专利名称：穆赛来斯酒的保健功能及其成分分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及穆赛来斯酒(简称穆赛来斯，下同)保健功能或药效学的研究，同时涉及功能成分的定量分析，属于药理学和食品、药品分析等技术领域。
背景技术：
穆赛来斯，新疆维吾尔人称夏拉甫或称麦扎甫，有美酒之意。中世纪诗人欧珎尔·海亚姆在其《柔巴依集》中，称穆赛来斯是由葡萄汁演化而来的葡萄血，现代作家陈漠先生在《你把雪书下给谁》的散文集中，用60页的笔墨描述了穆赛来斯的历史和神奇功能，比喻穆赛来斯是“男人的加油站，女人的美容院”，“让我们坠入诱惑”。新疆的叶尔羌河域，居住着许多百岁老人，有人说他们之所以长寿，与常年爱喝穆赛来斯有一定的相关性，药学工作者认为适量饮用葡萄酒有益于健康，与法兰西人爱喝酿造全汁葡萄酒一样，虽然法国人的饮食习惯与北美人、西欧人一样，但心脑血管和癌症的发病率远远低于北美人和西欧人，提示常喝由葡萄发酵酿造的穆赛来斯也可能可以降低危及生命的各种疾病发病率。但以上结论仅仅是猜测，穆赛来斯的保健功能如何被现代医学所证实？酒中究竟有哪些有益健康的功能成分？这些问题引起我们的关注。
发明内容
本发明用现代药效学和仪器分析手段，对穆赛来斯的功能及保健成分进行了全面的研究，结果显示它有增强免疫功能等五方面的作用，同时指出这些作用的物质基础主要是花青素、儿茶素、芦丁和槲皮素等成份。
下面结合实例对本发明做进一步的详细描述，但不以此限制本发明。
具体实施例方式实施例1穆赛来斯药效学研究1.方法1.1材料与试剂动物昆明种小鼠，18～22g，雌雄兼用；Wistar大鼠，130g左右、250g左右，雌雄兼用，新疆医科大学实验动物中心提供。
药品穆赛来斯酒，新疆阿瓦提穆赛来斯酒厂生产，批号040112；地塞米松磷酸钠注射液，德阳华康有限公司生产，批号000417；绵羊红细胞(SRBC)；豚鼠血清；都氏试剂。杞天红景口服液，新疆乌鲁木齐尚仁科技有限公司生产，批号030108；2，4-二硝基氯苯(2，4-Dinitrochloro bebzene DNCB)，批号960801。深海鱼油。
仪器分光光度计(上海棱光技术有限公司产品，型号Spectrumlab 22PC)；电子天平(北京赛多利斯天平有限公司产品，型号BS110S)；台式离心机(上海交亭科学仪器厂制造，型号TDL80-213)。
1.2实验内容1.2.1对小鼠免疫器官重量的影响健康昆明种小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组正常对照组(NS0.2ml/10g)；地塞米松组(5mg/kg)；穆赛来斯小剂量组(0.05ml/10g)；穆赛来斯中剂量组(0.1ml/10g)；穆赛来斯大剂量组(0.2ml/10g)。以上各组连续灌胃给予生理盐水或药物15天于第15天末次服用后1小时，剖取胸腺，脾脏称重，分别以每10g小鼠的胸腺重，脾脏重作为胸腺指数，脾脏指数。
1.2.2对小鼠血清溶血素生成的影响动物分组与服用方法同1.2.1，各组动物于服用的第11天，每只小鼠腹腔注射3∶5(SRBC∶NS，V∶V)SRBC悬液0.2ml/只致敏，于第15天末次服用后1小时，摘眼球取血，分离血清，用生理盐水稀释500倍，取稀释血清1mL，依次加入10％SRBC 0.5mL，豚鼠血清(1∶10)1ml，混匀，在37℃温育30min后，在0℃冰水中终止反应，2000r/min离心10min，取上清液1mL加3mL都氏试剂，充分混匀，放置1h，用分光光度计在540nm处测上清液吸光度，另设不加血清的空白对照，取其上清液作比色时调“0”基准。按以下公式计算HC50
i.SRBC半数溶血吸光度，取10％SRBC0.25ml加都氏试剂4ml放置1h，用分光光度计在540nm处测量其吸光度。
