专利名称：西替欧醛的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及二倍半萜类化合物西替欧醛(Hyrtiosal)的医药用途，具体涉及西替欧醛作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制剂和胰岛素增敏剂在制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症等由胰岛素抵抗引起的疾病的药物中应用。
背景技术：
糖尿病(diabetes mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要共同标志，久病可引起多个系统损害，病情严重和应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。在糖尿病人中发生冠心病、缺铁性或出血性脑血管病、失明、肢端坏疽等严重并发症均明显高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并发症已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。
糖尿病中90％以上是II型糖尿病，II型糖尿病有很强的遗传性和环境因素，并呈显著的异质性，发病机制多样而复杂，各病人间存在较大差异。总的来说可概括为胰岛素分泌的相对不足和胰岛素抵抗。
II型糖尿病的特点是胰岛素敏感组织如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵抗。虽然其具体机制尚不清楚，但胰岛素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断必定是直接因素。胰岛素通过与其受体胞外α亚单位结合激活受体胞内β亚单位内在的酪氨酸激酶活性，导致调节结构域中关键的酪氨酸残基自身磷酸化，从而完全激活胰岛素受体酪氨酸激酶活性，胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化其底物将信号传递下去。随着对细胞内胰岛素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化认识的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡该通路中相关蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越来越受到重视。PTPases可能作用于该通路中多个环节，例如将自身磷酸化活化的胰岛素受体(IR)去磷酸化，从而降低受体激酶活性；或将诸如胰岛素受体底物1(IRS-1)、胰岛素受体底物2(IRS-2)、Shc等胰岛素受体的底物中蛋白酪氨酸残基致病磷酸化，从而负调控胰岛素作用受体后通路。特定PTPases和胰岛素通路中酪氨酸激酶间酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰岛素抵抗的原因。因此，通过寻找选择性作用于该通路中PTPases的抑制剂抑制其活性，加强和延长胰岛素信号，成为越来越受重视的治疗II型糖尿病的新途径。
PTP1B是最早被纯化和确定生物学特性的PTPase，全长大约50KD。最近有研究表明，PTP1B直接与激活状态的IR相互作用；在体外实验中也对IRS-1显示最高的选择性活性；大鼠成纤维细胞中PTP1B的高表达能明显降低配体诱导的IR磷酸化水平；用腺病毒介导基因转染的方法，在胰岛素靶向组织骨骼肌和肝组织的模型细胞L6肌细胞和Fao细胞中高表达PTP1B，明显抑制胰岛素诱导的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并从而显著抑制IRS-1和PI3激酶P85亚单位复合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰岛素诱导的糖原合成也被抑制(Egawa K.et al.J.Biol.Chem.276(13)10207-10211)。用同样的方法在另一胰岛素靶向组织脂肪组织的模型细胞3T3-L1细胞中高表达PTP1B，同样明显抑制胰岛素诱导的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44MAPK磷酸化水平也明显降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影响(Venable C.L.et al.J.Biol.Chem.275(24)18318-18326)。PTP1B的高表达对基本的、中等的及最大量胰岛素诱导的葡萄糖转运无影响，对转运的EC50胰岛素浓度无影响。这些研究证明PTP1B能够负调控胰岛素信号转导通路并主要作用于胰岛素受体。另有大量实验证明PTP1B在胰岛素敏感性、能量消耗和脂肪储存方面的重要作用(Klaman L.D.，et al.Molecular and Cellular Biology，20(15)5479-5489)，从而更加明确了它是治疗二型糖尿病和肥胖症的一个潜在药物作用靶点。
