专利名称：一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因药物，尤其是指一种用于治疗乳腺癌、胃癌、口腔鳞癌、鼻咽癌等上皮来源肿瘤的基因药物，本发明还涉及该基因药物的制备方法。
背景技术：
传统的肿瘤治疗方法包括化疗、放疗和手术等，但从临床的治疗效果来看，都不能彻底根治肿瘤。而且由于放、化疗的非特异性杀伤作用，对机体的毒性较大，而且长期使用会产生肿瘤组织的治疗耐受。手术对早期肿瘤病人疗效明显，但由于很多肿瘤发现晚，无法实施，并且术后的复发和转移问题一直困扰着外科医生。如果抓住肿瘤细胞与正常细胞之间基因表达的不同，采用腺病毒介导转染的方法，调整肿瘤细胞内基因的表达，通过调控生理功能的方式，特异性地达到抑制肿瘤细胞的目的。这种所谓基因治疗的方法具有效率高、特异性强以及对正常组织毒性低的优点。自1990年美国NIH开展世界第一个基因治疗临床试验以来，在此后的十几年间，基因治疗作为一个给人类带来巨大希望的全新领域，其研究蓬勃发展，备受瞩目。截至目前，已有1020项基因治疗的临床试验在全世界5大洲23个国家开展。2004年，世界第一个肿瘤基因治疗药物在中国深圳诞生，使基因治疗作为一种新疗法应用于临床成为现实，使世界基因治疗的发展进入了一个新阶段。
为了开拓肿瘤治疗的基因药物，本发明的发明人采用一种特异性的肿瘤抑制基因14-3-3σ，并将其用目前认为基因治疗最为理想的载体腺病毒进行包装(即Ad-14-3-3σ)，且应用于临床各种上皮来源肿瘤的治疗。选用这一基因的原因在于14-3-3σ在正常人的上皮组织中表达，但在多种上皮来源的肿瘤如乳腺癌、胃癌、口腔鳞癌、鼻咽癌中表达减少、缺失或功能不全。我们以往研究表明14-3-3σ过表达可抑制Her2过表达的乳腺癌细胞株MCF-7和Her18的增殖和成瘤性，然而14-3-3σ能否抑制上皮来源的鼻咽癌细胞和Akt过表达的细胞，特别是乳腺癌MDA-MB-361细胞国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的其中一个目的在于提供一种治疗效果好、适用面广的一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物。
本发明的另一个目的是提供一种可大规模生产，成本低的上述基因药物的制备方法。
本发明的前一目的是这样实现的一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物，是由14-3-3σ基因与腺病毒的重组体。
上述一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物中14-3-3σ基因具有SEQ ID NO1序列。
本发明的后一目的是这样实现的使用RT-PCR方法获取14-3-3σ的cDNA序列，经测序无误后，体外PCR扩增其基因全长，用特异性的核酸内切酶切割扩增产物和腺病毒穿梭质粒，转染HEK293细胞株，进行重组病毒的包装即得。
本发明选用14-3-3σ进行肿瘤基因治疗，14-3-3σ基因的表达产物14-3-3σ蛋白具有抑癌途径广泛、抑癌作用确切并且不良反应小等优点。如抑制CDK2，CDK4和CDK1产生细胞周期的阻滞作用，使细胞周期停滞在G2/M期，直接抑制肿瘤增殖，并有利于增加放化疗的敏感性；14-3-3σ蛋白还能够调节抑癌蛋白p53的表达，增加后者活性产生抑癌作用；另外，14-3-3σ在p53有突变的肿瘤细胞中可以通过调节非p53依赖的Akt/PKB通路达到抑瘤的作用。14-3-3σ的基因片段较短，有利于获得有效的病毒重组体。
本发明选用腺病毒作为14-3-3σ基因转染的载体，腺病毒在基因治疗的应用有相对较长的历史，积累了很多成功的经验和失败的教训，对其生物学特性有较全面的了解，与其它一些病毒载体相比，具有安全(不会引起宿主染色体的突变)、转染效率高，承载外源基因量大、在体内可以长期维持活性等优点。因此，是目前已知基因治疗的最为理想的载体。
本发明中采用14-3-3σ基因重组腺病毒应用于肿瘤治疗，具有下述优点(1)重组腺病毒构建简单，可以大规模生产，降低成本，有很广阔的临床应用前景。
(2)腺病毒可以高效地将目的基因携带入肿瘤细胞内，并有效表达较长一段时间。
(3)对肿瘤细胞有特异的和高效的杀伤作用，并且不良反应小。
