用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途
【专利摘要】本发明提供了一种用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途。在本发明的细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途中，所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。本发明的细胞培养组合物能够成功地对上皮来源的肿瘤细胞进行体外原代培养，大大地提高了上皮来源的肿瘤细胞原代培养的成功率，并且能够抑制癌组织中的间质细胞如成纤维细胞和内皮细胞的生长，例如，应用本发明所述的细胞培养组合物能在10天内使上皮来源的肿瘤细胞原代培养成功，培养的成功率大部分在80％以上；并基本上能稳定传代至8代以上，可成功建系。
【专利说明】用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体而言，涉及一种用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途、原代培养方法。
【背景技术】
[0002]目前肿瘤细胞培养技术中，对肿瘤细胞进行原代培养及建系最常用的技术是应用添加了 10%的胎牛血清(可简称FCS)的基础培养基对肿瘤细胞进行培养。但是目前应用该肿瘤细胞培养技术培养原代肿瘤细胞，其成功率非常低。例如，应用10% FCS+RPMI1640培养原代肺癌和前列腺癌细胞，其成功率均低于10%，能传代建系的成功率就更低。因此，目前肿瘤研究中多应用已经建成的细胞系。由于已建成的细胞系多经过了长期的体外培养和传代，它们 已丧失了很多肿瘤细胞原有的生物学特性，这极大地限制了肿瘤的生物学特性的研究。另外，肿瘤免疫治疗现在进展迅速，而自体肿瘤细胞疫苗无疑是最好的肿瘤抗原，但由于肿瘤细胞原代培养的困难性，限制了该技术的应用。
[0003]最近发展了应用无血清培养基培养脑胶质瘤细胞，使脑胶质瘤原代细胞培养的成功率有所提高。但是应用无血清或低血清培养基培养原代癌细胞，其成功率仍十分低下，多数不超过20%，且培养时间多需在I月以上。
【发明内容】
[0004]为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途、原代培养方法。
[0005]具体而言，本发明提供:
[0006](I) 一种细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途，其中所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
[0007](2)根据(I)所述的用途，其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系@角质细胞培养基n( stemline? Keratinocyte MediumI I)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一种。
[0008](3)根据⑴所述的用途，其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素 A 的 B27 添加剂(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。
[0009](4)根据(I)所述的用途，其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以I倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以
0.2-1倍的稀释比例使用。
[0010](5)根据⑴所述的用途，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及食管癌细胞中的一种。[0011](6)根据(1)-(5)中任意一项所述的用途，其中，所述的细胞培养组合物中还包含:表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种；
[0012]其中，如果存在的话，所述的表皮细胞生长因子的含量优选为5_50ng/ml ;所述的成纤维细胞生长因子的含量优选为2.5-50ng/ml ;所述的转化生长因子β的含量优选为2-10ng/ml。
[0013](7) 一种用于原代培养上皮来源的肿瘤细胞的细胞培养组合物，其包含:角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血
清。
[0014](8)根据(7)所述的细胞培养组合物，其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系@角质细胞培养基n( stemline? KeratinocyteMedium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一种。
[0015](9)根据(J)所述的细胞培养组合物，其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素 A 的 B27 添加剂(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。
[0016](10)根据(7)所述的细胞培养组合物，其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以I倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
[0017](11)根据(7)-(10)中任意一项所述的细胞培养组合物，其中，所述的细胞培养基还包含:表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种；
[0018]其中，如果存在的话，所述的表皮细胞生长因子的含量优选为5_50ng/ml ;所述的成纤维细胞生长因子的含量优选为2.5-50ng/ml ;所述的转化生长因子β的含量优选为2-10ng/ml。
[0019](12) 一种上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，其包括:使用根据(7)-(11)中任意一项所述的细胞培养组合物对所述的上皮来源的肿瘤细胞进行原代培养。
[0020](13)根据(12)所述的原代培养方法，其中，所述的原代培养方法包括以下步骤:
[0021]I)在体外用胶原酶对肿瘤组织进行消化，从而得到单个肿瘤细胞；以及
[0022]2)用所述的细胞培养组合物对步骤I)得到的肿瘤细胞进行培养，从而得到肿瘤细胞系。
[0023](14)根据(12)或(13)所述的原代培养方法，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞或食管癌细胞。
[0024]本发明的细胞培养组合物及上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果:
