专利名称：一种新的HER2/neu mRNA体外转录载体的构建及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种HER2/neu mRNA体外转录载体的构建，用途及其在HER2/neu阳性肿瘤预防和治疗中的应用。
背景技术：
HER2/neu是人类肿瘤常发生改变的一个癌基因，与肿瘤的发生、发展密切相关，是表皮生长因子受体(EGFR)家族的第二位成员。表皮生长因子受体家族，也称为HER或ErbB2家族，在细胞信号转导中发挥重要作用，是细胞生长、分化及存活的重要调节者。人HER2/neu基因定位于17号染色体短臂，表达产物为分子量185KDa的单链跨膜糖蛋白，即p185。
p185含有1255个氨基酸残基，细胞内段具有酪氨酸激酶活性，是一种酪氨酸激酶受体。正常情况下，与配体结合后，HER2/neu与EGFR、HER3(erbB3)或HER4(erbB4)形成异二聚体，导致这些受体的磷酸化，启动一个信号链导致下游信号分子的活化，调控细胞的生长。HER2/neu的过度表达能引起HER2/neu同二聚体的激活而无需配体的结合，从而引起不受控制的细胞生长和癌基因的转化。
通常情况下，HER2/neu只在胎儿时期表达，到成年以后，用免疫组化染色只能在极少组织内发现其低水平表达于细胞表面。在人类癌症，多种肿瘤组织均存在HER2/neu过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性肾细胞癌等。
大多数病例中HER2/neu过度表达是基因扩增引起的。HER2/neu基因的扩增导致HER2/neu基因转录增加，受体的合成增加，在细胞表面的表达增加。HER2/neu蛋白水平在HER2/neu阳性细胞表面比相邻的正常上皮高几个数量级。已知HER2/neu阳性状态与乳腺癌的预后较差有关，这种关系提示HER2/neu可能在癌的发生方面起关键作用。日益增多的证据支持HER2/neu可作为乳腺癌化疗和激素治疗的重要的反应预示指标。HER2/neu过度表达在乳腺癌细胞表面的发生率和已明确的预后价值，意味着HER2/neu代表一个新的重要的治疗靶点。
近年来以HER2/neu为靶点的抗肿瘤治疗在HER2/neu抗体、肽疫苗、DNA疫苗等方面取得一定进展。
HER2/neu抗体美国FDA已批准人源化的抗HER2/neu单克隆抗体-trastuzumab(Herceptin)用于治疗晚期乳腺癌。临床研究显示它能有效抑制体内HER2/neu高表达乳腺癌细胞的增殖，显著延长HER2/neu阳性乳腺癌病人的生存期。Herceptin或抗体4D5(针对HER2/neu的鼠抗体)能增强化疗药物对HER2/neu过表达肿瘤细胞的敏感性。Herceptin单药对转移性乳腺癌的有效率约15.0％，紫杉醇单药的有效率仅25.0％左右，而两药合用的有效率高达57.3％；4D5能使HER2/neu过表达细胞中的E-cadherin和整合素α2亚单位恢复至正常水平；另外4D5能降低VEGF的产生，因此抑制HER2/neu的功能还可能会抑制肿瘤的转移(Sliwkowski M.X.等，Semin Oncol，1999年，26期，第60-70页)。但HER2/neu抗体做为一种生物大分子具有渗透性差给药不方便和治疗费用昂贵不利因素。经典的化疗药的副作用如脱发、粘膜炎、血液系统毒性等在Herceptin单药时的发生率不到1％～4％，但高剂量下30％病例可见有中度的副作用如发热、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、头痛等。最令人担心的副作用是心脏毒性。Herceptin单药治疗时，4.7％的病人有心功能和心脏病理异常。