(4)对于上皮来源的肿瘤(占全部肿瘤的绝大多数)都有不同程度的抑制作用，应用面广。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明的14-3-3σ基因与腺病毒的重组流程示意图；图2 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞活性的影响(MTT法)；图3 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响(BrdU实验)；图4 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响(软琼脂克隆形成实验)；图5 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞在裸鼠成瘤性的影响图6 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响(流式细胞仪检测)；图7 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响(流式细胞仪检测)；图8 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响(DNA片段检测试剂盒)；图9 14-3-3σ对Akt和CDK2活性的影响(体外激酶分析法)；图10 乳腺癌组织中14-3-3σ表达及与磷酸化Akt表达的关系(免疫组化法)；图11 乳腺癌MDA-MB-361细胞14-3-3σ、p-Akt和p27等蛋白表达(Western Blot)；图12 14-3-3σ对Rat1-Akt细胞活性的影响(MTT法)；
图13 14-3-3σ对Rat1-Akt细胞增殖的影响(BrdU实验)；图14 14-3-3σ对Rat1-Akt细胞增殖的影响(软琼脂克隆形成实验)；图15 14-3-3σ对Rat1-Akt和MDA-MB-361细胞成瘤性的影响(半体内抑瘤实验)；图16 14-3-3σ对Rat1-Akt细胞的抑瘤作用(体内抑瘤实验)；图17 14-3-3σ对Akt蛋白、Akt磷酸化活性和磷酸化底物水平的影响(Western Blot)；图18 14-3-3σ对Rat1-Akt细胞p27定位的影响(免疫荧光)。
具体实施例方式
实施例1 14-3-3σ基因与腺病毒的重组参阅图1所示，使用RT-PCR方法获取14-3-3σ的cDNA序列，经测序无误后，体外通过PCR法扩增其基因全长，用特异性的核酸内切酶切割扩增产物和腺病毒穿梭质粒，构建携带14-3-3σ基因的穿梭质粒，将扩增的14-3-3σ基因与信号肽HA基因亚克隆到原核质粒PUC19，再利用Cla1和BamH1亚克隆到pQB1-AdCMV5(含腺病毒E1A)，与QB1-viralDNA进行共转染，阳性病毒克隆经PCR筛选，得到Ad-HA-14-3-3σ基因重组体，扩增，转染HEK293细胞培养，粗分离的14-3-3σ基因重组腺病毒经超离心纯化，除菌分装，添加剂加入，低温保存。
实施例2 14-3-3σ应用于低分化鼻咽癌的治疗1.四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测细胞活性用无小牛血清的RPIM1640培养液稀释至3×107cells/L的细胞悬液，再分别用MOI为5、10、15的Ad-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)转染细胞，并接种96孔培养板(100μl/well)，每组设5个复孔。置37℃，5％CO2浓度条件下培养2h，每孔加含20％小牛血清的RPIM1640培养液100μl，继续培养22h、46h、70h和94h后，加入3％MTT 20μl/well，37℃孵育4h，弃上清，每孔加入DMSO100μl，混匀15min后，检测590nm处的A值，并计算抑瘤百分率，即抑瘤百分率(％)＝(处理组A值-阴性对照组A值)/(对照组A值-阴性对照组A值)×100％。在同一条件下重复本实验3次，取其平均值为实验结果。MTT实验结果显示腺病毒介导14-3-3σ(MOI5、10、15)转染24h、48h、72h和96h均可抑制CNE2细胞的活性。其中，随着转染时间的延长，抑制作用更为明显，与转染相同MOI的Ad-βgal或PBS对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，且Ad-14-3-3σ在低浓度时就能对细胞活性产生明显抑制作用，剂量依赖关系不明显。结果表明14-3-3σ基因转染可抑制CNE2细胞的活性，且抑制作用呈时效关系，参阅表1和图2所示。
