装置的方框图。
图4是使用光学吸收光谱仪的腹部探测器的示意图。
图5是图4实施例中装置的方框图。
图6是妊娠糖尿病GDM)发生作为羊水葡萄糖水平(X轴)和胰岛素(Y轴)的函数的概率等值线图。
图7是妊娠糖尿病GDM)发生作为羊水葡萄糖水平(X轴)和宫内生长因子结合蛋白1或IGF-BP1(Y轴)的函数的概率等值线图。
图8是表示第五个实施例中GDM治疗方法的流程图。
具体实施例方式
第一实施例——体外羊水的NIR拉曼光谱分析及其与人出生体重的关系本发明的一个实施例主要是使用拉曼光谱分析法鉴定一组可预测婴儿出生体重的羊水生化标志物。我们的方法的优点是(1)该方法只需要一份少量(μl)羊水样品，即可同时测定所有重要的生化成分，从而能很重要地保持羊水流体基质内这些化学成分的化学特性，而羊水流体基质是胎儿健康的重要晴雨表，因为羊水过少(oligiohydramniois)或羊水过多(polyhydramniois)都会威胁胎儿健康。该方法克服了其他化学技术需要分开分析各成分的局限性，因为如果要考虑使用量的话，这些技术不仅受浓度差异影响，而且由于尚未研发出少量成分化验技术，所以无法测定装在新的储存容器内的成分。不过更重要的是，在早期孕15周测定时，我们利用拉曼光谱分析法得到的最终出生体重能精确到100-400克以内。所以本方法率先提供了早期宫内SGA和LGA诊断的医学可能性。而且该方法可以在常规羊膜穿刺术检查时一并操作，无需另外对样品进行劳动密集的化学处理。本实施例的方法无论在医院、门诊还是野外都很容易操作，只需配置两台经过改进的仪器(1)一台仪器需要使用一只小型便携式光谱仪，在收集用以即刻床边处理的“新鲜样品”时对羊水滴进行检测，(2)另一台是改进后的阴道内或腹腔纤维光学探测器，该仪器在整个怀孕期间不侵入使用，从而首次提供了一种收集系列测定结果并监测宫内胎儿生长发育的装置。本实施例方法的可行性使更普遍使用羊水进行胎儿常规监测变得有可能并且能够负担得起，而且精确度远超过现有技术。
本申请人已鉴定出几种适合测定的羊水成分，它们包括但不限于葡萄糖、包括但不限于胰岛素和两种IGF结合蛋白(即IGF BP 1和3)的蛋白家族、几种氨基酸和两种代谢酸(乳酸和尿酸)。适合测定的其他成分包括NO和几种脂肪酸，其中包括只在高度氢化的食品中发现并且实际上可能限制胎儿利用生长所需基本脂肪酸的反脂肪酸。
羊水NIR拉曼光谱分析抽取孕14-16周妇女的羊水进行测定。所有患者都签署了McGill大学知情同意书。进行遗传检验后，将剩余的羊水样品冷冻保存。使用Bruker傅立叶变换近红外拉曼光谱仪得到近红外拉曼光谱。从冰箱中取出羊水样品，加热到20℃。然后把样品转到2mm直径的玻璃管中，置于拉曼系统内。整个实验期间，拉曼系统温度维持在20+/-1℃。用1064nm Nd:YAG激光照射羊水样品。用FT-光谱仪收集样品产生的拉曼位移散射，并用冷却的NIR检测器检测。在1/秒扫描光谱，从0-3750cm-1产生8cm-1位移分辨率。每份样品平均扫描共1800次。未处理的干涉图经过傅立叶变换后，数据存储为1919个数据点，跨越0-3750cm-1光谱范围。
数据处理对羊水拉曼光谱进行预处理，降低激光强度变化的影响。特别是使各光谱在2500cm-1处的Si-OH拉曼发射正常。同样，按平均移动15点的方脉冲光滑函数平滑光谱，减少测定中出现的假噪声。
哈尔变换(Haar transform)哈尔变换(HT)是最早的小波分析形式。它将一个给定信号分解成一组正交基函数。时间窗0＜τ＜1中的数据是根据一个父小波(Φ(τ))、一个母小波(ψ(τ))和一系列女儿小波(daughterwavelets)ψn，k(τ)来进行分解，其中n和k分别决定缩放比例和平移。
