专利名称：大鼠睾丸高表达基因rDJL参与精子顶体形成的制作方法
技术领域：
本发明为一个在精子发生过程中参与网格蛋白(clathrin)复合体介导的囊泡转运和顶体形成的基因/蛋白(命名为rDJL基因/蛋白)，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白质的开发与应用领域。
背景技术：
大约半个世纪以前，Leblond和Clermont通过对曲细精管截面上不同发育阶段的精细胞顶体进行Schiff酸性染色，描述了曲细精管上皮细胞的周期性变化。曲细精管内生精细胞呈规律、有序的排列，为我们进行不同发育阶段的基因表达研究提供了较为理想的模型。
目前为止分离生精细胞群的方法有多种，曲细精管分段分离是经常采用且比较成熟的一种方法。大鼠的生精细胞在曲细精管排列极为有序大鼠睾丸每条曲细精管含有12个生精上皮波，每个生精上皮波由14个节段组成，不同节段中存在着不同发育阶段的精原细胞、精母细胞和各级精子细胞的组合。由于这种不同的细胞组合，于透光解剖镜下观察，不同节段的曲细精管呈现不同的光吸收度。即A段(II～VI期)呈现强斑点带，B段(VII～VIII期)呈现深黑带，C段(IX～XII期)呈现浅带，D段(XII～I期)呈现淡斑点带。据此分别截取A，B，C，D段曲细精管，收集于变性液中，以提取各段曲细精管组织RNA。在各段之间作差异展示RT-PCR得到差异表达EST。以这些EST作为探针，筛选大鼠睾丸cDNA文库，便可得到生精细胞不同发育阶段的特异表达基因。而分离并克隆精子发生阶段特异性基因，深入研究其功能是认识精子发生的基本策略之一，也是现代生殖生物学研究的热点之一。同时，深入了解与精子发生有关的差异基因表达及相应蛋白质的结构和功能，对人类的生殖健康、避孕疫苗的研制及男性不育的防治均有十分重要的意义。
rDJL基因就是采用曲细精管分段分离结合差异展示RT-PCR的方法得到的一条精子发生阶段特异性基因。该基因全长950bp，编码一个223氨基酸的蛋白。该蛋白质N端包含的保守J结构域，故该蛋白属于DnaJ蛋白家族。
DnaJ家族蛋白作为Hsp70蛋白的辅助分子伴侣发挥作用，并且为激活Hsp70ATP酶活性所必需。Hsp70-底物-DnaJ组成三蛋白复合物发挥作用，参与多种细胞功能，如辅助蛋白折叠、蛋白转运、参与信号转导、调控基因表达等。在胞质和亚细胞器中存在不同的Hsp70-DnaJ蛋白组合，形成特异的分子伴侣对协同发挥作用。Hsp70和DnaJ蛋白作为分子伴侣在哺乳动物精子发生过程中发挥重要作用。如睾丸特异表达的Hsp70-2为维持联会复合体的功能、CDC2与cyclinB1复合体形成所必需。该基因缺失会导致减数分裂无法完成而使生精过程受到阻滞[43]。目前已分离得到多种精子发生相关的DnaJ蛋白MSJ-1是睾丸特异的主要表达于单倍体阶段生精细胞的DnaJ蛋白，与mUBPy相互作用，在顶体形成和中心体组织过程中发挥功能。小鼠DiA1基因缺失会导致雄激素信号传导异常。因而，rDJL作为一种阶段特异表达的DnaJ家族成员，可能在精子发生过程中发挥重要作用。
发明目的克隆在睾丸曲细精管区段差异表达、在精子细胞发育过程中可能起重要作用的基因rDJL，表达其编码蛋白质，了解其转录与表达的时期，阐明其生理生化功能，更清楚地了解精子细胞的发生机理以及基因表达调控规律，从而为相关疾病的基因诊断和基因治疗以及新药筛选和抗生育研究提供可能的目标基因。
内容与要求应用曲细精管分段分离技术、差异显示逆转录PCR、斑点杂交、分子克隆、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、Northern印迹杂交、蛋白质表达与纯化技术、抗血清制备、免疫组织化学和免疫荧光技术、Western blot检测、细胞培养技术、以及激光共聚焦显微技术、免疫共沉淀技术等，克隆鉴定编码rDJL蛋白的新基因全长cDNA，通过Real Time PCR和Northern印迹杂交进行组织表达谱和睾丸发育阶段表达分析，纯化原核表达的目标蛋白质并免疫家兔制备抗血清，进而进行免疫组织化学和免疫荧光分析，综合运用细胞免疫荧光和激光共聚焦显微技术及免疫共沉淀技术初步确定rDJL基因/蛋白的功能。
该基因/蛋白达到的技术指标为1.rDJL基因cDNA序列全长950bp，GenBank接收号AF154849。此序列有一个669bp的开放阅读框，编码一个223氨基酸的蛋白质。位于131-133位的ATG是编码氨基酸的起始密码子，上游-9核苷酸处是框内终止密码。说明这段序列是一完整的全长cDNA序列。
2.rDJL蛋白N端3-69氨基酸构成经典的J结构域，因而属于DnaJ蛋白家族。