1.2.3对小鼠溶血空斑形成细胞(PFC)能力的影响动物分组与服用方法同1.2.1，各组动物连续灌胃服用15d，于服用的第15天，末次服用后1h，处死小鼠取脾脏，除去脾脂肪和结缔组织，用注射器针芯经铜网(网目100目)轻轻捻碎脾组织，以pH7.4的磷酸缓冲生理盐水(PBS)制成脾悬液(在光学显微镜下将脾悬液浓度调至5×10-6个脾细胞/ml)，每管加入脾悬液1mL、0.25％SRBC1mL和豚鼠血清混匀，37℃水温育1h，1500r.min-1离心5min，取上清液用分光光度计在413nm处测定A值。
1.2.4对2，4-二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响健康昆明种小鼠60只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为6组正常对照组(NS0.2ml/10g)；模型组(NS0.2ml/10g)；杞天红景口服液组(0.1ml/10g)；穆赛来斯小剂量组(原液0.05ml/10g)；穆赛来斯中剂量组(原液0.1ml/10g)；穆赛来斯大剂量组(原液0.2ml/10g)。以上各组连续灌胃给予生理盐水或药物7天。
上述各组动物于实验第1天，腹部褪毛3×3cm，然后均匀涂抹5％的DNCB丙酮溶液50ul致敏，次日强化致敏一次，实验第6天，各组小鼠右耳正反两面用1％的DNCB丙酮溶液20ul均匀涂抹，进行攻击，24小时后，将各组小鼠脱颈椎处死，剪下两耳，用直径8mm的钢冲冲下耳片，称重，以左右两耳片重之差为耳肿胀度。
1.2.5对小鼠游泳耐力的影响健康昆明种小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机均匀分为5组正常对照组(NS0.2ml/10g)；杞天红景口服液组(0.1ml/10g)；穆赛来斯小剂量组(0.05ml/10g)；穆赛来斯中剂量组(0.1ml/10g)；穆赛来斯大剂量组(0.2ml/10g)。以上各组连续灌胃给予生理盐水或药物10天于第10天末次服用后2小时，进行低温游泳实验，以小白鼠无力浮起沉入水底为指标，记录每只小鼠的游泳时间。
1.2.6对大鼠肝脏、心脏组织中SOD活力、MDA、GSH含量的影响健康成年Wistar大鼠，250g左右，40只，雌雄兼用，随机分为4组正常对照组(NS2ml/100g)；穆赛来斯小剂量组(0.5ml/100g)；穆赛来斯中剂量组(1ml/100g)；穆赛来斯大剂量组(2ml/100g)。另取幼年大鼠10只，130g左右，作为对照组。上述各组大鼠连续灌胃给予生理盐水或药物30天。于末次服用后两小时，断颈处死，迅速剖取肝脏、心脏组织，用冰生理盐水制成10％的组织匀浆备用。按照试剂和的说明程序分别测定上述组织中的SOD活力、MDA、GSH的含量。
1.2.7对实验性高脂血症大鼠的影响Wistar大鼠，体重175±22.6g，雌雄兼用，随机分为6组高脂盐水组(灌胃给予高脂乳剂1ml/100g，第11天灌胃给予生理盐水2ml/100g，共20天)；正常组(灌胃给予生理盐水2ml/100g，共20天)；深海鱼油组(灌胃给予高脂乳剂1ml/100g，第11天灌胃给予深海鱼油100mg/100g，共20天)；穆赛来斯小剂量组(0.5ml/100g)；穆赛来斯中剂量组(1ml/100g)；穆赛来斯大剂量组(2ml/100g)处理方法同前。末次给予乳剂6小时后，各鼠摘眼球取血，制备血清，测定血清重的TG、CHOL、HDLC、LDLC。
1.2.8对大鼠性器官重量的影响Wistar大鼠，200g左右，56只，雌雄兼用，随机分为4组正常对照组(NS2ml/100g)；穆赛来斯小剂量组(0.5ml/100g)；穆赛来斯中剂量组(1ml/100g)；穆赛来斯大剂量组(2ml/100g)。上述各组大鼠连续灌胃给予生理盐水或药物30天。于末次服用后两小时断颈处死，迅速分别剖取睾丸、附睾、精囊腺、子宫、卵巢称重，计算脏器指数。
2.实验结果2.1对小鼠免疫器官重量的影响实验结果(见表1)表明与正常组比较，穆赛来斯各剂量组能明显使小鼠的胸腺增大，提高胸腺指数(p＜0.05)，而对脾脏影响不大。提示本品具有一定的增强机体细胞免疫的能力。