ψn，k(τ)＝ψ(2nτ-k)，0≤k≤2n-1(3)同样，各女儿小波可以分解为两个对应缩放比例和平移相关性正加权和负加权的儿子小波之和Φnk(τ)。有趣的是，所有女儿小波都可分解为儿子小波之和，即父小波经压缩及位移后的小波，如ψ＝Φ1，0-Φ1，1。所以哈尔变换可以用仅由0和1组成的基组通过光谱过滤的实验完成。要确定小波系数，适宜用矩阵表示小波。例如，父小波、母小波和第一代女儿小波可用A2表示 其中，当把时间窗分成4等分时，每一列对应一个小波，每一行代表哈尔小波值。这样将4个波数相等区域的拉曼信号分解成小波系数的过程就简化成以下矩阵数学问题必须先算出系数向量，而后乘以A2得到拉曼光谱轮廓。在算出的向量中，小波系数将从最小分辨率小波(父小波)开始按光谱分辨率从低到高顺序排列。矩阵A2可以展开，进一步包括女儿小波或儿子小波一代，从而将这种分析扩展到更高频率级。
关于哈尔变换的更多信息可参见A.Graps，″An Introductionto Wavelets，″IEEE Comput.Sci.Eng.2，50-61(1995)，E.Aboufadel和S.Schlicker，Discovering Wavelets(John Wiley &Sons Inc.，NY，1999)，以及J.S.Walker，A Primer on Waveletsand their Scientific Applications(Chapman & Hall，Boca Raton，1999)。
计算用FTNIR拉曼仪器在实验中收集的哈尔分布系数是数据分析中的第一步骤。使用Matlab(MathWorks公司，Natick，MA)编写的反复求和与求差的客户程序执行儿子小波哈尔变换运算。该运算要求数据输入长度为2的幂。最后获得最大值1024个哈尔儿子小波的系数，按光谱分辨率从低到高顺序排列。
逐步多元线性回归可以使用逆最小二乘回归法从预处理的拉曼光谱中预测给定样品的外部参数。但是有可能不需要所有的1024个小波，因为哈尔变换只是将信号稀疏地表示出来。逐步多元线性算法是选择与目标量最相关的变量子集的既成方法。遗传算法的总目标是确定能根据等式5最佳描述给定数据集的小波组合Y＝α0+α1X1+α2X2+…+αnXn(5)其中，Y是因变量(出生体重)，X1、X2、…、Xn是自变量(即小波系数)，以及α0、α1、…、αn是根据逆最小二乘回归法从X集合中确定的系数。能最佳预测Y的小波组合根据以下方案确定1.设定逐步法(Stepwise)所使用的HT系数范围；2.选择模型中要包括的小波数量；3.评价各模型的适配度；
4.增加模型中包括的小波数量，重复步骤2-4；5.选择最佳的变量数目；6.使用独立数据集对模型进行评价；7.改变逐步法使用的HT系数范围，重复步骤1-6。
1.设定逐步多元线性回归法(STEPMLR)使用的HT系数范围STEPMLR法的目标是确定与出生体重相关的小子集小波。同样，考虑到开发出的与胎儿发育有关以及供将来简化仪器使用的光谱组成鉴定法，低分辨率(大波长范围)组成为宜。所以除使用逐步法从所有哈尔儿子小波中选择能进行最佳预测的小波之外，还使用仅比512、256、128、64和32个小波的光谱分辨率低的小波来进行运算。
2.选择模型中要包括的小波数量从1个小波开始，即等式5中1个X，然后逐渐增加。根据逐步选择法所适用的小波系数数量设定最大小波数。所有情况下，要使用的最大小波数设定为10。
3.计算每个个体的适配度对于各人群模型来说，等式5中α1-αn系数是通过逆最小二乘回归法使用样品制备所确定的吸收或散射值已知的校正集计算得到。将确定的αn参数和检测集的哈尔系数代到等式5中得到出生体重的预测值，同时计算校正标准误差(SEC)。这样SEC越小，模型就越好。
4.增加模型中包括的小波数量，重复步骤2-4在步骤2中选择小波数量的最大值。
5.选择变量最佳数目
根据模型中SEC与小波数量比值绘出预测误差平方和(PRESS)图。让h指定具有PRESS最小值模型中的小波数量。基于95％置信度的胎儿检测，让所选用模型的小波数最少，这样该模型的PRESS就不会明显大于具有h小波数模型的PRESS34。
6.使用独立数据集评价模型通过具有根据校正集得到的校正系数的独立数据集(验证集)预测的出生体重值来评价理想的模型。用R2和变量系数(C.V.)作为模型有效性的指示参数。