3.rDJL基因的表达具有组织特异性和睾丸组织发育阶段特异性。Real Time PCR结果显示该基因仅在大鼠睾丸、肝组织有转录表达，且在睾丸组织的表达水平远高于肝组织(见图1)。Northern印迹杂交结果显示，rDJL基因从生后30天的大鼠睾丸开始出现明显表达，以后逐渐升高，到60天达到成年水平，之后便保持在高水平直到120天(见图2)。
4.以rDJL阅读框3’端423bp片段(编码141个氨基酸)构建原核表达载体，在大肠杆菌中获得大量表达。经亲和纯化后产物免疫新西兰大耳白兔，制备了高滴度抗rDJL抗体(见图3)。
5.rDJL蛋白的表达具有精子发生周期的阶段特异性。rDJL蛋白从精母细胞开始出现表达，在精子细胞和成熟精子高表达，而在精原细胞中没有表达(见图4)。
6.rDJL蛋白在精母细胞中弥漫分布于胞浆，在精子细胞呈偏核分布，在成熟精子位于顶体区(见图5)。
7.EGF刺激细胞内吞后，rDJL-RFP融合蛋白在CHO细胞中呈囊泡状分布，且与网格蛋白(clathrin)呈完全共定位(见图6)。
8.免疫共沉淀验证rDJL蛋白与网格蛋白相互作用(见图7)，证明该基因及其编码蛋白质与网格蛋白介导的囊泡转运过程、精子顶体形成等生命现象密切相关。
图1.大鼠rDJL基因组织表达谱的Real Time PCR分析结果1脑，2骨骼肌，3心，4肠，5肾，6肝，7肺，8脾，9睾丸；结果显示在9种成年大鼠组织中，睾丸组织有最高水平的rDJL基因表达，肝组织有一般水平表达，其余组织表达量甚微或为阴性。
图2.大鼠rDJL基因在不同发育天龄的大鼠睾丸组织中表达情况的Northern印迹分析结果上图中从左到右依次为7、10、20、30、45、60、80、120天大鼠睾丸组织总RNA；下图β-actin对照结果显示出生后直到20天的大鼠尚无rDJL基因表达，30天、45天的大鼠均有rDJL基因表达，而60天即成年大鼠的睾丸rDJL基因表达量明显较高。
图3.pGEX-4T3-rDJL重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达图1低分子量蛋白质Marker；2未诱导pGEX-4T3-rDJL-BL21(DE3)菌体蛋白；3诱导的pGEX-4T3-rDJL-BL21(DE3)菌体蛋白；4纯化的GST-rDJL蛋白。
图4.免疫组化方法检测rDJL蛋白在大鼠睾丸组织的表达A.以抗rDJL抗体对大鼠睾丸组织切片进行免疫组化结果；B.免疫前血清对照可见rDJL蛋白在精原细胞和组织间质没有表达，而从精母细胞开始出现表达，在精子细胞和成熟精子中表达量明显增加，尤其在精子顶体区浓染。
图5.细胞免疫荧光观察rDJL蛋白在大鼠睾丸生精细胞内的亚细胞定位每组图从左到右rDJL，细胞核，叠加图上图精母细胞；中图精子细胞；下图成熟精子图中显示rDJL蛋白在精母细胞中弥漫分布于胞浆；在精子细胞浆中呈偏核一侧分布，类似于高尔基器在细胞中的定位特点；在成熟精子中，rDJL蛋白清楚地定位于顶体区，另外在精子尾也有分布。
图6.rDJL蛋白与网格蛋白(clathrin)在CHO细胞中的共定位研究RFP-rDJL和GFP-clathrin真核质粒共转染CHO细胞，EGF刺激后激光共聚焦显微镜观察。图中由左至右网格蛋白、rDJL、叠加图，Bar＝20μm图中显示EGF刺激诱导内吞后，可见网格蛋白(绿色荧光)和RFP-rDJL(红色荧光)均聚集成明亮的斑点，代表内吞小泡形成，照片叠加后二者在细胞中呈完全共定位。上述结果显示rDJL的功能与网格蛋白复合体介导的内吞过程密切相关。
图7.免疫共沉淀验证rDJL与网格蛋白(clathrin)相互作用将HA-rDJL和GFP-clathrin真核质粒共转染HEK293细胞。免疫共沉淀验证rDJL与网格蛋白(clathrin)相互作用。亲和抗体为抗HA抗体，印迹抗体为抗GFP抗体。1.实验组，网格蛋白能与rDJL蛋白共沉淀；2.阳性对照，转染后在HEK293细胞中表达的GFP-clathrin蛋白；3.阴性对照，将空质粒与GFP-clathrin质粒共转染HEK293细胞，网格蛋白未检出。
此结果表明rDJL能与网格蛋白(clathrin)相互作用。进一步证明rDJL参与网格蛋白介导的囊泡转运，因而其功能和精子发生过程中顶体形成有关。
具体实施例方式1.cDNA文库的筛选大鼠生精小管的不同节段的mRNA差异显示获取差异表达的EST，进行放射性标记并用作探针筛选Clontech Laboratories公司的大鼠睾丸λgt10 5’-stretch cDNA文库。斑点杂交法共筛选了1×106个克隆，采用噬菌体载体通用引物扩增阳性克隆的插入片段。扩增产物克隆入Promega公司的pGEM-TEasy载体并进行序列测定，获得一个全长为950bp的cDNA克隆。此序列有一个669bp的开放阅读框，一段130bp的5’非编码区和148bp的3’非编码区，编码一个223氨基酸的蛋白质。位于131-133位的ATG是编码氨基酸的起始密码子，上游-9核苷酸处是框内终止密码。说明这段序列是一完整的全长cDNA序列。将此基因命名为rDJL，并且提交至GenBank，获得接收号为AF154849。