近年来PTP1B选择性抑制剂的研究取得了一定的进展，但大多局限于一些肽类或非肽类化合物，虽然这些肽类抑制剂具有较强的抑制活性及较高的选择性，但由于是肽类磷酸化合物，很难成为药物候选化合物。最近报道了一系列非肽类非磷酸化合物类PTP1B抑制剂，它们具有一定的选择性，更重要的是，其中一些化合物对降低ob/ob小鼠血浆中葡萄糖和胰岛素水平有显著作用(Malamas，M.S.，et al.J.Med.Chem.，2000，43，1293-1310)。这些为寻找新的小分子非肽类有机化合物作为高效、高选择性PTP1B抑制剂提供了机遇。
二倍半萜类化合物西替欧醛(Hyrtiosal)的化学结构式如下 据文献报道该化合物在体外具有抑制KB细胞的活性，属于细胞毒类化合物(Iguchi，K.；Shimada，Y.；Yamada，Y.J.Org.Chem.1992，57，522-524)。目前尚没有报道该化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供西替欧醛新的医药用途，该化合物具有明显的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B抑制活性，可作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制剂和胰岛素增敏剂，用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症等由胰岛素抵抗引起的疾病的药物。
化合物西替欧醛可以采用本领域已知的常规化学提取方法从海绵中提取分离，例如可以从南海海绵(Hyrtios erectus)中提取分离将冰冻的新鲜海绵切碎，用分析纯丙酮超声提取至无色，减压浓缩丙酮提取液(温度低于50℃)，浓缩物用蒸馏水悬浮，分别用乙醚和正丁醇萃取，乙醚萃取液经减压浓缩后得到棕色浸膏，该浸膏先后通过硅胶(200-300目)柱层析(以石油醚(60-90℃)/丙酮梯度洗脱)，凝胶Sephadex LH-20(氯仿洗脱)柱层析，分离得到化合物西替欧醛。化合物参照文献方法用核磁共振鉴定(Iguchi，K.；Shimada，Y.；Yamada，Y.J.Org.Chem.1992，57，522-524)。
经药理实验测定，西替欧醛抑制hPTP-1B的IC50为60.4μM，说明该化合物对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B具有明显的抑制活性。
图1为化合物西替欧醛抑制PTP1B酶活动力学曲线图，其中横坐标表示化合物西替欧醛测试浓度的-log值，纵坐标表示相应的抑制率(扣除DMSO的影响)。
有益效果本发明为已知化合物西替欧醛发掘了新的医药用途，开拓了一个新的应用领域。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例1 化合物西替欧醛(Hyrtiosal)的制备核磁共振用Bruker-DRX500核磁共振仪测定。柱层析硅胶、薄层硅胶板均为青岛海洋化工有限公司生产。所使用的Sephadex LH-20为E.Merk公司生产，试剂均为上海振兴化工一厂产品。
冰冻的新鲜海绵(干重138克)切碎，用分析纯丙酮超声提取至无色，减压浓缩丙酮提取液(温度低于50℃)，浓缩物以500毫升的蒸馏水悬浮，分别用乙醚和正丁醇萃取，乙醚萃取液经减压浓缩后得到棕色浸膏5.4克，该浸膏先后通过硅胶(200-300目)柱层析[石油醚(60-90℃)/丙酮梯度洗脱]，凝胶LH-20(氯仿洗脱)柱层析分离得到无色晶体化合物西替欧醛11.2mg。
1H NMR(TMS，CDCl3)δ9.47(s，1H，H-12)，7.36(brs，2H，H-19和H-25)，6.37(t，1H，H-18)，4.42(m，1H，H-16)，0.86(s，3H，Me)，0.85(s，3H，Me)，0.84(s，3H，Me)，0.82(s，3H，Me)；13C NMR(CDCl3)δ40.2(C-1)，18.8(C-2)，42.4(C-3)，33.1(C-4)，57.4(C-5)，18.3(C-6)，40.1(C-7)，44.5(C-8)，60.3(C-9)，36.7(C-10)，33.6(C-11)，205.8(C-12)，52.9(C-13)，48.0(C-14)，33.6(C-15)，64.2(C-16)，129.2(C-17)，108.5(C-18)，143.2(C-19)，33.5(C-20)，21.2(C-21)，15.7(C-22)，16.5(C-23)，19.1(C-24)，138.8(C-25)；实施例2 化合物西替欧醛的PTP1B抑制活性实验1、测试原理利用分子生物学手段在大肠杆菌系统表达人源蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTP1B)催化结构域，经纯化后的hPTP1B重组蛋白能水解碱性磷酸酶的可溶性底物对硝基苯磷酸(p-Nitrophenyl phosphate，pNPP)的磷脂键，pNPP脱去一个磷酸根生成黄色可溶产物对硝基酚(p-Nitrophenol)，该产物在405nM处有光吸收，通过检测405nM处光吸收的的变化可以检测磷酸酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。标准的测活体系如下10mM Tris.Cl，pH 7.6，10mM pNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B。