结果进行三次校正，用以从羊水拉曼光谱中预测出生体重。首先，使用与所有样品相关的光谱来预测出生体重。结果如图1b所示。得到所有样品中500克以内出生体重的预测值。若将样品进一步细分成小于3500克和大于3500克组，则结果明显改观。这两组校订结果如图1d和1f所示。可以看到，每组误差约为200克的预测值中只出现了1个孤立点。这一结果明显优于现有方法。
第二和第三实施例——包括光学光谱仪的原位探测仪在第二实施例中，怀孕期间在常规超声波检查(2-5次)时采用阴道内光谱测定方法。早期测定能给治疗或营养干预提供机会。但是，宫颈组织的厚度(约4mm)会降低早期妊娠检测的灵敏度。相反，由于怀孕期间子宫逐渐变薄，所以将阴道内检测时间推后，宫颈组织干扰会小一些，不过医疗干预的机会则相应减少。我们知道，利用羊膜囊的超声波图像可以确定或指引探测器的定位，使羊水检测时不受胎儿干涉。如果需要的话，还可以将光学光谱仪整合到超声波阴道内探测器中。
光谱区对通过原位测定来预测出生体重、尤其是预测IUGR和巨大婴儿非常关键，由于受干扰组织、温度和AMF pH影响，该光谱区与上述体外冷冻样品获得的光谱区可能会稍有不同。将妊娠不同时间点建立的特定回归模型与超声波“金”标准测定结果进行比较。
使用阴道内NIR测定法可以找出拉曼光谱与出生体重间的回归关系。同样，还可以测定NIR或IR范围内的光谱衰减，然后建立与体重预测及本发明提到的其他健康状况预测之间的关联。用拉曼散射测定法分析羊水能得到令人满意的分析信息，但是在进行原位测定以及进行拉曼测定法难以完成的羊水深度测定时，光学衰减或吸收测定法可能会更有效一些。
如图2所示，探测器有一个带光源和光学检测器的尖端。在本优选实施例中，光纤将远端光源和检测器间的光线传递到尖端，不过，也可以将合适的电源和检测器整合到探测器尖端。
如图3所示，控制光源和检测器的光学探测器可操作地连接在光谱分析仪上用以获得需要的光谱信息。如上所述，该分析仪是拉曼散射分析仪。光谱数据由基于指明光谱信息与健康状况风险值之间相关性的校正数据来计算健康状况风险值的相关器最终获得。应当知道，可以继续或者根据需要利用该相关性来确定羊水中生化标志物或其他成分的浓度。
如图4和5所示，在第三实施例中，适用的探测器有一个带光源和两个光学检测器的非侵入式尖端。如图所示，第一检测器“察看”通过邻近组织与深层组织间组织的明显不同的路径，而第二检测器“察看”差异不大的路径。这两个检测器测定的光强数据之差便可产生深层组织即羊水的相关信息。使探测器与患者的腹部保持光接触。阴道内探测器也可使用图4所示仪器，不过要测定的组织或羊水没有那么深，则第一和第二检测器之间的间距也就不必那么大。
再具体点来说，对于适于阴道内测定的NIR拉曼系统，OceanOptics公司生产的市售NIR拉曼系统可用于羊水测定。该系统所用激光可以是785nm低功率激光(50mW)。与第一实施例中使用的1064nm激光相比，选用低波长比较理想，因为散射与λ-4成比例关系，能使低光功率用于非侵入式、原位测定。同样，这种近红外区很容易穿透要测定的宫颈组织。拉曼光谱仪的检测器是一个高度灵敏致冷CCD检测器，便携而且耐用。我们以前的测定表明较低分辨率的拉曼光谱足以建立出生体重的回归模型。调节光谱仪入口可方便地优化原位测定要用的分辨率和信号强度。根据我们的初步测定来看，体内获得光谱估计需要大约3分钟。
利用定制的光纤束将激光激发和拉曼散射传送给患者。该光纤束包括分离的照明光纤和收集光纤，它们聚焦在组织的同一部位。我们已显示这种共焦光学排列能用于将精确的组织部位隔开供三个方向的定量测定。在照明光纤远端，设置了一个小短波通滤光片，用以去除照明光纤的不需要的散射。在收集光纤前面设置了第二长波通滤光片，用以将传送给光谱仪的拉曼位移信号分离出来。光纤束直径小于2mm。共焦光学探测器位于超声波扫描头处，仅有2×5mm大小。