2.RNA的制备、Real Time PCR和Northern印迹分析RNA的制备取成年大鼠一只。引颈处死后，快速切取睾丸、肌肉、肠、肝、肺、脾、脑、心、肾组织，装入1.5ml离心管，纱布包裹后迅速液氮冷冻。然后用钝器砸碎，称取100mg组织加入有1ml Trizol试剂(Life Technologies)的微量组织匀浆器中。分别取7天、10天、20天、30天、45天、60天、80天、120天龄的大鼠睾丸50-100mg(组织处理同上)置于加有1ml Trizol试剂的微量组织匀浆器中，按照Trizol试剂说明所述提取总RNA。
Real Time PCR采用Invitrogen SuperScript First-strand Synthesis System进行逆转录反应，合成cDNA。以RT产物为模板，进行RealTime PCR反应。反应条件50℃ 2min，95℃ 10min，60℃ 1min，共进行40个循环。PCR反应结束后采用Applied Biosystems SDS1.2软件进行数据分析。
Northern印迹分析采用甲醛变性的1％琼脂糖凝胶电泳，每个泳道上样所提组织总RNA 25μg，电泳结束后，用DEPC处理过的水淋洗凝胶数次，50mM的NaOH处理20min以水解RNA，无RNA酶的水淋洗数次，并用20X SSC浸泡凝胶45min，用20X SSC转膜16-20h，转移结束后，于6X SSC中漂洗滤膜，晾干，80℃干烤固定1-2h。室温存放待杂交用。
用PCR扩增rDJL片段，扩增片段回收、定量，探针标记DNA用量为25ng，采用随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim)对探针进行放射性标记，杂交液使用Clontech公司Express Hyb TMHybridization Solution。将杂交液68℃预热，使液体均匀。将Northern膜放入6X SSC中浸湿，然后置于杂交管中。固定有核酸的一面朝上，膜与杂交管之间勿留气泡，加入5ml杂交液，68℃预杂交30min。将标记探针于100℃处理10min，然后冰浴10min，继而与预热的杂交液混匀，加到杂交管中。68℃杂交1-2h。杂交结束后，小心将膜自杂交管中取出。置于2XSSC/0.5％SDS中室温洗三次，每次15min。然后再用0.1XSSC/0.1％SDS 68℃洗膜两次，每次20min。将湿膜置于保鲜膜内，压X光胶片，-70℃曝光(图1，图2)。
3.rDJL基因片段的原核表达及纯化将编码rDJL蛋白的C端的cDNA克隆到pGEX-4T3载体中，并用CaCl2法转化BL21细胞，经IPTG诱导后获得高效表达的GST-rDJL融合蛋白。
首先小量培养鉴定GST-rDJL融合蛋白表达水平及该融合蛋白在细胞内的表达形式，然后进行大量表达，自经过鉴定的质粒保存板中挑单菌落入100ml新鲜LB的锥形瓶(含氨苄青霉素100μg/ml)。37℃，剧烈摇动，培养过夜。将过夜菌液按1/10比例接种到一个含500ml LB(含氨苄青霉素)的2000ml锥形瓶中，37℃，剧烈摇动，培养1-1.5h，使菌液的A600nm值达0.4-0.6。加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达3-4h。收集培养液，5000rpm离心10min，弃上清。PBS洗菌体沉淀，用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10s/冷却20s/300W/20次的参数，超声破碎细胞。12000rpm离心20min，分别取少量上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，分析蛋白质在胞内表达形式。其余于-70℃冻存备用。
GST-rDJL融合蛋白的纯化采用Pharmacia公司纯化试剂盒进行。用预冷的3倍柱床体积PBS缓冲液平衡glutathione-Sepharose亲和柱后，4℃下将破菌液过柱。50～80倍柱床体积PBS缓冲液缓慢冲洗层析柱，用考马斯亮兰G250检测流出液至没有蛋白质为止。用还原型谷胱苷肽洗脱挂柱蛋白，收集洗脱液。取少量进行SDS-PAGE鉴定。(图3)。