HER2/neu肽疫苗HER2/neu蛋白也是癌症主动免疫治疗的理想靶点，因为(1)HER2/neu蛋白与细胞恶性转化有关，是癌症病因学中一种生物学相关蛋白；(2)某些肿瘤病人存在HER2/neu特异性抗体或CTL，表明HER2/neu疫苗能诱导免疫反应；(3)已证明被动免疫疗法如HER2/neu抗体抗肿瘤作用，预测主动免疫可能也是有效的。Ikuta等人以小鼠HER2/neu来源的H2Kd限制性的肽HER2P780，致敏同基因小鼠DC(树突状细胞，dendritic cell)，可在小鼠体内诱导处HER2/neu特异性的CTL。并可有效抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。HER2/neu HLA-A2限制性表位E75已分别在美国和日本被批准进入临床试验。以E75致敏的自体树突状细胞皮下免疫。临床试验结果显示，E75致敏的自体树突状细胞在患者体内诱导出了特异性的免疫反应。
但肽类疫苗往往免疫原性较弱、局限于某些表位并受病人个体的单倍型限制，对肿瘤的治疗或预防意义有限。
HER2/neu的DNA疫苗DNA疫苗亦称基因疫苗或核酸疫苗，是指构建携带目的基因的重组真核表达质粒，将重组质粒做为疫苗通过各种方式导入动物体内，直接免疫机体，转染宿主细胞，使载体上的基因在体内持续表达出天然抗原物质，这些目的蛋白经正确的糖基化修饰等加工处理后，与主要组织相容性复合物(MHC)分子形成复合物并被提呈到细胞表面，诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫，尤其是能诱导产生细胞毒T淋巴细胞(CTL)。
Pilon等以表达HER2/neu的胞外区的DNA疫苗免疫小鼠，可以有效地在小鼠体内诱发特异性CTL应答，而且对HER2/neu阳性肿瘤细胞在体内生长有明显的抑制作用。但DNA疫苗普遍存在抗原基因表达量低，所诱导的免疫应答不足的缺点。
树突状细胞肿瘤疫苗是新一代的肿瘤疫苗，这种新型疫苗的的特点是采用机体内功能最强的抗原递呈细胞树突状细胞作为瘤苗载体(或称佐剂)，以肿瘤抗原体外冲击使其致敏，不仅可以保证肿瘤抗原被有效地摄取，而且可以提供所需的共刺激信号，显示了优于“常规”疫苗的前景。
树突状细胞(dendritic cell，简称为“DC”)是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞(APC)，DC系统作为机体内免疫反应的始动者和调解者，具有强大的激活CD8+CTL和CD4+T辅助细胞的能力，控制着体内免疫应答反应的过程，因而成为抗肿瘤免疫反应的中心环节。近年来随着体外大量扩增DC和制备DC疫苗技术的日趋成熟，采用DC疫苗进行抗肿瘤治疗已成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一。
目前已有许多研究均证明，mRNA致敏的DC体外可有效活化T淋巴细胞。Nair等将CEA mRNA通过简单孵育或脂质体介导转染DC后，诱导出了CEA特异性的T淋巴细胞。在此研究中，用嵌合型的CEA/LAMP-1 mRNA，不仅诱导出了CEA特异性的CD8+T淋巴细胞，而且诱导出了特异性的CD4+T淋巴细胞。Thornburg等以脂质体介导编码人乳头状瘤病毒E6和E7肿瘤抗原的mRNA致敏DC，诱导出了E6、E7特异性的细胞免疫应答(Thornburg C等，J Immunother，2000年，第23期，第412-418页)。Heiser等研究显示机体对某些特定抗原的耐受，并不是绝对的，通过有效地刺激是可以逆转的(Heiser A等，J Immunol，2000年，第164期，第5508-5522页)。编码前列腺特异抗原(PSA)的mRNA经简单孵育致敏DC后刺激外周血单个核细胞，被证明是一种治疗前列腺癌的有效地免疫治疗措施。如上所述，Su等在体外也诱导出了端粒酶特异性的T淋巴细胞(Su Z等，Cancer Res，2002年，第62期，第5041-5049页)。总之，这些研究均显示，mRNA致敏的DC是一种有效地免疫治疗措施。