光纤束与一个便宜的装有阴道内超声波扫描头(Medison A-600)的超声波成像系统连接，用以确定体内取样部位。利用阴道内探测器上的机械凹口(mechanical indent)，用特氟隆(Teflon)卡环夹住光纤，将其维持在已知的取样部位。针对患者，将避孕套套在超声波/光学探头上以提供无菌环境。使用组织模型确定获得光谱的部位。阴道内超声波图像除指引光谱测定部位外，还会提供益于光谱比较的有关子宫和膜的几何学信息。除用成分已知样品进行系统构建和校正之外，还可利用羊水中含量较多的已纯化成分的光谱作为参考光谱，从而对回归分析所用的光谱区之间进行比较。
应当理解，虽然上述阴道探头实施例是用于妇女，但是它们也适用于其它哺乳动物。
还应当理解，同样也可使用非光学分析工具来原位收集与健康状况风险相关的羊水成分信息。例如，磁共振光谱仪(MRS)能给出详细的有关化学成分的分析信息。羊水的物理参数，如用超声波能原位测出的粘滞性，也可单独使用或与其它光学或非光学分析工具结合起来使用以确定风险或测定一个或多个生物标志物。作为出生体重预测值函数变化的羊水成分据认为能影响粘滞性，从而建立粘滞性与出生体重间的关联。
对于光谱测定法来说，波长区大致在200nm-400μm之间较为适合。整个范围内都能对干燥的羊水样品进行分析，而对体外整个样品或者原位羊水进行分析的波长不会被任何干扰组织或羊水本身过度吸收。例如，水会大量吸收2μm-50μm波长的光，而且羊水中的水基本上阻止这一范围用于原位测定。
第四和第五实施例——使用反复非侵入羊水分析法监测妊娠糖尿病(GDM)我们的研究目的有四个方面(1)阐述接受常规羊膜穿刺遗传检测以及存在较大风险的高龄妇女人群中GDM的普遍性；(2)显示24-28周诊断GDM发生的妇女在进行常规羊膜穿刺术检查(12-22周)之前，羊水(AF)葡萄糖、胰岛素或胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)1含量是否已经升高；(3)使用多种回归法，确定这些羊水指标与后期GDM诊断之间是否存在相关性；以及(4)使用概率图谱来说明预示GDM风险增加的具体羊水葡萄糖、胰岛素和IGF BP 1的浓度。
设计、招募和同意从1998到2002年，凡在加拿大蒙特利尔St Mary医院中心接受常规羊膜穿刺术检查的孕妇都被建议参加这项有意义的研究。若签署知情同意书则表明允许研究人员从蒙特利尔儿童医院获取羊水进行遗传检测以及获得母亲医疗表。按照纳入标准(单胎妊娠)和排除标准(多胎、遗传异常)得到1008位受试者。医疗表上记载有GDM状况、母亲年龄、妊娠前体重和身高、民族、胎次和吸烟(n＝888-928)、25周(n＝70)和35周(n＝149)超声波预测的胎儿体重，以及婴儿出生体重、性别和孕龄(n＝928)等信息。孕龄由医师根据LMP和统一的医疗方案进行预测。各数据子集是根据医疗表上的有用信息和问卷调查来完成。道德许可书从麦吉尔大学(McGill)机构审查委员会(Institutional ReviewBoard)、蒙特利尔儿童医院和St Mary医院中心获得。
生化分析分析-80℃保存的羊水样品中的葡萄糖、胰岛素和IGF BP 1。胰岛素(n＝718)使用超灵敏分析系统分析，该系统采用地是将一个单克隆抗胰岛素结合体(即顺磁粒子包覆的抗体)和化学发光底物加到反应容器中的一步免疫酶学分析方法。测出的胰岛素在0.03-300μl pmol/L内。Abbott实验室(North Chicago，Illinois)分析试剂盒(No.6082)与酶标仪一起使用来分析葡萄糖(n＝662)，使用Diagnostics Systems Laboratories Inc(DSL试剂盒10-7800，Webster，Texas)，通过ELISA法分析IGFBP1(n＝876)。