[0025]本发明的细胞培养组合物能够成功地对上皮来源的肿瘤细胞进行体外培养,特别是进行原代培养，并且大大地提高了上皮来源的肿瘤细胞的原代培养成功率，从而相应地克服了现有技术中癌细胞难以进行原代培养或培养成功率极低的缺陷，因此对肿瘤研究具有非常重要的现实意义和实用价值。例如，应用本发明所述的细胞培养组合物可使(例如)肺癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌的原代肿瘤细胞在10天内培养扩增成功，肿瘤细胞培养的成功率大部分在80%以上，最高可达100% ;并能稳定传代，成功建系。[0026]此外，本发明的细胞培养组合物还能够抑制癌组织中的间质细胞如成纤维细胞和内皮细胞的生长，从而选择性地培养癌组织中的肿瘤细胞。因此，本发明的细胞培养组合物使原代培养的癌细胞纯度非常高，解决了现有的原代培养的癌细胞中常常污染有大量间质细胞的问题。
[0027]本发明的上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，能在10天内使上皮来源的肿瘤细胞(包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌)原代培养成功，肿瘤细胞培育的成功率大部分在80 %以上，最高可达100 % ;并基本上能稳定传代至8代以上，可成功建系。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为试验例I中原代培养的4种类型的肺癌细胞的光镜图(200X，即200倍)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；其中，A为肺鳞癌；B为小细胞肺癌；C为大细胞肺癌；D为肺腺癌；
[0029]图2为试验例I中原代培养的前列腺癌细胞的光镜图(200X)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；
[0030]图3为试验例I中原代培养的乳腺癌细胞的光镜图(200X)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；
[0031]图4为试验例I中原代培养的食管癌细胞的光镜图(400X)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；
[0032]图5为试验例2中原代培养的肺鳞癌、肺腺癌及大细胞肺癌接种于小鼠皮下的示意图；其中A为大细 胞肺癌接种于小鼠皮下的示意图；B为肺腺癌接种于小鼠皮下的示意图；C为肺鳞癌接种于小鼠皮下的示意图；
[0033]图6为试验例3中肺腺癌细胞经免疫组化检测Ber-印4表达的光镜图(200 X)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的。
【具体实施方式】
[0034]以下通过【具体实施方式】的描述并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0035]在本文中，术语“上皮来源的肿瘤细胞”通常是指由上皮细胞演化而来的肿瘤细胞，如为良性肿瘤细胞通常称为瘤，如为恶性肿瘤细胞通常称为癌。本文所述的上皮来源的肿瘤细胞主要来源于哺乳动物。
[0036]在本文中，术语“角质细胞”也称为角化细胞、角质形成细胞，英文名称为:Keratinocyte，是指细胞内含有角蛋白的细胞，是上皮细胞的一种。所有的哺乳动物都含有角蛋白。例如，角质细胞所形成的天然高分子纤苎是头发的主要成分。
[0037]在本文中，术语“血清”的英文名称为Serum，指的是血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。血清的组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要如下:第一，血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；第二，血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；第三，不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。[0038]在本文中，术语“无血清培养基”的英文名称为:Serum FreeMedium(也可简称为SFM)，无血清培养基是无菌的液体培养基，并且不含血清。通常包含必需和非必需氨基酸、有机和无机化合物、微量矿物质等。大多数的无血清培养基产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。目前无血清培养基作为基础培养基被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。随着无血清培养技术的不断发展与完善，目前市场上各主要生物技术公司均推出了用于培养多种类型的细胞的无血清培养基的商业化产品，因此目前现有技术中应用最为广泛的用于培养各种不同类型的细胞的无血清培养基主要来源于商购渠道。但是本发明不限于此，本领域技术人员可以理解的是，当体外培养某一特定类型的细胞时，也可采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的各种常用的无血清培养基配方，或自行配制的与商购渠道获得的无血清培养基的主要组分相同或相似的无血清培养基。
[0039]在本文中，术语“角质细胞无血清培养基”(或称为培养角质细胞的无血清培养基)指的是一种专门为培养角质细胞用的无血清培养基，这类培养基主要用于培养人或动物的正常角质细胞。角质细胞无血清培养基可通过商购途径获得，例如，可得自美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Combo公司、美国Gibco公司或者上海艾研生物技术有限公司等，但是本发明不限于此；本领域技术人员可以理解的是，当体外培养角质细胞时，也可采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的各种常用的角质细胞无血清培养基配方，或自行配制的与商购渠道获得的角质细胞无血清培养基的主要组分相同或相似的角质细胞无血清培养基。例如，也可使用现有技术文献中公开的各种常用的角质细胞无血清培养基。例如，科技文献“Pittelkow, M.R.and Scott,R.E.NewTechniques for the Cultureof Human Skin Keratinocytes and In VitroPerspectives on Their Usefor Grafting of Patients with Extensive Burns.MayoClinic Proceedings.61:771-777(1986).”中公开的角质细胞无血清培养基，此外，本领域人员所公知的是，还可在常用的MCDB153培养基的基础上通过添加氨基乙醇、磷酸乙醇胺、碘甲腺氨酸钠并降低钙离子浓度等措施自行配制角质细胞无血清培养基。
