专利名称：化合物西替欧醛的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及二倍半萜类化合物西替欧醛(hyrtiosal)的制备方法及HIV-1整合酶抑制活性研究。
背景技术：
自1981年在美国发现首例艾滋病AIDS(acquired immunodeficiency syndrome，获得性免疫缺陷病症)患者以来，艾滋病已在全球的180多个国家和地区快速蔓延。目前全球艾滋病患者和病毒携带者总数已达到4,200多万，这其中中国有近100万，在亚洲居第2位，在全球居第14位。而且近年来中国艾滋病病例数在以平均每年30-40％的速度快速增长，已经成为一个日益严峻的公共安全问题。
HIV病毒作为AIDS的病原体，其感染人体后在体内的复制过程需要整合酶(integrase，IN)的参与才能完成。IN能完成HIV双链DNA分子整合进入宿主染色体的过程。IN在体内具有3’切割的内切酶活性和链转移活性。IN先在HIV线形平端DNA的双链两端按3’-5’方向切割两个碱基，形成CA-OH-3’的凹端，在宿主细胞的DNA双链上切开一个5bp的缺口；然后HIV DNA双链的CA-OH-3’的凹端在IN的作用下与宿主细胞DNA链切口的5bp以磷酸二酯键的形式结合形成整合中间体；再在细胞内某些酶的作用机制下去掉病毒DNA5’末端未配对的两个碱基，修复病毒及宿主细胞DNA链的缺口。
IN是由288个氨基酸组成的分子量32kD的蛋白质，它在结构上分为三个部分N端区、核心区和C端区。N端区由1-50位氨基酸组成，是一个保守的HHCC锌指结构域，具有病毒DNA识别功能，此外还有促进IN四聚化和增强催化活性的功能。核心区由52-210位氨基酸组成，是IN催化最重要的部位。它包含三个酸性氨基酸残基(Asp64、Asp116和Glu152)，排列成DD35E型，是非常保守的结构，是内核酶和核苷转移酶的位点。该部位和一个或两个二价阳离子(Mg2+或Mn2+)结合对催化活性是必需的。C端区是IN中保守性最小的区域，由213-288位氨基酸组成。它包含核定位信号，能非特异性的结合DNA，还参与IN的多聚化。IN三个区的晶体结构及与各种抑制剂的复合物晶体结构都已得到，但是IN全长的晶体结构仍然没有解决。
由于IN在HIV病毒复制过程中起着不可缺少的重要作用，而且IN在人体细胞内没有IN的功能类似物，因而IN是AIDS治疗的理想靶标。寻找新的IN抑制剂，结合HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂联合用药，可以提高抗病毒活性、降低毒副作用和减少耐药性，是很有意义的治疗方案。
到目前为止发现的IN的抑制剂包括DNA结合剂、寡核苷酸及核苷类似物、硫酸酯类似物、多肽和羟基取代的芳香化合物等。根据这些抑制剂跟IN的结合位点可以分为四类。
1核苷结合位点最早用做IN抑制剂研究的核苷化合物是AZT及其衍生物AZTMP。AZT单磷酸、双磷酸和三磷酸均具有抗IN链转移活性。它们对IN的抑制是通过干扰IN与DNA的结合实现的。IN的K156、K159和K160是单核苷的结合位点，其中高度保守的K159是IN与DNA结合的关键。随后发现二核苷及异二核苷，还有寡核苷酸类化合物也有抑制IN的活性。
2金属离子结合位点多羟基芳香化合物与IN的二价金属离子(Mg2+或Mn2+)鳌合从而抑制IN的活性。这是具有IN抑制作用的化合物中被报道最多的，有木脂内酯类、香豆素单体或二聚体类、苯乙烯喹啉类和含邻苯二酚的螺环类蒽醌类等。这类化合物在体外测定中对IN有很好的抑制作用，但在细胞培养中毒性太大。
3LTR(长末端重复)DNA序列结合位点这类抑制剂目前已经报道的有DNA双螺旋小沟结合剂(如纺锤霉素和偏端霉素)、DNA嵌入剂(如多柔比星)和拓扑异构酶抑制剂(如米多蒽醌)。
4其他位点2000年默克公司发现了两种能遏制IN的二酮酸类抑制剂，这是目前为止唯一一类选择性作用于IN的抑制剂。这类化合物对整合反应的第二步有选择性抑制作用。除此之外其他的抑制剂都可能同时有多个作用位点。
尽管对IN的抑制剂已有十余年的研究，但是IN抑制剂目前没有药物上市，仅有少数进入临床。究其原因，主要有两方面的限制一是活性测定方法的限制基于细胞培养的测定无法确定化合物是否直接作用于IN，而分子水平的筛选又有太多假阳性；二是结构生物学方面的限制IN的晶体结构及其DNA底物复合物的晶体结构都没有确定，而且整合这个复杂的生化过程中还有许多机理没弄清楚。
目前对AIDS病的治疗主要采用联合用药的策略，即采用HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂联合用药，但是治疗过程中HIV病毒突变导致的耐药性以及逆转录酶和蛋白酶抑制剂的毒副作用情况严重。因此，寻找和发现HIV-1整合酶抑制剂成为AIDS治疗的新的重要主题。从天然产物中发现HIV-1整合酶的新型抑制剂，对于进一步设计合成新型有效的HIV-1整合酶抑制剂及AIDS的治疗具有重大的开拓性的意义。