统计分析所有数据用SAS(版本8.02，SAS公司.，Cary，NC)进行分析，统计显著性最小值设为P＜0.05。用平方根变换所有非正常分布的数据出生前体重、BMI、民族、胎次、羊膜穿刺周、吸烟、婴儿出生体重、35周胎儿体重和羊膜葡萄糖、胰岛素以及IGF-BP1。GDM和非GDM母亲之间的生化比较项目包括作为协变量的出生前体重、BMI、民族、胎次和羊膜穿刺周。使用前后回归法也可以验证用于因变量GDM和出生体重、具有模型中包括的前面已建立的预测因素的多个回归。由于羊膜葡萄糖、胰岛素和IGF-BP1之间共线性，所以每个都包括在单独的回归模型中。使用由剑桥大学IanMcNabbey开发的Matlab V6.1中的Bayesnet程序得到的高斯分布对GDM和非GDM母亲的有关数据单独建立模型。使用根据测定数据确定的高斯光束的Bayesian权重，计算根据羊水生物标志物胰岛素和葡萄糖确定GDM发生的后验概率。然后从GDM发生概率的等值线图来分别确定与AF中葡萄糖相关的IGF-BP1和胰岛素变量，如图6和7所示。
人群特征对GDM和非GDM的母亲的比较结果显示，GDM母亲较矮，孕前体重和BMIs较大。54％的GDM母亲超重或肥胖，而非GDM母亲中超重或肥胖者只占26％。在健康的非GDM母亲中，平均出生体重为3396±19克，而GDM母亲中，平均出生体重为3515±52克。但是，GDM和非GDM后代中大于4000g的各占16％和12％；使用校正性别和孕龄的出生体重百分点，GDM母亲分娩的23％婴儿大于90％(LGA)，而非GDM人群中只有10％是LGA。两种分类都显示3-4％GDM母亲生出的是IUGR或SGA婴儿。25周胎儿体重没有差别，而35周GDM母亲的胎儿体重要多出134克。另外，在35周，孕龄(β系数(β)＝215克)和GDM(β＝54克；p＝0.0450)，不包括BMI、吸烟和婴儿性别，成为胎儿体重的独立预测因素。在GDM(β系数＝165克)与吸烟(β＝-111克)、婴儿性别(β＝124克)和孕龄(β＝135克)，以及孕前身高和体重(β＝750和7.50)一起成为婴儿出生体重的独立预测因素时，这一差别降到119克。在本研究的高龄母亲(37.8±0.1岁，26-45岁)人群(n＝928)中GDM的发生率为12％。
生化测定GDM与非GDM母亲比较中，虽然纳入BMI、种族、胎次和羊膜穿刺检查周的因素，但前者羊水葡萄糖浓度高，而羊水IGFBP 1低。有趣的是，纳入这些协变量后，羊水胰岛素不再有差异。不过，我们发现三个羊水生化物全变成GDM的独立预测因素，而且羊水IGF BP 1参与体重预测，成为负向预测因素。用概率图观察GDM风险，发现如果羊水葡萄糖或胰岛素含量高，而其他成分含量低，则GDM的发生风险大于90％。而且如果葡萄糖含量高，而羊水IGF BP 1低，也说明GDM的发生风险大于90％。
本研究发现有一种可能，即要进行GDM诊断的妇女的羊水葡萄糖、胰岛素和IGF BP 1浓度可能已经较高，从而增加了将这些羊水成分用作GDM预测因素的可能性。这是一革命性的研究结果，之所以这么说，是因为(1)该研究结果说明BMI类别不同的妇女和出生体重不同的后代中，高含量AP葡萄糖和低含量IGF BP 1与后期GDM诊断存在相关性，(2)孕15周时，该研究结果便能根据各AF葡萄糖、胰岛素和IGF BP 1浓度、通过概率图来预测后续诊断GDM发生的风险。如果妊娠早期测出羊水胰岛素和葡萄糖浓度较高，说明正在发育胎儿所处环境的葡萄糖含量过高，则在进行当前的筛查和诊断方案之前10周，根据这一情况在常规羊膜穿刺遗传检测时取用羊水样品进行GDM风险概况评估。目前的方案是筛查母亲较高BMI，通过减小胎儿腹围、巨大胎儿、肥胖来力图有效减小GDM后代的较重出生体重，但是该方案却无法消除早期子宫内蛋白糖基化引起的胎儿病因，据报道该病因出现于GDM母亲孕晚期(3rdtrimester)之前。怀孕期间羊水葡萄糖浓度过早升高，直到20-24周，羊水葡萄糖都能穿过胎儿非角质化皮肤扩散，这对胎儿的损害可能比之前预料的要大，因为正在发育的胎儿的胰可能会受早期羊水葡萄糖升高的影响，从而增加以后出现β细胞耗竭、发生较高BMI的成人病以及患糖尿病和GDM的风险。