表114-3-3σ对鼻咽癌CNE-2细胞活性的影响(X±SD)％
2.BrdU实验检测细胞增殖能力5-溴-2′脱氧尿嘧啶(BrdU)标记及检测试剂盒购自Roche公司，实验程序参照试剂盒使用说明。即把经胰酶消化的对数生长期CNE2细胞放入有盖的培养玻片，分别用MOI为5、10的Ad--14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)转染细胞，置37℃5％CO2培养箱培养30h，待其长到50％满时，吸弃培养液，每孔加入200μl BrdU标记培养液(1∶1000)，37℃，5％CO2条件下培养15～30min，弃上清，每孔用洗液1ml洗涤，重复三次，再加入70％酒精和50mM MGlycin混合液(PH2.0)200μl，置-20℃条件下固定细胞，20min后，重复洗涤三次，加入抗BrdU的工作液(1∶10)200μl，置37℃，5％CO2条件下培养30min，重复洗涤三次，吸干洗液后，加入适量的计数液封片，于荧光显微镜下观察，随机选取5个视野，观察300个细胞中的阳性细胞数，计算BrdU标记阳性细胞百分率，即BrdU阳性细胞百分率(％)＝阳性细胞数/细胞总数×100％。
BrdU实验结果显示经MOI为5或10的Ad-HA-14-3-3σ转染的CNE2细胞BrdU阳性百分率分别为12％或42％；而用等量Ad-β-gal处理的CNE2细胞BrdU阳性率分别为86％或75％，PBS处理的CNE2细胞BrdU阳性率为99％，前者与后者比较差异有统计学意义(P＜0.05)，参阅图3所示。
3.软琼脂克隆形成实验测细胞增殖能力先把预热已融解的1％琼脂溶液与等量的含30％小牛血清双倍RPIM1640培养液混匀后，加入24孔板，铺好下层琼脂，然后用无血清的RPIM1640稀释细胞为2×104/ml，再用MOI为5、10、15的Ad-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)转染细胞，37℃孵育2h后，各取100μl放入含30％小牛血清的双倍RPIM1640培养液，同时与等量预热融解的0.8％琼脂溶液混匀，加入到铺有凝固下层琼脂的孔中，使每孔的细胞数为2000个，每孔设4个重复孔，把培养板放入湿盒，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养14d，每孔加入p-iodonitrotetrazolium violet(1mg/ml，PBS)溶液0.1ml进行染色，培养过夜，取出后置于4℃冰箱，待上层琼脂完全凝固后摄像和计算集落数。软琼脂集落形成实验结果也显示Ad-HA-14-3-3σ(MOI5、10和15)转染的细胞其集落数少于对照组(用PBS或Ad-β-gal(MOI5、10、15)处理后的细胞)(P＜0.05)，且MOI为5、10或15的Ad-HA-14-3-3σ转染组之间差别不大(p＞0.05)，参阅图4所示，这些均提示14-3-3σ的过表达可抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖能力。
4.Ad-14-3-3σ在体内对鼻咽癌的作用(动物实验)将4-5周龄的裸鼠分为五组，即MOI为5和10的Ad-HA-14-3-3σ治疗组、MOI为5和10的Ad-β-gal和PBS(等量)对照组，每组6只。用MOI为5、10的Ad-HA-14-3-3σ、Ad-β-gal和PBS(等量)转染CNE2细胞，48h后收集细胞，用DMEM培养液调细胞数为1×107/ml，每只裸鼠右颈背部皮下注入0.2ml的细胞悬液复制荷鼻咽癌裸鼠模型，然后每3天测量肿瘤的大小，以计算肿瘤的体积和抑瘤百分率，即肿瘤体积(mm3)＝L×W2/2；抑瘤率(％)＝(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％。另外观察各组小鼠肿瘤形成出现的时间。
实验组和对照组细胞在体外先经MOI为5和10的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS处理后，接种于裸鼠复制肿瘤模型，以观测14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞成瘤性的影响，结果发现两个Ad-HA-14-3-3σ实验组肿瘤体积均明显小于对照组(Ad-β-gal或PBS处理)(P＜0.05)。而Western blot结果发现肿瘤组织内14-3-3σ蛋白表达增多，提示14-3-3σ转染可抑制CNE2细胞的成瘤性，参阅表2、图5所示。