表1对小鼠免疫器官重量的影响(x±SD，n＝10)
注与生理盐水组比较*p＜0.052.2对小鼠血清溶血素抗体生成的影响实验结果(见表2)表明，穆赛来斯能明显提高小鼠血清溶血素抗体生成能力，各剂量组HC50与生理盐水组比较具有显著性差异(p＜0.05)。提示本品具有一定的增强机体体液免疫的能力。
2.3对小鼠溶血空斑形成细胞(PFC)的影响实验结果(见表2)表明，与生理盐水组比较，穆赛来斯各剂量组均能明显提高小鼠的PFC值(p＜0.05)，能增加脾脏溶血空斑形成细胞的数目。提示本品具有一定的增强机体体液免疫的能力。
表2 对小鼠血清溶血素及溶血空斑形成细胞(PFC)的影响(x±SD，n＝10)
注与生理盐水组比较*p＜0.052.4对2，4-二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响实验结果(见表3)表明，与模型组比较，穆赛来斯各剂量组均能增加小鼠耳肿胀度(p＜0.05)，说明穆赛来斯对2，4-二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应具有明显的增强作用。提示本品具有一定的增强机体细胞免疫的能力。
表3 对2，4-二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响(x±SD，n＝10)
注与生理盐水组比较*p＜0.05；与模型组比较☆p＜0.05.
2.5对小鼠游泳耐力的影响实验结果(见表4)，与正常组比较，穆赛来斯各剂量均能明显延长小鼠的游泳时间，尤以中、大剂量的效果更明显(p＜0.01)，提示本品有一定的抗疲劳作用。
表4 对小鼠游泳耐力的影响(x±SD，n＝10)
注与正常组比较*p＜0.01；与阳性组比较☆p＜0.05.
2.6对大鼠肝脏、心脏组织中SOD活力、MDA、GSH含量的影响实验结果(见表5)，与正常组比较，穆赛来斯各剂量组可显著提高肝脏中SOD活性，降低肢质过氧化产物MDA含量，提高还原型GSH的含量，尤以小中剂量效果好，提示其具有一定的清除自由基增强机体抗氧化能力的作用。
表5 对大鼠肝脏、心脏组织中SOD活力、MDA、GSH含量的影响(x±SD，n＝10)
注与正常组比较*p＜0.052.7对实验性高脂血症大鼠的影响实验结果(见表6)，与模型组比较，穆赛来斯均能明显降低高脂血症大鼠血清中总胆固醇含量，低密度脂蛋白含量(p＜0.05)；其中中剂量能提高高密度脂蛋白含量；大、中剂量组与正常组比较可降低甘油三脂含量。提示穆赛来斯酒可能有降低血脂，预防或减轻动脉粥样的形成的作用。
表6 对实验性高脂血症大鼠的影响(x±SD，n＝10)
注与模型组比较*p＜0.05
2.8对大鼠性器官重量的影响实验结果(见表7)，与正常组比较穆赛来斯各剂量组均能增加精囊腺重量，其中小、大剂量效果明显(p＜0.05)，提示雄激素样作用。但对其他4种器官无明显作用。
表7 对大鼠性器官重量的影响(x±SD，n＝7)
注与正常组比较*p＜0.05实施例2穆赛来斯保健功能成分的分析1.HPLC法测定穆赛来斯酒中儿茶素含量1.1色谱条件色谱柱Waters spherisorb ODS B柱(4.6×150mm，5μm)；柱温40℃；检测波长280nm；流速0.8mL/min；流动相0.04％柠檬酸水溶液-N，N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(45∶8∶2)。
1.2标准曲线精密吸取30μg/mL儿茶素对照品溶液1、2、4、6、8、10、12μL，依次进样，以峰面积积分值(Y)对进样量(X)进行回归处理，回归方程为Y＝952X+1.298，r＝0.9999，表明儿茶素在0.03μg～0.36μg有良好的线性关系。
1.3进样精密度试验精密吸取30μg/mL的儿茶素对照品溶液4μL，连续进样5次，峰面积的RSD值为0.96％。
