使用释放醛类的含氮化合物固定组织样本的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于固定组织样本的方法和组织处理机。
【背景技术】
[0002] 使用甲醛水溶液固定组织样本的方法已经已知了一段时间。
[0003] 具有37重量％的甲醛或40体积％的甲醛的饱和甲醛水溶液也称为"福尔马林"。 用于固定组织样本的、关于甲醛溶液的浓度的指示典型地参考这个。例如，"10%福尔马林" 溶液包含4体积％的甲醛。
[0004] 在水溶液中，甲醛快速水合为甲二醇，而甲二醇与被固定的组织中的大分子（诸 如蛋白质类和糖蛋白类）反应。首先发生的是在适当胺基团、酰胺基团和反应醇基团等上 形成羟甲基基团。唯有使用更长固定时间，这些羟甲基基团才交联到合适程度。
[0005] 甲醛还与细胞核中的蛋白质类反应，由此稳定核酸类的蛋白鞘。核酸类自身的游 离氨基基团还可与甲醛反应，如不饱和脂肪酸类中的双键和硫醇基团。另一方面，纯碳水化 合物通常不与甲醛反应。
[0006] 肽类和蛋白质类的与甲二醇最强烈反应且因此对甲醛固定的响应最好的反应基 团为赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸和酪氨酸的胺基团以及丝氨酸和苏氨酸的羟基基 团。所谓的"过度固定"（硬化（tanning))的结果是赖氨酸的交联和蛋白质的骨架的酰胺 类的交联。由于现在典型使用更短的固定时间，这样的反应很少发生。
[0007] 甲醛具有良好的固定特征，但是对健康有很高的危险，且当暴露时，可导致皮肤、 呼吸道和眼睛的过敏和刺激。另外，甲醛被认为是致癌物质。因此人们努力将甲醛用危害 更小的用于固定组织样本的化合物代替。对其他固定试剂（诸如戊二醛和四氧化锇）也是 如此。
[0008] 在这点上，可能的是使用释放适当醛类、特别是甲醛的化合物。其一个例子是乌洛 托品。这样的化合物的使用是已知的，例如，来自EP1 895 287BI(DE10 2006 040 315 B4,US7, 915, 007B2)。其还被称为各种醛类的"释放体"或"给体"。
[0009] 醛释放化合物的使用的缺点在于：在平衡反应中，其通常仅释放组织样本反应消 耗的量的甲醛。与常规福尔马林溶液（其中甲醛或其水合产物甲二醇过量）相比，固定速 度因此相对慢。使用对应给体的固定方法因此存在缺点，虽然使用更简单且减少了健康危 害。
[0010] 因此需要改进，特别是用于使用释放醛类的化合物固定组织样本的加速性能。
【发明内容】
[0011] 根据以上观点，本发明提出了一种用于固定组织样本的方法和组织处理机。
[0012] 本发明提供了一种用于固定至少一种组织样本的方法，所述方法使用组织处理机 进行且所述方法中将所述至少一种组织样本在第一温度水平和第一压力水平下引入包含 能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的固定试剂，所述至少一 种组织样本在所述固定试剂中停留至少固定时间段，其中将其中引入了所述至少一种组织 样本的所述固定试剂在所述固定时间段内带至高于所述第一温度水平的第二温度水平和/ 或高于所述第一压力水平的第二压力水平；和使用所述组织处理机的至少一个浓度测量装 置来确定所述固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种 含氮化合物的浓度，且基于所述至少一个浓度测量装置的测量值输出信号。
[0013] 本发明还提供了一种组织处理机，所述组织处理机具有至少一个处理室，所述处 理室构造为容纳具有引入至固定试剂中的至少一种组织样本的样本容器，所述固定试剂包 含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物，其特征为构造为进行 根据本发明实施例的用于固定至少一种组织样本的方法的工具，所述工具包括至少一个浓 度测量装置，所述至少一个浓度测量装置构造为确定所述固定试剂中能够依赖压力和/或 温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物的浓度和基于所述至少一个浓度测 量装置的测量值输出信号。
[0014] 在本发明的特征和优点的说明之前，将说明其原则和术语。
[0015] 为了表征压力和温度，本发明使用术语"压力水平"和"温度水平"，其用于表达的 事实是，在本发明的情况下，对应的压力和温度不需要以准确压力值和温度值的形式来分 别使用以实现本发明的构思。这样的压力和温度反而在特定范围内波动，该特定范围，例 如，大于或低于平均值的1%、5%、10%、20%或50%。特别地，例如，压力水平包括不可避 免的或期望的压力损失，例如由于冷却作用。温度水平也是如此。本发明以kPa表示的压 力为高于大气压的压力。
[0016] "能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的化合物"在本申请中理解为在适当溶 剂且与所述溶剂相互作用（特别是平衡反应）中形成至少一种醛作为产物的化合物。能够 依赖温度和/或压力释放至少一种醛的化合物代表对应平衡反应的离析物。在本发明的情 况下，特别地使用对应平衡反应位于离析物侧的这些化合物，即本身能够依赖压力和/或 温度释放至少一种醛的化合物。这样的化合物在溶剂中总是形成量为其从反应体系中被取 走的量的至少一种醛。如前面提到的，对应的反应原则上已知为用于固定组织样本。