表2 14-3-3σ对鼻咽癌CNE2细胞在裸鼠成瘤性的影响(X±SD)％ 5.Ad-HA-14-3-3σ抑制鼻咽癌CNE2细胞机制的探讨5.1流式细胞术检测细胞周期的分布和凋亡峰分别用MOI为5、10和15的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)转染CNE-2细胞36h，经胰酶消化后收集细胞，离心、弃上清并用PBS洗涤细胞2次后，将2×106细胞重悬于0.1ml PBS中，在轻微振荡下，缓慢滴加3ml 70％酒精(4℃)固定细胞，4℃过夜，离心后弃上清，用PBS洗涤2次，再将细胞重悬于0.5ml PI染液中(50μg/mL PI，20μg/mL RNaseA溶于PBS，新鲜配制)，37℃孵育20min后用FACS检测。
用FACS检测发现Ad-14-3-3σ转染后，CNE-2细胞出现G2期细胞比例的增加，在MOI5、10和15浓度时G2期细胞比例分别为72.6％、72.6％和42.5％，与空白对照组(17.7％)相比明显增加；而使用MOI为5、10和15的Ad-β-gal作为重组腺病毒对照，当用MOI为5、10和15处理CNE2细胞时，其G2期细胞比例分别为19.7％、20.3％和16.4％，与空白对照组无明显差异(p＞0.05)。同时发现，14-3-3σ基因重组腺病毒转染组与空白对照组或Ad-β-gal对照组相比，sub-G1期的细胞比例增加，参阅图6所示，图中A为空白对照，B为β-Gal重组腺病毒5MOI、10MOI和15MOI组，C为14-3-3σ重组腺病毒5MOI、10MOI和15MOI。其中15MOI Ad-14-3-3σ组sub-G1期细胞比例增加尤为明显，高达19.8％。这些提示Ad-14-3-3σ转染CNE2细胞，可引起CNE2细胞G2期阻滞和凋亡，参阅图7所示。
5.2DNA裂解片段定量检测细胞的凋亡分别用MOI为5、10和15的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)处理CNE-2细胞16h，收集细胞(包括漂浮和贴壁细胞，加入RIPA)液在温室下作用30min以裂解细胞，然后离心，取上清并稀释细胞抽提液至合适的浓度，用细胞死亡ELISA试剂盒检测DNA裂解片段，以定量评价细胞的凋亡程度。具体操作程序参照DNA裂解片段定量试剂盒说明书。
分别用DNA裂解片断定量试剂盒检测细胞内DNA的断裂碎片来反映细胞凋亡水平。结果发现转染了Ad-14-3-3σ与转染Ad-β-Gal对照组或空白对照组比，DNA的断裂碎片明显增多(P值均小于0.05)，其中5MOI和10MOI组增多更为明显参阅图8所示。同时细胞周期检测显示，转染14-3-3σ实验组sub-G1期细胞比例增加，当MOI为15时，可高达19.8％参阅图7所示，图中AG2期细胞抑制率；B亚G1期细胞的比例。这些提示14-3-3σ转染可诱导CNE2细胞凋亡。
5.3体外激酶分析法检测CDK2和Akt活性先用Ad-HA-14-3-3σ(MOI＝5)处理细胞，对照组用Ad-β-gal(MOI＝5)或PBS(等量)代替，然后细胞经无钙PBS洗涤后，用约400μl RIPI缓冲液裂解细胞并加超声粉碎30sec。4℃离心收集上清。用DC蛋白定量试剂盒检测上清OD值，然后根据标准曲线计算样本蛋白浓度，取等量蛋白的细胞上清液，用抗Akt抗体和抗CDK2单抗做免疫沉淀，经洗涤后加入1μl含有10μCi[γ-32P]ATP的Flag-p27或GSK3β和HH1与沉淀的免疫复合物共培养，随后各组等量上样，电泳，经放射自显影显示磷酸化p27或GSK3β和HH1的水平。
采用体外激酶分析法检测14-3-3σ对细胞Akt活性和CDK2活性的影响，首先用抗Akt抗体或抗CDK2抗体作免疫沉淀，然后将带有放射核素32P标记的重组体纯化的p27和Gsk3β作为Akt激酶的底物，HH1作为CDK2激酶的底物，通过检测相应底物的磷酸化水平，以反映Akt激酶或CDK2激酶的活性。结果表明14-3-3σ可降低Akt激酶和CDK2激酶的活性，提示14-3-3σ的抑瘤作用可能是通过降低Akt和CDK2激酶活性而阻滞细胞周期和诱导凋亡来实现的，参阅图9所示。