1.4稳定性试验精密吸取处理好的供试品溶液(6号样)5μL，每间隔2小时进样一次，共5次，测得儿茶素峰面积的RSD值为1.61％。
精密吸取处理好的供试品溶液(6号样)5μL，每间隔24小时进样一次，共4次，测得儿茶素峰面积的RSD值为2.62％。表明被测组分在96小时内是稳定的。
1.5回收率试验精密吸取已知含量的样品(6号样)50mL，共5份，精密加入30μg/mL的儿茶素对照品溶液4mL，以下按供试品处理法操作。测得儿茶素的平均回收率为99.9％，RSD＝1.37％(n＝5)。
1.6供试品溶液的制备及测定精密吸取样品溶液50mL，水浴87℃蒸干。用20mL蒸馏水混悬。用乙酸己酯萃取三次，每次20mL，合并萃取液，浓缩至干。浸膏用甲醇溶解转移至10mL容量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜过滤后进样5μL。10个批号的样品含量数据见表8。
表8 10个样品中儿茶素含量测定结果
注以上样品按含量高低排序。
2.HPLC法测定穆塞来斯酒中芦丁、槲皮素含量2.1色谱条件色谱柱Waters spherisorb ODS B柱(4.6×150mm，5μm)；柱温35℃；检测波长360nm；流速0.8ml/min；流动相甲醇-0.25％H3PO4水(45∶55)。
2.2标准曲线精密吸取芦丁、槲皮素混合对照品溶液(芦丁15μg/mL；槲皮素4.2μg/mL)，依次进样2、4、6、8、10μL，以峰面积积分值(Y)对进样量(X)进行回归处理，回归方程分别为芦丁Y＝2107X+3.918，(r＝0.9992)；槲皮素Y＝4546X-4.494，(r＝0.9997)。
2.3供试品溶液的制备精密吸取样品溶液50mL，水浴87℃蒸干。用20mL蒸馏水混悬。然后用乙酸乙酯萃取三次，每次20mL，合并萃取液，浓缩至干。用甲醇溶解转移至10mL容量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜过滤后进样10μL。10个批号的样品含量数据分别见表9和表10。
2.4进样精密度试验取芦丁、槲皮素混合对照品溶液6μL，连续进样5次，峰面积的RSD分别为芦丁0.88％、槲皮素1.78％。
2.5稳定性试验取处理好的供试品溶液(1号样)10μL，每间隔2小时进样一次，共5次，测得芦丁峰面积的RSD为1.07％、槲皮素峰面积的RSD为1.69％。
取处理好的供试品溶液(1号样)10μL，每间隔24小时进样一次，共4次，测得芦丁峰面积的RSD为1.88％、槲皮素峰面积的RSD为2.35％。
2.6回收率试验精密吸取1号样品溶液20.0mL，共5份，精密加入25μg/mL芦丁对照品溶液2.0mL；精密加入21μg//mL槲皮素对照品溶液2.0mL；按供试品处理法操作。测得芦丁的平均回收率为98.3％(n＝5)，RSD＝1.24％；槲皮素的平均回收率为97.2％(n＝5)，RSD＝0.45％。
表9 10个样品中芦丁含量测定结果
表10 10个样品中槲皮素含量测定结果
注以上样品按含量高低排序。
3.紫外分光光度法测定穆赛来斯酒中花青素的含量3.1仪器与试药3.1.1UV1800-SPF紫外分光光度计(日本岛津公司)；AB104-N型分析天平(德国)RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
花青素(天津尖峰天然产物公司提供)，穆赛来斯酒(阿瓦提县科委和阿瓦提县医院提供)，其它试剂均为分析纯。
3.1.2实验方法与结果3.1.3花青素对照溶液的配制精密称取干燥至恒重的花青素4.8mg，置于10mi容量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。