[0040]在本文中，术语“神经细胞培养用无血清添加剂”(或称为培养神经细胞的无血清添加剂)指的是一类专门为使用无血清培养基培养神经细胞过程中需添加的添加剂，本领域技术人员所熟知的是，神经细胞培养用无血清添加剂通常可包括(但不限于):B27添加剂、N-2添加剂等。随着无血清培养技术的不断发展与完善，目前市场上各主要生物技术公司也推出了神经细胞培养用无血清添加剂的商业化产品，因此目前现有技术中应用最为广泛的神经细胞培养用无血清添加剂主要来源于商购渠道。例如，可得自美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Combo公司、美国Gibco公司等。但是本发明不限于此，本领域技术人员可以理解的是，当体外培养神经细胞时，也可采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的各种常用的神经细胞培养用无血清添加剂配方，或自行配制的与商购渠道获得的神经细胞培养用无血清添加剂的主要组分相同或相似的神经细胞培养用无血清添加剂。
[0041]在本文中，术语“B27添加剂”也称为B27添加物、B27?添加剂、B27?添加物、神经元细胞培养添加剂B-27，或简称为B27、B-27、B27?、B-27?等，是一种神经细胞培养中常用的无血清添加剂，适合应用于大多数神经细胞培养，例如，可用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。此外，B27还可以与Neurobasal?培养基或Neun)basal?-A培养基组合使用，用于神经细胞培养而不需要再添加饲养层细胞。B27为多种蛋白质、激素以及维生素的混合物，可通过商购途径获得，例如，可得自(例如)美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Gibco公司等。但是本发明不限于商购途径获得的B 27 ;本领域技术人员可以理解的是，也可以采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的与商购渠道获得的B27的主要组分相同或相似的添加剂配方。例如，包括但不限于以下科技文献:“Svendsen CN, Fawcett JW, Bentlage C,Dunnett SB.1ncreased survival of rat EGF—generated CNSprecursor cells usingB27supplemented medium.Exp Brain Res.1995 ；102 (3):407-14.”。
[0042]在本文中，术语“N-2添加剂”也称为N2添加剂，指的是化学成分确定的，不含血清的，基于Bottenstein’s的NI配方的添加剂。N-2添加剂主要用于神经细胞培养的基础培养基。它主要被推荐用于成神经细胞瘤以及周围神经系统(PNS)与中枢神经系统(CNS)的原代细胞培养中有丝分裂后期神经元的生长和表达。N-2添加剂可以替代Bottenstein’ s的NI添加剂。现有技术中通常用于添加了生长因子bFGF及EGF的神经细胞培养的基础培养基。N-2添加剂可通过商购途径获得，例如，可得自(例如)美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Gibco公司等。但是本发明不限于商购途径获得的N_2添加剂；本领域技术人员可以理解的是，也可以采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的与商购渠道获得的B27的主要组分相同或相似的添加剂配方。例如在美国Invitrogen公司生产的浓缩倍数为100的N-2添加剂的配方如表1所示:
[0043]表1
【权利要求】
1.一种细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途，其中所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系@角质细胞培养基n( stemline? Keratinocyte Medium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一种。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素 A 的 B27 添加剂(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以I倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及食管癌细胞中的一种。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的用途，其中，所述的细胞培养组合物中还包含:表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种； 其中，如果存在的话，所述的表皮细胞生长因子的含量优选为5-50ng/ml ;所述的成纤维细胞生长因子的含量优选为2.5-50ng/ml;所述的转化生长因子β的含量优选为2-10ng/ml。
7.一种用于原代培养上皮来源的肿瘤细胞的细胞培养组合物,其包含:角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
8.根据权利要求7所述的细胞培养组合物，其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系@角质细胞培养基II ( Stemline? Keratinocyte Medium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(DefinedKeratinocyte-SFM)中的一种。
9.根据权利要求7所述的细胞培养组合物，其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素 A 的 B27 添加剂(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。
10.根据权利要求7所述的细胞培养组合物，其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以I倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
11.根据权利要求7-10中任意一项所述的细胞培养组合物，其中，所述的细胞培养基还包含:表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种； 其中，如果存在的话，所述的表皮细胞生长因子的含量优选为5-50ng/ml ;所述的成纤维细胞生长因子的含量优选为2.5-50ng/ml;所述的转化生长因子β的含量优选为2-10ng/ml。
12.—种上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，其包括:使用根据权利要求7-11中任意一项所述的细胞培养组合物对所述的上皮来源的肿瘤细胞进行原代培养。
13.根据权利要求12所述的原代培养方法，其中，所述的原代培养方法包括以下步骤: 1)在体外用胶原酶对肿瘤组织进行消化，从而得到单个肿瘤细胞；以及 2)用所述的细胞培养组合物对步骤I)得到的肿瘤细胞进行培养，从而得到肿瘤细胞系O
14.根据权利要求12或13所述的原代培养方法，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺 癌细胞、前列腺癌细胞或食管癌细胞。
【文档编号】C12N5/09GK103966167SQ201310045008
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】高全立 申请人:高全立