实施例3 14-3-3σ应用于Akt过表达的肿瘤的治疗1.乳腺癌组织或细胞中14-3-3σ和p-Akt或p27等蛋白的表达及相互关系1.1免疫组化法检测患者乳腺癌组织中14-3-3σ及p-Akt蛋白的表达收集33例原发性乳腺癌患者的石蜡标本，制成切片。用二甲苯脱蜡至水后，将切片放入枸橼酸盐缓冲液中，调节pH至6.0，加热促进抗原修复。将单克隆抗体14-3-3σ(c-18)以1∶50稀释，滴入载玻片，置室温孵育1h，磷酸化Akt(ser473)按1∶100稀释，也加入载玻片孵育。然后用一般的免疫组化染色方案进行染色，使用ABC酶底物试剂盒标记蛋白，用苏木素复染载玻片，脱水、透明、封片。在显微镜下观察结果，阳性染色为细胞核呈棕黄色。在观察结果时，将载玻片上标记蛋白着色深浅程度分为1、2、3、4四个等级，标记蛋白着色的数量也分为0、1(阳性细胞＜10％＝、2(阳性细胞10％-50％)、3(阳性细胞＞50％)四个等级。以此为标准，结合着色深浅及染色细胞数量来综合判断，区分标记蛋白14-3-3σ和p-Akt是否为高表达或低表达。实验结果采用Fisher精确概率法进行统计学处理。
在33例乳腺癌标本中各切取了2张白片，分别用抗14-3-3σ和抗磷酸化Akt(ser473)单抗做免疫组化。按照标记蛋白高低表达的标准判读，并进行统计分析。33例乳腺癌标本中发现有14例14-3-3σ蛋白低表达(42％)。在这些14-3-3σ低表达的肿瘤中，75％磷酸化Akt高表达，P＝0.0024。另外在有14-3-3σ表达的肿瘤组织中，可见磷酸化Akt(ser473)表达降低，参阅图10中A图所示。这些结果显示乳腺癌中14-3-3σ的表达与磷酸化Akt(ser473)的表达呈负相关，参阅图10中B图所示。
1.2Western Blot方法检测乳腺癌MDA-MB-361细胞14-3-3σ、p-Akt和p27等蛋白表达肿瘤细胞经无钙PBS冲洗后，每碟用400μlRIPA缓冲液裂解细胞并加超声粉碎30sec。4℃离心收集上清。用DC蛋白定量试剂盒检测上清液OD值，根据标准曲线计算样本蛋白浓度，经RIPA缓冲液稀释调整蛋白浓度，每孔等量蛋白上样。采用polyvinylidine fluoride膜印迹蛋白，经ECL kit化学发光检测盒标记蛋白，把结果记录在Kodak X-omatic AR胶片上(Eastman Kodak Co，Rochester，NY)。
MDA-MB-361为一个HER2/神经过度表达的人乳腺癌细胞系，Western Blot方法检测结果显示与Rat1细胞相比，MDA-MB-361细胞Akt过表达，同时可见Akt磷酸化底物增多，14-3-3σ和p27的表达减少，其蛋白表达情况与Rat1-Akt细胞相似，参阅图11所示。
1.Ad-14-3-3σ在体外对Akt过表达细胞的作用(MTT法，BrdU、软琼脂集落形成实验)
2.1四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验测细胞活性胰酶消化对数生长期的细胞，用无小牛血清的DMEM培养液稀释至3×107cells/L的细胞悬液，再分别用MOI为5的Ad-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)转染Akt过表达的Rat1-Akt细胞，并接种96孔培养板(100μl/well)，每组设5个复孔。置37℃，5％CO2浓度条件下培养2h，每孔加含20％小牛血清的DMEM培养液100μl，继续培养22h、46h或70h后，加入3％MTT 20μl/well，37℃孵育4h，弃上清，每孔加入DMSO100μl，静置15min后混匀，检测590nm处的A值，并计算抑瘤百分率(％)。所得实验数据均在检测的线性范围之内。抑瘤百分率的计算公式(处理组A值-阴性对照组A值)/(对照组A值-阴性对照组A值)×100％。在同一条件下重复本实验3次，取3次实验的平均值为实验结果。
MTT实验结果显示腺病毒介导14-3-3σ(MOI5)转染24h，48h和72h均可抑制Rat1-Akt细胞的活性。其中，随着转染时间的延长，抑制作用更为明显，如在转染72h时，其抑制率接近100％；与转染Ad-β-gal或PBS对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，参阅图12所示。说明14-3-3σ基因的转染可抑制Rat1-Akt细胞的活性。