3.1.4供试溶液的制备 精密吸取不同批次麦赛莱斯酒各100ml至蒸发皿中，分别在水浴温度85℃条件下蒸干，用蒸馏水20ml混悬，定量转移至100ml分液漏斗中，用20ml乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，浓缩至干，用少量甲醇溶解后转移至10ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。再精密吸取0.25ml溶液至10ml容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
3.1.5测定波长的选择 精密吸取花青素对照品溶液0.5ml置于10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀。取2.0ml，以甲醇为空白对照，在UV1800紫外分光光度计上，200nm-400nm波长范围内进行紫外图谱扫描，结果表明在280±1nm处有最大吸收。
取配制好的批号为030601的供试品溶液2.0ml，以甲醇为空白对照，在UV1800紫外分光光度计上，200nm-400nm波长范围内进行紫外图谱扫描，与对照品溶液比较在280±1nm有相似的最大吸收，因此选择280±1nm为测定波长。
3.2.4线性关系 精密吸取花青素对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇为空白对照，在280±1nm处测定吸光度，将所得的数据进行回归处理，得回归方程，C＝65.87A+0.3043r＝0.9998(n＝5)结果表明，花青素对照品溶液在9.6～48μg/ml浓度范围内，线性良好，符合比尔定律。
3.2.5日内稳定性试验取处理好的批号为030601供试品溶液2.0ml，在室温下放置，每隔一个小时，以甲醇为空白对照，在280±1nm处测定吸光度值，连续测定12小时，结果表明在12小时内稳定性良好，RSD＝2.29％。
3.2.6日间稳定性试验取处理好的批号为030601供试品溶液2.0ml，在室温下放置，每隔24小时，以甲醇为空白对照，在280±1nm处测定吸光度值，连续测定5天，结果表明在5天之内稳定性良好，RSD＝3.55％。
3.2.7样品测定按3.1.4项下操作，测得五个地方穆赛来斯酒中花青素含量为结果测得阿依巴克乡6大队1小队样品含量为0.34mg/ml，该乡9大队2小队为0.77mg/ml，该乡7大队1小队为0.22mg/ml；乌鲁切勒镇阿勒盘村为0.26mg/ml；乌鲁桥镇5队为0.24mg/ml。
3.2.7加样回收率实验 精密吸取9ml浓度为1mg/ml的花青素对照品溶液5份，分别加入5份批号为030601的25ml穆赛来斯酒中，按“3。1。4项”操作处理样品溶液后，在280±1nm处测定吸光度，根据回归方程计算回收率，结果平均回收率为96.04±1.72，RSD为1.79％(n＝5)。
权利要求
1.能增强机体细胞免疫和体液免疫能力。
2.抗疲劳，增强机体耐力。
3.降血脂。
4.抗氧化(抗衰老)，能显著提高肝脏中SOD活性，降低脂质过氧化物MDA含量，提高还原型GSH的含量。
5.雄激素样作用，能增加精囊腺重量。
6.以上功能的物质基础是花青素、儿茶素、芦丁和槲皮素。
全文摘要
穆赛来斯酒简称穆赛来斯。维吾尔人称“夏提甫”或“多扎甫”，有浓郁的地方特色。本发明经动物试验表明它至少有以下五个方面的保健功能一、增加机体细胞免疫功能和体液免疫功能；二、抗疲劳、增强运动耐力；三、降血脂、预防或减轻动脉粥样的形成；四、抗氧化(抗衰老)；五、增加性器官精囊腺的重量。本发明还揭示了以上作用的物质基础，指出穆赛来斯酒中含有花青素、儿茶素、芦丁和槲皮素等多种保健成分，并用紫外分光光度法测出了酒中花青素的含量，用HPLC法测出了酒中儿茶素、芦丁和槲皮素的含量。以上发明为穆赛来斯商品化提供功能定位依据和质量检测依据。
文档编号A61P3/00GK1824083SQ20051000659
公开日2006年8月30日 申请日期2005年2月23日 优先权日2005年2月23日
发明者毛新民, 堵年生, 李琳琳, 张煊, 康金森, 杨永新, 冉新建, 纵华, 阿布都拉·斯拉义 申请人:阿瓦提县人民政府, 新疆医科大学