本发明揭示了来源于中国南海海绵的二倍半萜类化合物西替欧醛与HIV-1整合酶具有很高结合活性(KD＝0.197μM)，并且在底物竞争测试中能够有效的抑制整合酶对底物的结合(IC50＝9.6μM)。
发明内容
本发明的一个目的是提供对HIV-1整合酶有抑制作用的化合物西替欧醛。
本发明的另一个目的是提供该化合物的制备方法。
本发明的再一个目的是运用生物传感器，利用表面等离子共振原理，筛选了化合物西替欧醛对HIV-1整合酶的抑制活性，从而确定了对艾滋病的治疗用途。
本发明提供具有如下结构式的化合物西替欧醛 西替欧醛本发明提供了化合物西替欧醛的制备方法。
化合物西替欧醛从南海海绵(Hyrtios erectus)中提取分离得到将冰冻的新鲜海绵切碎，用分析纯丙酮超声提取至无色，减压浓缩丙酮提取液(温度低于50℃)，浓缩物用蒸馏水悬浮，分别用乙醚和正丁醇萃取，乙醚萃取液经减压浓缩后得到棕色浸膏，该浸膏先后通过硅胶(200-300目)柱层析(以石油醚(60-90℃)/丙酮梯度洗脱)，凝胶Sephadex LH-20(氯仿洗脱)柱层析，随后用高效液相色谱制备(采用甲醇/水＝85∶15洗脱，210nm检测，流速为2.6ml/min)，分离得到化合物西替欧醛。
本发明利用生物传感器技术对西替欧醛进行了HIV-1整合酶抑制剂活性的实验由下列步骤组成。
1.用生物传感器测定西替欧醛与HIV-1整合酶的结合活性。
(1)GST标记的HIV-1整合酶(IN，integrase)的克隆本步骤采用基因工程上游方法，选用pGEX-4T-1载体构建IN融合蛋白的质粒(pGEX-4T-1-IN)。
a.用PCR技术从pUC18-IN质粒获得IN的DNA片段(基因序列依据AF040373(GENEBANK))。
引物FW5′-ata tgg atc ctt ttta gat gga ata gat-3′RV5′-ata tct cga gct aat cct cat cct g-3′94℃变性5min，然后开始循环94℃45s，55℃45s，72℃1min30s，重复29次循环，然后72℃10min。
采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并回收PCR片段。
b.将IN PCR片段克隆到载体pGEX-4T-1上IN PCR产物和pGEX-4T-1分别用BamHI和XhoI进行酶切反应；用胶回收试剂盒回收酶切产物；用T4DNA连接酶做连接反应；连接产物转化到DH5α感受态细胞；通过酶切和测序鉴定出正确的克隆。
c.将HIV-1整合酶185位的苯丙氨酸突变成赖氨酸本步骤采用Invitrogen公司的点突变试剂盒。
突变引物FW5’-ggcagtattcatccacaataagaaaagaaaaggggggattgg-3’RV5’-ccaatccccccttttcttttcttattgtggatgaatactgcc-3’通过测序确定发生正确突变的克隆质粒pGEX-4T-1-IN(F185K)。
(2)HIV-1整合酶的表达纯化本步骤采用了基因工程中的下游技术a.将质粒pGEX-4T-1-IN(F185K)转入表达菌株BL21(DE3)中，挑选正确的克隆在37℃过夜振荡培养于10ml氨苄LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl10g/L，氨苄青霉素浓度为100mg/L)中，按1∶100转接到新鲜的氨苄LB培养基中，振荡培养到OD600值处于0.6-0.8之间时，加入IPTG至终浓度为0.2mM并将培养温度降低至25℃诱导蛋白表达5-7小时。5,000rpm离心10min收集细菌，用PBS缓冲液悬洗细菌后再次离心，并将收集的细菌置于-70℃冰箱保存待用。
b.超声破碎细菌，采用亲和层析的方法用GST树脂纯化蛋白，然后再用分子筛的方法进一步得到纯度大于95％的蛋白。
(3)西替欧醛与HIV-1整合酶结合活性检测本步骤采用生物传感器Biacore 3000及其相关技术(表面等离子共振生物传感技术)。
a.将纯化好的HIV-1整合酶用氨基偶联的方法偶联到CM5芯片上(偶联方法按照Biacore 3000使用手册)。
b.将不同浓度的西替欧醛配成含0.1％DMSO的HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)作动力学分析，用Biacore evaluation 3.2软件分析得出该化合物和HIV-1整合酶的平衡解离常数KD。
2.用生物传感器测定西替欧醛对HIV-1整合酶的IC50值。