我们的研究人群中发生GDM的占12％。这一发病率高于CDA对包括土著人的多种族人群开展的研究报道(即8-18％)，也高于ADA的报道(7％)。这一数据并不奇怪，因为本研究中进行常规羊膜穿刺遗传检测的母亲的平均年龄大于CDA和ADA的调查年龄(CDA和ADA将该年龄作为风险因素)(即＞25岁和≥35岁)，但是这的确是有关高龄产妇高危人群发病率的首份报告。值得注意的是，与非GDM人群比较，发生GDM的人群中，亚洲人的发病率较高(37％∶18％)；不过这一发现支持了其他有关亚洲人GDM发病率高的报道。有趣的是，BMI小于25与BMI大于25的妇女的GDM发病率相同。由于传统筛查方法强调孕前体重较重是危险因素，所以根据我们的数据有可能搞清楚为什么一样多的体重正常和过轻的GDM易感人群中会出现GDM漏诊的原因。有意思的是，大多数妇女生的都是非巨大婴儿，而GDM的发生则与出生体重超重165克有关。传统的Pedersen理论认为出生体重增加与胎儿血糖过多和大于胎龄婴儿有关，但我们还发现GDM母亲完全有可能生出SGA和AGA儿。另外，本研究中的多种族人群不吸烟，IGUR发病率低于正常人群，而AGA和巨大婴儿发生率与整个加拿大和美国人群近似。
目前GDM诊断是在孕24-28周时进行。我们的研究显示，怀孕15周前，我们的GDM亚群中AF葡萄糖就已经升高。先前的研究表明孕妇空腹和2h血糖水平都与出生体重正相关，葡萄糖在协助扩散作用下自由穿过胎盘屏障，而据其他研究报道，AF胰岛素作为预测孕妇葡萄糖耐受性减弱的预测因素要优于AF葡萄糖；一项研究真实地显示出孕23周前AF葡萄糖与胎儿胰岛素过多没有关系。在我们对羊水的研究中，使用的是大样本，对已存在的混杂因素进行了控制，根据系列多元回归法显示羊水葡萄糖和胰岛素与GDM之间存在相关性；但通过它们还不能预测出生体重，这很可能是因为妊娠早期测定的羊水胰岛素不是妊娠早期的主要生长因子，而是在这一时期积累，直到妊娠后期发挥作用。关于葡萄糖，它能预测GDM，但不能预测出生体重，其很可能因为已接受治疗的GDM患者生出的婴儿体重差异很大。不过，很重要的一点是，根据构建的概率图，明显可见用AF葡萄糖和胰岛素预测GDM的复杂性。概率等值线图显示它们之间的关系显然是非线性的，如果羊水葡萄糖或胰岛素浓度高，而其他成分浓度低，则发生GDM的风险超过90％。另外，对应每一种风险概况的等值线都是非线性的。所以最重要的一点是，葡萄糖和胰岛素值之间不存在相关性。两者间的较大差异更加预示将来会发生GDM，这说明胎儿高胰岛素血症和羊水葡萄糖升高都预示以后可能发生GDM。
葡萄糖含量高时，低含量的羊水IGF BP 1与GDM风险率＞90％存在关联，是另一个有趣的GDM预测因素。以前认为IGF BP 1与出生体重负相关，而我们采用大样本进行研究的结果显示，低含量的羊水IGF BP 1与截止到孕35周时胎儿体重增加54克、分娩时出生体重增加164克有关联。先前的研究已经显示这是由于生长激素水平升高和/或循环IGF 1水平增加，或者胰岛素增加，以及食物消化增加引起，二者都抑制胎盘IGF BP 1产生。妊娠后期IGF 1活性增加会刺激胎儿加快生长，这可能是导致GDM和非GDM后代中到35周胎儿体重已经较大的原因。
总之，我们的研究结果显示，高含量AF葡萄糖、胰岛素和低含量IGF BP 1能预测GDM，GDM又正向预测婴儿出生体重。由于我们的研究结果有力地阐明，GDM孕妇腹中正在发育的胎儿在目前进行GDM诊断之前就已受到致糖尿病风险物的侵害，所以要想尽可能降低子宫胎儿受危害程度就应当尽早进行筛查和干预治疗。另外，过分强调将BMI作为筛查标准可能导致许多GDM漏诊，因为我们观察到本研究几乎50％GDM孕妇BMI＜25，并且许多婴儿并非大于胎龄儿。
在第五实施例中，妊娠期间使用本发明不断测定羊水以监测健康、饮食影响和/或治疗干预情况，从而跟踪GDM的医疗情况。该方法参见图8的图解。应当理解，是否将原位测定与羊膜穿刺检查数据结合使用可根据需要决定，虽然同时使用两种手段予以确认会让不习惯于解释或依靠羊膜原位分析结果的医师们感到放心。同样，尽管本发明考虑的是能在孕妇怀孕12周前(如上面谈到的10周)、并且正好在可能安全操作羊膜穿刺检查之前进行的原位测定，但是医师们也可以在怀孕后期根据本发明开始监测孕妇健康。尽管本实施例阐述的是GDM的例子，但应当理解它可同样应用于监测胎儿健康，如出生体重等状况。一般认为调整孕妇饮食能影响最终的出生体重和GDM危险症状。相信尽早检测GDM发生风险，然后尽早调整饮食会有效减少GDM实际发生的可能。根据医疗指南还可采取锻炼和药物干预方式。