2.2BrdU实验检测细胞增殖能力(DNA的合成)5-溴-2′脱氧尿嘧啶(BrdU)标记及检测试剂盒购自Roche公司，实验程序参照试剂盒使用说明。把经胰酶消化的对数生长期的细胞放入有盖的培养玻片，分别用MOI为5的Ad-14-3-3σ、Ad-β-gal和PBS(等量)转染Rat1-Akt细胞，置37℃，5％CO2培养箱培养30h，待其长到50％满时，吸弃培养液，每孔加入200μl BrdU标记培养液(1∶1000)，37℃，5％CO2条件下培养15～60min，弃上清，用洗液1ml/well洗三次，再加入70％酒精和50mMMGlycin混合液(PH2.0)200μl/well，置-20℃条件下固定细胞，20min后，重复洗涤三次，每孔加入抗BrdU的工作液(1∶10)200μl，置37℃，5％CO2条件下培养30min，重复洗涤三次，吸干洗液后，加入适量的计数液封片，于荧光显微镜下观察，随机选取5个视野，观察300个细胞中的阳性细胞数，计算BrdU标记阳性细胞百分率，即等于阳性细胞数/细胞总数×100％。
BrdU实验结果分析显示Ad-HA-14-3-3σ转染细胞BrdU阳性率为45％，而对照组用PBS或Ad-β-gal处理后的细胞BrdU阳性率分别为100％或98％，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)，参阅图13所示。
2.3软琼脂克隆形成实验测细胞增殖能力先把预热已融解的1％琼脂溶液与等量的含30％小牛血清双倍DMEM培养液混匀后，加入24孔板，铺好下层琼脂，然后用无血清的DMEM稀释细胞为2×104/ml，再用MOI为5的Ad--14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)转染细胞，37℃孵育2h后，各取100μl放入含30％小牛血清的双倍DMEM培养液，同时与等量预热融解的0.8％琼脂溶液混匀，加入到铺有凝固下层琼脂的孔中，使每孔的细胞数为2000个，每孔设4个重复孔，把培养板放入盒，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养14天，取出后每孔加入0.1ml p-iodonitrotetrazolium violet(1mg/ml，PBS)溶液染色，培养过夜，取出后置于4℃冰箱，待上层琼脂完全凝固后摄像和计算集落数及集落的相对百分数(PBS处理组设为100％)。软琼脂集落形成实验结果也显示Ad-HA-14-3-3σ转染的细胞其集落数少于对照组(用PBS或Ad-β-gal处理后的细胞)，参阅图14所示，这些均提示14-3-3σ的过表达可抑制Rat1-Akt细胞的增殖能力。
3.裸鼠荷瘤模型观测14-3-3σ对Akt过表达细胞成瘤性的影响3.1半体内抑瘤实验(以反映14-3-3σ对细胞成瘤性的影响)将4-5周龄的裸鼠分为3组，即Ad-HA-14-3-3σ(MOI＝5)治疗组和Ad-β-gal或PBS对照组，每组6只。用MOI为5的Ad-HA-14-3-3σ、Ad-β-gal和PBS(等量)转染Akt过表达的Rat1-Akt和MDA-MB-361细胞，48h后收集细胞，用DMEM培养液调细胞数为1×107/ml，分别于每只裸鼠右颈背部皮下和乳腺的脂肪垫内注入0.2ml的细胞悬液复制荷Rat1-Akt裸鼠模型，然后每3天测量肿瘤的大小1次，以计算肿瘤的体积和抑瘤率，计算公式为肿瘤体积(mm3)＝L×W2/2；抑瘤率(％)＝(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％。另外观察各组裸鼠肿瘤形成出现的时间。
实验组和对照组细胞在体外先经Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS处理后，接种于裸鼠复制肿瘤模型，以观察肿瘤生长情况，结果发现转染Ad-HA-143-3σ实验组肿瘤体积明显小于对照组(Ad-β-gal或PBS处理)，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示14-3-3σ转染可抑制Rat1-Akt和MDA-MB-361细胞的成瘤性，参阅图15中A、B所示。
3.2体内抑瘤实验(以反映14-3-3σ抑瘤作用)将4-5周龄裸鼠分为5组，即3个MOI为5的Ad-HA-14-3-3σ治疗组，Ad-β-gal和PBS对照组，每组6只，每只裸鼠右颈背部皮下注入0.2ml细胞悬液(1×107/ml)，复制裸鼠荷瘤模型。其中治疗组又分为3组，即每天注射给药一次连续15次，每3天注射给药一次共5次和仅于接种肿瘤后第一天注射给药1次，对照组注射Ad-β-gal(MOI＝5)和PBS(等量)，每天一次。同样每三天测量肿瘤大小1次，计算肿瘤体积和抑瘤率，同时观察各组裸鼠肿瘤形成出现的时间。第15d后处死动物，取肿瘤组织用Western Blot方法测定14-3-3σ蛋白等表达的情况。