(1)将HIV-1整合酶的底物类似物偶联到生物传感器SA芯片上本步骤采用生物传感器Biacore 3000及其相关技术(底物类似物是双链DNA，序列为5’-GTGTGGAAAATCTCTAGGTGT-3’。
根据HIV-1整合酶的病毒DNA末端底物序列设计合成底物类似DNA，并在5’端加上生物素(biotin)标记。序列biotin-5’-GTGTGGAAAATCTCTAGGTGT-3’。将合成的带生物素标记的DNA利用生物素和链霉素结合的原理偶联到SA芯片。
(2)用生物传感器测定西替欧醛对HIV-1整合酶的IC50值本步骤采用生物传感器Biacore3000及其相关技术。
将纯化好的HIV-1整合酶和不同浓度的西替欧醛在冰上孵育1小时后作动力学分析，因为化合物竞争结合HIV-1整合酶，使得HIV-1整合酶对芯片上底物DNA类似物的结合能力下降，表现为RU值的下降。根据化合物的不同浓度对应的RU值与浓度作图，用Origin分析得出化合物的IC50值。
图1是表示GST标记的HIV-1整合酶的纯度。
图2是西替欧醛与HIV-1整合酶动力学分析。
图3是西替欧醛IC50值的测定。
具体实施例方式
下面进一步用实施例说明式(I)化合物的制备，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
NMR用Bruker-DRX500核磁共振仪测定。柱层析硅胶、薄层硅胶板均为青岛海洋化工有限公司生产。所使用的Sephadex LH-20为E.Merk公司生产，试剂均为上海振兴化工一厂产品。
实施例1冰冻的新鲜海绵(干重138克)切碎，用分析纯丙酮超声提取至无色，减压浓缩丙酮提取液(温度低于50℃)，浓缩物以500毫升的蒸馏水悬浮，分别用乙醚和正丁醇萃取，乙醚萃取液经减压浓缩后得到棕色浸膏5.4克，该浸膏依次通过硅胶(200-300目)柱层析[石油醚(60-90℃)/丙酮梯度洗脱]，凝胶LH-20(氯仿洗脱)柱层析分离得到无色晶体11.2毫克。1H-NMR和13C-NMR数据如下1H NMR(CDCl3)δ9.47(s，1H，H-12)，7.36(brs，2H，H-19和H-25)，6.37(t，1H，H-18)，4.42(m，1H，H-16)，0.86(s，3H，Me)，0.85(s，3H，Me)，0.84(s，3H，Me)，0.82(s，3H，Me)；13C NMR(CDCl3)δ40.2(C-1)，18.8(C-2)，42.4(C-3)，33.1(C-4)，57.4(C-5)，18.3(C-6)，40.1(C-7)，44.5(C-8)，60.3(C-9)，36.7(C-10)，33.6(C-11)，205.8(C-12)，52.9(C-13)，48.0(C-14)，33.6(C-15)，64.2(C-16)，129.2(C-17)，108.5(C-18)，143.2(C-19)，33.5(C-20)，21.2(C-21)，15.7(C-22)，16.5(C-23)，19.1(C-24)，138.8(C-25)；经与文献波谱数据(Iguchi，K.；Shimada，Y.；Yamada，Y.J.Org.Chem.1992，57，522-524)确定采用上述提取、分离流程最终得到的无色晶体为二倍半萜类化合物西替欧醛(hyrtiosal)。
下述实施例中，所用的实验材料及其来源包括(1)Glutathione SepharoseTM4B亲和树脂和Hiload 16/60 Superdex75分子筛预装柱均购自Amersham Biosciences公司；(2)Biacore3000专用CM5芯片和SA芯片购自Amersham Biosciences公司；(3)HIV-1整合酶基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成部合成，依据序列AF040373(GENEBANK)，克隆到质粒pUC18构建成pUC18-IN；(4)载体pGEX-4T-1和菌株BL21购自Novagen公司；(5)快速点突变试剂盒购自Invitrogen公司；(6)限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶、dNTP等均购自Ferment(晶美)公司；(7)10×buffer随pyrobestTMDNA聚合酶一起购自上海生工生物工程技术服务有限公司；(8)小量质粒抽提试剂盒购自华舜公司；(9)PCR产物回收试剂盒和胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；(10)DNAmarker购自鼎国生物技术公司；(11)蛋白质低分子量marker购自Amersham