4.rDJL抗血清的制备三只2kg重的新西兰大白兔。两只作为实验组，一只为对照。免疫前从耳缘静脉取0.5ml正常血清做对照。
将纯化的GST-rDJL蛋白与福氏完全佐剂混合，采用背部皮内多点注射，约20-30点。对照组取泡胶液与佐剂混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐剂混合进行加强免疫。酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度，Western Blot检测抗体特异性。
5.睾丸组织切片的免疫组织化学分析5μm厚睾丸组织冰冻切片，改良Bouin液固定10min。PBS洗2次，每次5min。3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)，室温封闭10min。倾去血清，滴加适当稀释的抗rDJL血清，4℃过夜。PBS洗3次，每次5min。滴加适当稀释的生物素标记二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC显色(4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1M乙酸缓冲液，pH5.2，加入15μl30％H2O2，过滤后即可)40min。自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。(图4)6.大鼠生精细胞涂片的制备取成年雄性大鼠一只，引颈处死。从腹腔取出睾丸，置于干净平皿中，用PBS洗净。去除白膜和血管后置于D-Hanks液中。吹打数次以使曲细精管分散。吸去D-Hanks液，加入1M甘氨酸，室温10min。弃去甘氨酸，加入胶原酶I，37℃ 15min以消化基底膜。弃去胶原酶I，加入D-Hanks液，吹打数次以使细胞分散。300目尼龙网过滤，滤液既为大鼠生精细胞。1500rpm离心5min，弃上清。PBS重悬细胞，取适量均匀涂布于载玻片，室温晾干。4％多聚甲醛室温固定10min，晾干。
7.细胞免疫荧光观察rDJL在大鼠睾丸生精细胞内的亚细胞定位封闭PBS洗涤5min×3次；0.5％TritonX-100/PBS透化，室温10min；PBS洗涤5min×3次；3％BSA/PBS封闭，37℃ 0.5hr，或4℃过夜，或室温1h。
一抗孵育除空白对照外，其他片子倾去封闭液；用PBS以1∶50稀释一抗，37℃ 0.5h，或4℃过夜，或室温1h；PBS洗涤5min×3次。
二抗孵育加以PBS 1∶50稀释的FITC标记二抗，37℃ 0.5h，或室温1h；PBS洗涤5min×3次。
Hoechst33258染核4min，PBS洗涤5min×3次。
封片ddH2O洗涤5min×2次，自然晾干；取10 1封片剂滴在载玻片上，用盖玻片封片，周围用指甲油封住。激光共聚焦显微镜观察(图5)。
8.以EGFR介导的内吞作用为例，应用细胞免疫荧光结合激光共聚焦技术进行共定位研究将rDJL克隆入pDsRed1-N1(Clontech公司)构建融合红色荧光蛋白表达载体；将网格蛋白(clathrin)克隆入pEGFP-N1(Clontech公司)构建融合绿色荧光蛋白表达载体并对重组质粒进行测序鉴定。将上述重组载体共同转染CHO细胞，进行Western blot和细胞荧光检测，确认两种融合蛋白得到表达。
将盖玻片分次置于浓酸中浸泡2小时，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理的盖玻片置于10倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5分钟后取出，置于60℃干燥1小时或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30分钟。
实验前两天将处理过的盖玻片放置于6孔培养板板中，将处于对数生长期的CHO细胞接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，37℃，5％CO2培养至70％饱和度。用50μl无抗生素无血清DMEM分别稀释3μg质粒和3.5μl Lipofectamine2000。室温放置2分钟后将稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温放置20分钟。将上述混合物滴加到6孔培养板中，37℃，5％CO2孵箱中继续培养。
转染后24小时将培养基换为无血清DMEM培养基，37℃，5％CO2培养6小时。
对于相应的实验组采用EGF诱导内吞作用取出经饥饿处理的细胞，6孔板置于冰上5分钟。加入rhEGF至终浓度为100ng/ml，冰上10分钟。将细胞置于37℃，5％CO2培养30分钟。