体内抑瘤实验结果也显示Ad-HA-14-3-3σ治疗组肿瘤体积明显小于对照组(Ad-β-gal或PBS处理)，其中每日给Ad-HA-14-3-3σ治疗的裸鼠15天后其肿瘤体积在50mm3以内，而每三日或每15日给一次Ad-HA-14-3-3σ治疗的裸鼠，其肿瘤体积分别为120mm3或180mm3，对照组Ad-β-gal或PBS处理其肿瘤体积都为250mm3，且三组不同时限给Ad-HA-14-3-3σ治疗组肿瘤出现时间较对照组晚，其中又以每日连续给Ad-HA-14-3-3σ治疗组肿瘤出现时间最晚，提示14-3-3σ有体内抑瘤作用，参阅图16所示。
4.Western Blot实验经无钙PBS冲洗后，称取约100mg肿瘤组织，剪成碎片后按1∶10(w/v)加入RIPA缓冲液裂解细胞并加超声粉碎30sec。4℃离心收集上清。用DC蛋白定量试剂盒检测上清液OD值，根据标准曲线计算样本蛋白浓度，经RIPA缓冲液稀释调整蛋白浓度，每孔等量蛋白上样。采用polyvinylidine fluoride膜印迹蛋白，经ECL kit化学发光检测盒标记蛋白，把结果记录在Kodak X-omatic AR胶片上(Eastman Kodak Co，Rochester，NY)。
用Western Blot方法测定肿瘤组织内14-3-3σ蛋白、Akt蛋白、Akt-473或308位点磷酸化及磷酸化底物水平，结果发现，每日一次连续瘤内注射给药15天治疗组裸鼠肿瘤组织中，有14-3-3σ蛋白的表达，而对照组(Ad-β-gal或PBS处理组)肿瘤组织中14-3-3σ蛋白表达缺如。这提示腺病毒转染14-3-3σ基因在Rat1-Akt细胞中成功表达.同时发现有14-3-3σ蛋白表达的肿瘤组织伴有Akt蛋白的减少，Akt-308位点磷酸化活性降低和Akt磷酸化底物水平的减少，而Akt-473位点磷酸化活性变化不大，参阅图17所示。这些提示14-3-3σ可抑制Akt蛋白的表达、Akt磷酸化活性和磷酸化底物的水平。
5.免疫荧光Rat1-Akt细胞分别用MOI为5的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)(对照组)处理，然后用甲醇∶丙酮(1∶1v/v)常温下固定2min后，以兔抗p27抗体孵育1h，再用与Alexa568交联的抗兔抗体(分子探针)孵育1h，以观测p27定位。为研究外源性HA-14-3-3σ的亚细胞定位，先加抗HA的单克隆抗体(12CA5，Babco)孵育1h后，再加与Alexa488交联的抗鼠二抗(分子探针)孵育1h。为使染色完全，以上细胞同时加入1μl(0.1μg/ml)4’，6二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI)(Sigma)孵育作核染色。用Axioplan 2型荧光显微镜(Zeiss)观测免疫荧光在细胞内的分布，以确定各蛋白分子的亚细胞定位。
采用免疫荧光法检测14-3-3σ对Rat1-Akt细胞内p27亚细胞定位的影响，结果发现经Ad-β-gal(MOI＝5)或PBS(等量)处理的Rat1-Akt细胞，48h时其p27大量存在于胞浆，14-3-3σ蛋白表达缺如；同时发现用腺病毒介导转染14-3-3σ基因48h后，在Rat1-Akt细胞内出现大量14-3-3σ蛋白表达的同时，细胞浆内p27的定位显著减少，而胞核的p27增多，参阅图18所示。结果提示，14-3-3σ可阻断Akt介导的p27在胞浆中的错位。
附件SEQ ID NO11gagagacaca gagtccggca ttggtcccag gcagcagtta gcccgccgcc cgcctgtgtg61 tccccagagc catggagaga gccagtctga tccagaaggc caagctggca gagcaggccg121 aacgctatga ggacatggca gccttcatga aaggcgccgt ggagaagggc gaggagctct181 cctgcgaaga gcgaaacctg ctctcagtag cctataagaa cgtggtgggc ggccagaggg241 ctgcctggag ggtgctgtcc agtattgagc agaaaagcaa cgaggagggc tcggaggaga301 aggggcccga ggtgcgtgag