权利要求
1.一种分析羊水的方法，该方法包括提供用于测定羊水中一个或多个生物标志物的仪器；将仪器对准羊膜囊进行羊水原位测定，无需向羊膜囊插入任何器械；用该仪器获取测定数据；以及处理数据，得到对应羊水中一个或多个所选生物标志物的数值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述仪器是拉曼光谱仪。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述对准步骤包括指引所述拉曼光谱仪通过腹壁来分析所述羊水。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述对准步骤包括指引所述拉曼光谱仪通过宫颈来分析所述羊水。
5.根据权利要求1-4之任一所述的方法，其进一步包括在所述对准过程中获得羊膜囊超声波图像，以指引或确认所述仪器进行羊水测定，而不会干扰胎儿。
6.一种治疗怀孕母亲和其胎儿中至少之一的方法该方法包括a)提供用于测定羊水内一个或多个所选生物标志物的仪器；b)将该仪器对准羊膜囊进行羊水原位测定而无需向羊膜囊内插入任何器械；c)使用该仪器获得测定数据；d)处理该测定数据后得到对应一个或多个所选生物标志物的数值；以及e)根据该数值来决定是否采取饮食干预和药物干预中至少一项措施。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，怀孕期间重复步骤a-e，步骤e包括考虑所述仪器上所显示的、对进行至少一项干预后的反应值。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述母亲是人，步骤a-e在孕12周前首次进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，首次羊膜穿刺检查在步骤a-e之后进行，根据所述羊膜穿刺检查得到的所述一个或多个选择标记物的数值，重复步骤e。
10.根据权利要求7-9之任一所述的方法，其中，怀孕期间步骤a-e至少重复3次。
11.根据权利要求6-10之任一所述的方法，其中，所述至少一个生物标志物包括葡萄糖，所述治疗是指对妊娠糖尿病进行控制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述至少一个生物标志物进一步包括胰岛素和IGF BP 1中至少之一。
13.根据权利要求6-12之任一所述的方法，其中，所述仪器是光学光谱仪。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述对准步骤包括指引所述光谱仪通过腹壁来分析所述羊水。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述对准步骤包括指引所述光谱仪通过宫颈来分析所述羊水。
16.一种预测母亲和其后代中至少之一的健康状况风险的方法，该方法包括a)提供用于分析所述母亲羊水的仪器；b)使用所述仪器获得所述羊水的分析数据，其中羊水分析不需要分离或浓缩所述羊水成分；c)处理所述分析数据，得到所述风险的预测值。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述健康状况是指出生体重，所述预测值是指预示所述后代出生体重较重和较轻的风险。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述仪器是光谱仪。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述光谱仪是光学光谱仪。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述光谱仪是拉曼近红外光谱仪。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述光谱仪是磁共振光谱仪。