细胞免疫荧光1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10分钟。2)PBS漂洗，3×5分钟。3)去离子水漂洗，2×5分钟。4)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，周围用指甲油封住。5)用激光共聚焦显微镜观察(图6)。
9.免疫共沉淀验证rDJL蛋白与网格蛋白相互作用1)细胞的转染转染前两天将75cm2培养瓶中处于对数生长期的细胞以1∶3传入75cm2培养瓶中继续培养。待细胞长至70～80％时，将pcDNA6/V5-HisB-HA-rDJL(经本组改造，在pcDNA6/V5-HisB载体中加入了HA标签序列)与pEGFP-N1-clathrin用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞。以转染pcDNA6/V5-HisB-HA空质粒的细胞作为阴性对照。
2)细胞的裂解转染48h后收集细胞，每瓶中加入1.5ml裂解液。放置冰上裂解1h。其间追加一次PMSF，并且间隔10min用细胞刮搅动一次。细胞裂解物于4℃ 14000rpm离心20min，收集上清并冻存于-70℃。
3)免疫共沉淀向1ml细胞裂解液中加入10μl抗HA单克隆抗体，4℃振摇1h后再加入20μl protein Aagarose，4℃振摇过夜。Protein A agarose用NETN溶液漂洗后，重悬于50μl 1×SDS上样缓冲液中，100℃煮沸10min。
4)Western Blot检测行10％SDS-PAGE，然后用鼠源抗GFP抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行Western Blot检测。
10.全长rDJL cDNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列1AATTCCGGTCTTGGGGTGAAATTCAAACCTGTGAACCTGAGTAGTTGAACACCTTCCGTT6061CTGAAGTTATATGGAAATTCTTCAGAATCTCAACCCTGCATCTTGGTGGGGCCAGGCTAT 120121TTGAAGAAACATGGTGAACTATTACAAAGTACTCGGGGTGCCACAGGACGCGTCGTCCTC 1801 M V N Y Y K V L G U P Q D A S S S17181TGATATCAAGAAGGCTTTCCACCAGCTGGCTCTGCAGGTACACCCAGATAAGAACCCCGG 24018 D I K K A F H Q L A L Q V H P D K N P G37241AGACAGGGAAGCAGCCGAGGAGAAATTCAAGCAAGTCGCAGAAGCCTATCAAATTTTATC 30038 D R E A A E E K F K Q V A E A Y Q I L S57301TGATGCCAAGAAGCGAAAGGACTATGACAGGTCCCGATGGAGCCGGACCAAAGAGGAGCT 36058 D A K K R K D Y D R S R W S R T K E E L77361CATCAGGGGTGACGGCAGAGACGAAACCAATTGGGAAGAAGAAATATGCTCTCGGAGGCC 42078 I R G D G R D E T N W E E E I C S R R P97421ACGCCGCACCTTCCAGACGGTCATCGAAGATGAAGACCTTTTTTCAGGAGATTATTTATT 48098 R R T F Q T V I E D E D L F S G D Y L F 117481CACTGGTCCCATGACGCATTCCAGAAGAGGTTCTTCCAACTTCTTTACAGTCACCCCCAT 540118 T G P M T H S R R G S S N F F T V T P I 137541TATAGACACAGGGTTTTCTACTTTTGTGTCCCAAGAATCCAAATCGAGTCCCGATGACTC 600138 I D T G F S T F V S Q E S K S S P D D S 157601TGAAGCCTTTGTGCCGTATATAAGCCATGGAATGGGAAAGTTCAGACTGGTCACCACTTG 660158 E A F V P Y I S H G M G K F R