Biosciences公司；(12)引物合成和DNA生物素修饰由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；(13)DNA测序由上海博亚公司完成；(14)氨苄青霉素、卡那霉素、DMSO和IPTG均购自Sigma公司；(15)细菌培养所需LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L)其中酵母提取物、胰蛋白胨和NaCl均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；(16)还原型谷胱甘肽购自上海生工生物工程技术服务有限公司；(17)缓冲液1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)；HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)其中NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、HEPES均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司，P20购自Amersham Biosciences公司；下述实施例中常规的基因操作参照有关文献，其中限制性酶切方法参照分子克隆第二版P259-262；用T4DNA连接酶连接方法参照分子克隆第二版P282-283；感受态细胞的制备参照分子克隆第二版P55-56；连接产物转化入感受态细胞DH5α和BL21方法参照分子克隆第二版P55-56；用酶切鉴定方法参照分子克隆第二版P259-262；此外琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物方法参照分子克隆第二版P680-682；胶回收按照上海生工的试剂盒说明书；点突变参照Invitrogen的试剂盒说明书；蛋白纯化方法参照GST gene fusion systemhandbook及<Gel filtration，principles and methods>(Amersham Biosciences)；蛋白偶连到CM5芯片方法和生物素修饰的DNA偶联到SA芯片的方法按照Biacore3000自带软件进行；质粒提取方法参照华舜公司试剂盒说明书；LB培养基的配制方法参照分子克隆第二版P908；IPTG和PBS缓冲液的配制参照分子克隆第二版P926-927；HBS-EP溶液的配制参照Biacore3000说明书。
实施例2 GST标记的HIV-1整合酶(IN，integrase)的融合蛋白质粒pGEX-4T-1-IN(F185K)的构建(一)实验方法1)用PCR技术从pUC18-IN质粒获得IN的DNA片段(基因序列依据AF040373(GENEBANK))。
引物FW5′-ata tgg atc ctt ttta gat gga ata gat-3′RV5′-ata tct cga gct aat cct cat cct g-3′94℃变性5min，然后开始循环94℃45s，55℃45s，72℃1min30s，重复29次循环，然后72℃10min。
采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并回收PCR片段。
2)将IN PCR片段克隆到载体pGEX-4T-1上IN PCR产物和pGEX-4T-1分别用BamHI和XhoI进行酶切反应；用胶回收试剂盒回收酶切产物；用T4DNA连接酶做连接反应；连接产物转化到DH5α感受态细胞涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的平板上；通过酶切和测序鉴定出正确的克隆。
3)将HIV-1整合酶185位的苯丙氨酸突变成赖氨酸本步骤采用Invitrogen公司的点突变试剂盒。
突变引物FW5’-ggcagtattcatccacaataagaaaagaaaaggggggattgg-3’RV5’-ccaatccccccttttcttttcttattgtggatgaatactgcc-3’通过测序确定发生正确突变的克隆质粒pGEX-4T-1-IN(F185K)。
(二)实验结果1)琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果pGEX-4T-1载体的多克隆位点上有BamHI和XhoI两个酶切位点，IN通过这两个位点克隆到pGEX-4T-1上，正确的酶切结果切出IN本身的片段约900bp和载体的片段约4900bp；2)测序结果显示克隆的序列与AF040373(GENEBANK)相同，仅在序列的553-555位由原有的”ttt”突变为”aaa”，对应为185位的氨基酸由苯丙氨酸突变成赖氨酸。