观察指标动态测定波长为405nm处的光吸收，时间为3分钟，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。
2、实验材料和仪器(1)Glutathione SepharoseTM4B亲和柱(购自Amersham Biosciences公司)；(2)含人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B(hPTP1B)的催化区cDNA的质粒(来自于Chemoff)和E.coli BL21(DE3)(购自Novagen公司)；(3)5×hPTP1B催化区酶蛋白(20.43μM)纯化得到的人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B催化区酶蛋白经透析、浓缩后12000rpm离心10min，用Bradford法测定浓度为20.43μM；(4)二甲基亚砜(DMSO，购自Fisher公司)；(5)还原型谷胱甘肽(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)；(6)hPTP1B酶反应用缓冲液1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，调pH到7.4，用无菌的超纯净双蒸水配制。)缓冲液配制所用的试剂均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；(7)pNPP(购自Sigma公司)；(8)透明96孔板(购自Coming公司)；(9)microplate spectrophotometer(购自BIO-RAD公司)；(10)待测化合物按照实施例1方法制备的西替欧醛，用DMSO稀释成各实验浓度；(11)溶解对硝基苯磷酸的缓冲液0.1M甘氨酸，pH9.8，内有1mM MgCl2和1mMZnCl2，用无菌的超纯净双蒸水配制(缓冲液配制所用的试剂均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司)；(12)终止反应缓冲液3M NaOH，用无菌的超纯净双蒸水配制。(缓冲液配制所用的试剂均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司)。
(13)5×pNPP(64.38μM)64.38μM pNPP，用pNPP的溶解缓冲液配制。
3、实验方法3.1、实验设计测活反应实验组及各对照实验组的试剂使用设计见表1表1
3.2待测化合物活性测定实验hPTP1B酶反应缓冲液59μL、5×pNPP(64.38μM)20μL、待测化合物1μL和5×hPTP1B(20.43μM)20μL在室温混匀，在30℃反应1小时后加入25μL终止反应缓冲液终止反应，然后用酶标仪测其在405nM的光吸收。
3.3对照实验3.3.1酶反应(不加DMSO)hPTP1B酶反应缓冲液60μL、5×pNPP(64.38μM)20μL和5×hPTP1B(20.43μM)20μL在室温混匀，在30℃反应1小时后加入25μL终止反应缓冲液终止反应，然后用酶标仪测其在405nM的光吸收。
3.3.2不加酶反应hPTP1B酶反应缓冲液80μL和5×pNPP(64.38μM)20μL在室温混匀，在30℃反应1小时后加入25μL终止反应的终止反应缓冲液终止反应，然后用酶标仪测其在405nM的光吸收。
3.3.3酶反应(加DMSO)hPTP1B酶反应缓冲液59μL、5×hPTP1B(20.43μM)19μL、DMSO 1μL和5×pNPP(64.38μM)20μL在室温混匀，在30℃反应1小时后加入25μL终止反应缓冲液终止反应，然后用酶标仪测其在405nM的光吸收。
3.4IC50值测定实验将待检测化合物用DMSO稀释成不同的浓度2.00×10-4M、1.00×10-4M、5.00×10-5M、2.50×10-5M、1.00×10-5M、5.00×10-6M、1.00×10-6M、1.00×10-7M、1.00×10-8M，按照3.2所述方法进行反应。
所有实验均设置复孔。
4、实验结果实验结果见表2和图1。
表2
从表2及图1所示的结果看，待测化合物对抑制PTP1B的酶活性有很强的效果，其IC50达到6.04×10-5M。
权利要求
1.西替欧醛作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制剂的用途。
2.根据权利要求1所述的西替欧醛的用途，其特征在于作为胰岛素增敏剂，用于制备治疗由胰岛素抵抗引起的疾病的药物。
3.根据权利要求2所述的西替欧醛的用途，其特征在于在制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及二倍半萜类化合物的医药新用途。经药理试验表明，该化合物具有明显的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性，可用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症等胰岛素抵抗引起的疾病的药物。
文档编号A61P3/00GK1853622SQ20051002559
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月29日 优先权日2005年4月29日
发明者沈旭, 郭跃伟, 蒋华良, 姚励功, 郭虹霞 申请人:中国科学院上海药物研究所