L V T T C 177661TAGCCAGATAATGAATGGTAAGAGAGTTGTCACAAAGAGAGTTGTAGAGAACATTCAAGG 720178 S Q I M N G K R V V T K R V V E N I Q G 197721ACCAAAGAAAATAGAGAACGAACGGCTATTTCGTTGGAATCCCTCACGTGGTTGGAAATT 780198 P K K I E N E R L F R W N P S R G W K L 217781GATGGAAAATCCCTGCTCTTGATGACGAGAAATGACGTGTTGACGGGACTTCAGTTAAAA 840218 M E N P C S * 223841CTGGGGCCTGCTCTGAAAATCTATGAGTATCATGTAAAACCTCTTCAGACCAAGCATTTA 900901AAGAACATCTCTTCATAGTAAAATCACACTGAGGTCTCAGTCCTCAGCCG 950
权利要求
1.本发明涉及一个自大鼠睾丸曲细精管区段差异表达的、参与网格蛋白(clathrin)复合体介导的内吞作用的基因/蛋白，命名为rDJL基因/蛋白(GenBank注册号AF154849)。包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，编码蛋白质的氨基酸序列。其特征在于rDJL的cDNA全长为950bp，相应编码蛋白质有223个氨基酸。
2.根据权利要求1所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于该蛋白的氨基端第3-69氨基酸编码J结构域。
3.根据权利要求1、2所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于该基因的表达具有组织特异性和睾丸组织发育阶段特异性。该基因在大鼠睾丸组织呈高水平转录表达。大鼠于出生后20天其睾丸中尚无rDJL基因的转录表达，30天时可检出该基因的转录表达，至60天即成年大鼠，睾丸中rDJL基因呈明显高表达。
4.根据权利要求1、2、3所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于rDJL蛋白的表达具有精子发生周期的阶段特异性。rDJL蛋白在精原细胞和组织间质没有表达，而从精母细胞开始出现表达，在精子细胞和成熟精子中表达量明显增加，尤其在精子顶体区浓染。
5.根据权利要求1、2、3、4所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于该基因的编码蛋白在精母细胞中弥漫分布于胞浆；在精子细胞浆中呈偏核一侧分布，类似于高尔基器在细胞中的定位特点；在成熟精子中，rDJL蛋白清楚地定位于顶体区，另外在精子尾也有分布。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于rDJL蛋白可以与网格蛋白相互作用并参与网格蛋白复合体的功能。
7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述之rDJL基因/蛋白，其特征在于该基因及其编码蛋白的功能与精子发生中网格蛋白复合体介导的内吞、囊泡转运等生命现象密切相关，在抗生育领域以及新药的设计与开发中具有潜在的应用前景。
全文摘要
本发明涉及一个自大鼠睾丸曲细精管区段差异表达的基因，命名为rDJL基因(GenBank注册号AF154849)。内容包括rDJL的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，编码蛋白质的氨基酸序列；结构分析显示rDJL蛋白氨基端包含一个J结构域；Real Time PCR和Northern印迹分析结果表明，该基因的表达具有组织特异性和睾丸组织发育阶段特异性；免疫组化实验结果显示，rDJL的表达具有精子发生周期的阶段特异性；免疫荧光分析结果显示，该蛋白在成熟精子位于顶体区；运用细胞免疫荧光和激光共聚焦显微技术及免疫共沉淀技术，初步确定rDJL蛋白能够与网格蛋白(clathrin)相互作用，参与网格蛋白复合体介导的内吞作用。rDJL蛋白的功能与精子发生中的内吞和顶体形成密切相关，阐明其功能对了解生殖细胞的发生机理、研制抗生育药物具有重要意义。
文档编号A61K38/17GK1869222SQ20051007106
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者杨春波, 缪时英, 王琳芳, 杨居祥 申请人:中国医学科学院基础医学研究所