实施例3 GST标记的HIV-1整合酶(GST-IN)的表达纯化(一)实验方法1)将质粒pGEX-4T-1-IN(F185K)转入表达菌株BL21(DE3)中，挑选正确的克隆在37℃过夜振荡培养于10ml氨苄LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl10g/L，氨苄青霉素浓度为100mg/L)中，按1∶100转接到新鲜的氨苄LB培养基中，振荡培养到OD600值处于0.6-0.8之间时，加入IPTG至终浓度为0.2mM并将培养温度降低至25℃诱导蛋白表达5-7小时。5,000rpm离心10min收集细菌，用PBS缓冲液悬洗细菌后再次离心，并将收集的细菌置于-70℃冰箱保存待用。
2)待用的菌体用20ml PBS悬起，超声破碎细菌，15,000rpm离心30min后取上清和已经用PBS平衡好的Glutathione SepharoseTM4B亲和树脂在4℃混匀4hrs，穿过柱子后，用100-150ml PBS洗去杂蛋白，最后用50mM GSH洗脱GST标记的IN。
3)洗脱的蛋白溶液按照Amersham Biosciences公司提供的说明书利用Hiload 16/60Superdex75分子筛预装柱进一步分离纯化，所用溶液为10mM HEPES和150mMNaCl，收集蛋白用SDS-PAGE检测纯度。
(二)实验结果8％SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色检测纯化的蛋白HIV-1整合酶全长282个氨基酸，加上大小为27kD的GST标记，整个融合蛋白大小约为60kD。如图1所示，左边泳道为marker，右边则为纯化好的蛋白HIV-1整合酶，染色后的SDS-PAGE胶上可以清楚的看到约60kD处的条带，判断纯度大于95％。
实施例4 利用生物传感器Biacore 3000检测西替欧醛与HIV-1整合酶的结合活性(一)实验方法1)将纯化好的HIV-1整合酶用氨基偶联的方法利用Biacore 3000自带的程序偶联到CM5芯片上。Biacore3000系统运行环境为HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mMNaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)。
2)将不同浓度的西替欧醛配成含0.1％DMSO的HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)作动力学分析，用Biacore evaluation 3.2软件分析得出该化合物和HIV-1整合酶的平衡解离常数KD。
(二)实验结果化合物西替欧醛表现出对HIV-1整合酶很高的结合活性，KD＝0.197μM(图2)。
实施例5 用生物传感器测定西替欧醛对HIV-1整合酶的IC50值。
(一)实验方法1)将HIV-1整合酶的底物类似物偶联到生物传感器SA芯片上根据HIV-1整合酶的病毒DNA末端底物序列设计合成底物类似DNA，并在5’端加上生物素(biotin)标记。序列biotin-5’-GTGTGGAAAATCTCTAGGTGT-3’。将合成的带生物素标记的DNA利用生物素和链霉素结合的原理偶联到SA芯片。
2)生物传感器测定西替欧醛对HIV-1整合酶的IC50值将纯化好的HIV-1整合酶和不同浓度的西替欧醛在冰上孵育1小时后作动力学分析，因为化合物竞争结合HIV-1整合酶，使得HIV-1整合酶对芯片上底物DNA类似物的结合能力下降，表现为RU值的下降。根据化合物的不同浓度对应的RU值与浓度作图，用软件Origin分析得出化合物的IC50值。
(二)实验结果由图3可以看到随着化合物浓度的增加，HIV-1整合酶对SA芯片的RU值下降。根据化合物的不同浓度对应的RU值与浓度作图，用Origin分析得出化合物西替欧醛的IC50值为9.6μM。
权利要求
1.具有如下结构式的化合物西替欧醛的用途，在它对HIV-1整合酶具有高结合活性
2.根据权利要求1所述的化合物西替欧醛的用途，其特征在于化合物具有抑制HIV-1整合酶与底物的结合。
3.根据权利要求1所述的化合物西替欧醛的用途，其特征在于在制备预防或治疗艾滋病药物中应用。
全文摘要
本发明提供具有如图所示结构式的化合物西替欧醛(I)。化合物西替欧醛与HIV－1整合酶具有很高的结合活性(K
文档编号A61P31/18GK1864674SQ200510026028
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月20日 优先权日2005年5月20日
发明者郭跃伟, 沈旭, 蒋华良, 于志国, 杜丽 申请人:中国科学院上海药物研究所