22.根据权利要求18-21之任一所述的方法，其中，所述分析数据是与所述健康状况直接相关的光谱数据，从而特定生化标志物的数值不用于获得所述预测值。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括以下步骤d)存储所述分析数据；e)得到与所述健康状况发生有关的后续数据；以及f)利用所述分析数据和所述健康状况发生数据来改进相关性数据供后续步骤c使用。
24.根据权利要求16-23之任一所述的方法，其中，所述使用所述仪器的步骤包括将该仪器对准羊膜囊进行羊水原位测定而无需向羊膜囊内插入任何器械。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述仪器是光学光谱仪，所述对准步骤包括指引所述光谱仪通过腹壁来分析所述羊水。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述仪器是光学光谱仪，所述对准步骤包括指引所述光谱仪通过宫颈来分析所述羊水。
27.根据权利要求16-26之任一所述的方法，其中，所述母亲是人，步骤a-c在大约孕12周首次进行。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，首次羊膜穿刺检查在步骤a-c之后进行，利用所述羊膜穿刺检查得到的数据预测所述健康状况。
29.根据权利要求16-28之任一所述的方法，其中，怀孕期间步骤a-c至少重复3次。
30.一种预测母亲和其后代中至少之一的健康状况风险的装置，该装置包括羊水分析仪器；以及处理该仪器获得的分析数据以得到风险预测值的处理单元。
31.根据权利要求30所述的装置，其中，所述仪器是光谱仪，所述分析数据包括所述羊水的光谱。
32.根据权利要求31所述的装置，其中，所述光谱仪是拉曼光谱仪。
33.根据权利要求32所述的装置，其中，所述拉曼光谱仪在近红外区操作。
34.根据权利要求31所述的装置，其中，所述光谱仪是磁共振光谱仪。
35.根据权利要求31-34之任一所述的装置，其中，所述光谱与所述健康状况直接相关，从而特定生化标志物的数值不用于获得所述预测值。
36.根据权利要求32或33所述的装置，其进一步包括将所述仪器对准所述羊膜囊进行羊水原位测定而无需向羊膜囊内插入任何器械的光学连接器。
37.根据权利要求36所述的装置，其中，所述光谱与所述健康状况直接相关，从而特定生化标志物的数值不用于获得所述预测值。
38.根据权利要求36或37所述的装置，其中，所述连接器将所述光谱仪安放在使其通过腹壁进行羊水分析的位置。
39.根据权利要求36或37所述的装置，其中，所述连接器将所述光谱仪安放在使其通过宫颈进行羊水分析的位置。
40.根据权利要求36所述的装置，其中，所述连接器在靠近所述羊膜囊的位置与所述母亲接触操作。
41.一种对孕妇患者羊膜囊中所含羊水进行原位分析、无需向羊膜囊内插入任何器械的系统，该系统包括用于测定羊水内一个或多个所选生化标志物的仪器；适于将该仪器对准所述羊膜囊进行羊水原位测定而无需向羊膜囊内插入任何器械的连接器；以及用于处理来自该仪器的测定数据以得到对应羊水内一个或多个所选生化标志物的数值的处理单元。
全文摘要
本发明提供了用于监测胎儿生长和预测婴儿出生前出生体重的方法和光谱，其中要对孕妇羊水样品中一个或多个所选生物标志物进行测定。所选生化标志物的水平和/或光谱与胎儿生长、婴儿出生体重和妊娠糖尿病等一种或多种健康状况存在相关性。用于原位测定的探测器能安全反复使用。本发明还提供母亲和胎儿健康的监测和/或治疗。
文档编号A61B8/00GK101060811SQ200480044284
公开日2007年10月24日 申请日期2004年8月21日 优先权日2004年8月21日
发明者K·G·科斯基, D·H·伯恩斯 申请人:麦基尔大学