taccgggaga aggtggagac tgagctccag ggcgtgtgcg361 acaccgtgct gggcctgctg gacagccacc tcatcaagga ggccggggac gccgagagcc421 gggtcttcta cctgaagatg aagggtgact actaccgcta cctggccgag gtggccaccg481 gtgacgacaa gaagcgcatc attgactcag cccggtcagc ctaccaggag gccatggaca541 tcagcaagaa ggagatgccg cccaccaacc ccatccgcct gggcctggcc ctgaactttt601 ccgtcttcca ctacgagatc gccaacagcc ccgaggaggc catctctctg gccaagacca661 ctttcgacga ggccatggct gatctgcaca ccctcagcga ggactcctac aaagacagca721 ccctcatcat gcagctgctg cgagacaacc tgacactgtg gacggccgac aacgccgggg781 aagagggggg cgaggctccc caggagcccc agagctgagt gttgcccgcc accgccccgc841 cctgccccct ccagtccccc accctgccga gaggactagt atggggtggg aggccccacc901 cttctcccct aggcgctgtt cttgctccaa agggctccgt ggagagggac tggcagagct961 gaggccacct ggggctgggg atcccactct tcttgcagct gttgagcgca cctaaccact1021 ggtcatgccc ccacccctgc tctccgcacc cgcttcctcc cgaccccagg accaggctac1081 ttctcccctc ctcttgcctc cctcctgccc ctgctgcctc tgatcgtagg aattgaggag1141 tgtcccgcct tgtggctgag aactggacag tggcaggggc tggagatggg tgtgtgtgtg1201 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgcgcg cgccagtgca agaccgagat tgagggaaag1261 catgtctgct gggtgtgacc atgtttcctc tcaataaagt tcccctgtga cactcaaaaa1321 aaaaaaaaaa aaaaaa
权利要求
1.一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物，其特征是由14-3-3σ基因与腺病毒的重组体。
2.根据权利要求1所述一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物，其特征是14-3-3σ基因具有SEQ ID NO1序列。
3.权利要求1或2所述用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物的制备方法，其特征是使用RT-PCR方法获取14-3-3σ的cDNA序列，经测序无误后，体外PCR扩增其基因全长，用特异性的核酸内切酶切割扩增产物和腺病毒穿梭质粒，转染HEK293细胞株，进行重组病毒的包装即得。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗上皮来源肿瘤的基因药物及其制备方法，属基因药物领域，是出14－3－3σ基因与腺病毒的重组体。方法是使用RT－PCR方法获取14－3－3σ的cDNA序列，经测序无误后，体外PCR扩增其基因全长，用特异性的核酸内切酶切割扩增产物和腺病毒穿梭质粒，转染HEK293细胞株，进行重组病毒的包装即得。本发明的基因药物可实现大规模生产，成本低的优点，可用于乳腺癌、胃癌、口腔鳞癌、鼻咽癌等上皮来源肿瘤的治疗。
文档编号A61P35/00GK1915432SQ20051010212
公开日2007年2月21日 申请日期2005年12月7日 优先权日2005年12月7日
发明者杨惠玲, 夏云飞, 李梦宏, 黄文林, 苏勇, 夏洪平 申请人:中山大学