[0017] 当前面提到的平衡的中心点和/或反应速率可通过压力和/或温度的改变被影响 为朝向产物或离析物时，释放是依赖压力和/或温度的。本发明的情况下，相关的化合物特 别为至少一种醛的形成可通过温度和/或压力的提高而被加速或增加的化合物。
[0018] 如以下还进一步说明地，对应的含氮化合物特别是通过形成氨和对应的至少一种 醛的络合物而形成。这些含氮化合物因此不是对应醛类的纯缩合产物和/或水合产物。特 别地，由此不包含诸如甲二醇的水合反应形成的化合物或诸如多聚甲醛的聚合产物。
[0019] 发明的优点
[0020] 本发明涉及用于固定至少一种组织样本的方法，该方法使用组织处理机进行，在 该方法中在第一温度水平和第一压力水平下将至少一种组织样本引入固定试剂。固定试剂 包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物，如上所述。如在常 规固定方法的情况下的，本发明中将至少一种组织样本在固定试剂中也停留至少固定时间 段。
[0021] 根据本发明提供的是，将其中引入了至少一种组织样本的固定试剂在固定时间段 内带至高于第一温度水平的第二温度水平和/或高于第一压力水平的第二压力水平。本发 明另外提供的是，固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化 合物的浓度使用组织处理机的至少一个浓度测量装置来确定，且基于该至少一个浓度测量 装置的测量值输出信号。
[0022] 因此，本发明的本质为通过压力和/或温度的应用以受控的方式从对应给体中释 放至少一种醛的方法。与现有技术相比本发明的重要优点是，受控条件（例如组织处理机 的封闭反应室内部）下对应醛的可控的释放。压力和/或温度的对应应用下，对应化合物 以放大的方式释放至少一种醛。化合物通过，例如通过一种或多种中间体，分解为至少一种 醛和氨。
[0023] 在没有压力和/或温度的对应应用的情况下，该至少一种醛不会定量释放且能够 依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物的分子结构非常稳定。对应化合物最好 的分解程度是该至少一种醛被至少一种组织样本消耗掉。
[0024] 在没有压力和/或温度的对应应用的情况下，与前面说明的常规福尔马林溶液相 比固定速度因此相对低。与常规福尔马林固定对应的反应速度或固定速度仅因为由于压力 和/或温度的应用的释放而获得。这另外消除了使用能够释放醛类的含氮化合物的已知现 有技术的重要缺点。在该常规方法中，如果固定太慢，存在所谓的"欠固定"的风险，这可导 致自溶。
[0025] 与用于福尔马林固定的常规方法相比，根据本发明提供的方法此外还适用于当使 用醛固定时明显降低以上提到的健康风险。当根据本发明在固定试剂中使用能够释放甲醛 的含氮化合物时，常规福尔马林固定方法的大部分可通过提出的方法再现。根据本发明进 行的至少一种醛的受控释放还优选是可逆的，即在低于第二温度水平和/或第二压力水平 的更低压力和更低温度下，能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物可再次 形成。游离醛的浓度由于平衡反应的移动而降低。这使将对应固定试剂存储在组织处理机 和/或存储容器中而不危害操作者的健康和固定之后经济地再生固定试剂是可能的。
[0026] 如提到的，甲二醇为释放甲醛的水合产物。在对应形成甲二醇的常规福尔马林固 定中，甲醛作为气体被直接引入水中。然而，在本发明的情况下使用的能够依赖压力和/或 温度释放至少一种醛的含氮化合物作为类似盐的物质引入水中，但是开始时具有非常小的 醛释放作用，或没有这样的作用。其（特别是低PH时）仅与消费者协同时才释放醛且在水 中形成例如甲二醇。对应水合产物因此以二级方式制备。其结果是，本发明的情况下至少 两种平衡反应（不包括中间体的反应）有利地组合，仅后一个平衡反应确保以常规福尔马 林的方式固定。
[0027] 能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物因此仅因为压力和温度 被分为中间体和最终产物。此外，温度和压力的增加可有利地促进或影响实际的福尔马林 固定。在约20°C之下，甲二醇在没有部分进料的情况下存在。以这种形式，其可比进给形式 更容易地渗入组织。20°C之上，进给形式更普遍。仅在后一种形式下，与蛋白质类的反应发 生至合适的程度。
[0028] 至少一种组织样本的均匀固定通过固定试剂完全渗入至少一种组织样本来达到。 该渗入可在第二压力水平和/或第二温度水平的必要压力和/或必要温度的应用之前或应 用过程中达到。本发明中有利的是使用最长时间，例如一小时，因为否则可发生自溶。
[0029] 根据本发明的方法有利地能够实现三步固定。首先将至少一种组织样本的组织全 部或部分渗透。然后至少一种醛通过应用压力和/或温度而释放，且固定发生。固定之后， 将固定试剂除去，例如抽回存储容器，在存储容器中固定试剂例如被冷却和/或减压且因 此再次变为无害的。
[0030] 至少一种醛的消耗导致固定试剂随着时间变为废弃的，使得其固定作用消失。在 常规福尔马林溶液中，甲醛的出气被另外观察和/