1999年起，Gilboa等即开始了一系列的临床试验，以mRNA致敏的DC治疗肾癌及前列腺癌患者。他们进行的第一个临床试验是以体外转录的PSA mRNA通过简单共孵育致敏DC免疫激素难控的、转移性的前列腺癌患者。临床前研究显示，PSA mRNA转染的前列腺癌患者的DC体外可诱导出PSA特异性的T细胞反应。而且，男性或女性健康志愿者以及肿瘤患者来源的DC经PSA mRNA致敏后，均可有效地诱导PSA特异的CTL。提示自身耐受或肿瘤介导的T细胞无能均不是诱导自身抗原CTL的巨大障碍。而且有趣的是所诱导出的PSA特异性的CTL对与PSA高度同源的(60-80％同源性)血清中高丰度蛋白Kallikrein无交叉反应性。在此基础上，对16例激素难控的、转移性的前列腺癌患者进行了I期临床试验，间隔两周，逐渐增加PSA mRNA转染的DC用量。结果显示，此疫苗可被较好的耐受，未见明显的毒性作用，仅有轻微的I级皮肤反应和/或感冒症状。未见前列腺炎或其它的疫苗引起的自身免疫反应。所有完成整个治疗过程的患者体内均检测到了PSA特异性的T细胞免疫反应。7例进行评价的患者中6例PSA水平明显下降(HeiserA等，J Clin Invest.，2002年，第109期，第409-426页)。
接着Gilboa等进行了第二个I期临床试验，以自体肿瘤mRNA通过简单共孵育致敏DC后免疫转移性肾细胞癌(RCC)患者。临床前研究显示，RCC患者自体肿瘤RNA致敏DC后，体外可诱导出肿瘤特异性的T细胞反应。诱导出的CTL可特异性的杀伤RCC RNA转染的DC，但不能杀伤PBMC RNA或正常肾上皮RNA转染的DC。这种选择性的激活肿瘤特异性的而不是正常肾上皮特异性的CTL反应的特性，说明RNA致敏的DC疫苗可避免导致自身免疫性疾病的危险。在此基础上，对10例转移性肾癌患者进行了I期临床试验。结果显示，所有患者中未见治疗相关的副作用。未检测到自身免疫性病理反应，如脉管炎、甲状腺炎、心肌炎，或疫苗诱导的抗DNA抗体或抗线粒体抗体。在检测的6例患者中，5例检测到了肿瘤特异性的多克隆T细胞免疫反应。
目前用于临床试验的肿瘤抗原mRNA体外转录载体主要有两种Promega公司商业化的的载体pGEM4Z和美国Duke大学Gilboa实验室以载体pGEM4Z为基础自行构建的pGEM4Z/A64。
在以pGEM4Z为载体进行CEA mRNA的体外转录时，首先将CEA的编码序列插入pGEM4Z的多克隆酶切位点处，在CEA编码序列的下游以限制性内切酶BamHI将载体线性化。以线性化的载体为模板应用Ambion公司的体外转录试剂盒，体外转录带有7-甲基鸟嘌呤5’帽子结构的CEA mRNA。回收CEA mRNA，再用多聚腺苷酸聚合酶在其3’端加上polyA尾(长度较短)。纯化后即可用于致敏自体树突状细胞。
载体pGEM4Z/A64的构建是以载体pGEM4Z为基础，在限制性酶切位点EcoRI和NarI之间加入一段体外合成的64bp的poly(A-T)寡核苷酸构建而成。在pGEM4Z/A64的多克隆酶切位点处插入PSA的编码序列，即构建成PSA体外转录载体。其体外转录出的PSA mRNA 5’端带有7-甲基鸟嘌呤帽子结构，3’端带有较短的polyA尾。
目前以此两种载体体外转录出的PSA和CEA mRNA致敏自体树突状细胞，制备而成的肿瘤疫苗，已分别进入I、II期临床试验。
绝大多数真核细胞mRNA在3’-末端具有polyA(polyadenylic acid)。该PolyA尾是在转录后经polyA聚合酶的作用添加上去的。研究表明，polyA尾不仅与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关，而且还与mRNA的半寿期有关，新合成mRNA的polyA尾较长，而衰老mRNA的polyA尾较短。而通过现有技术，要合成较长并能与载体有效连接的polyA尾，仍具有很大的难度，而且成本高，故而使得polyA尾的有效长度受限。
综上所述，虽然近年来以HER2/neu为靶点的抗肿瘤治疗在HER2/neu抗体、肽疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗等方面取得了一定的进展。但是这些方法所存在的缺陷阻碍了它们在肿瘤治疗中的推广和使用HER2/neu抗体做为一种生物大分子具有渗透性差给药不方便、治疗费用昂贵、以及副作用明显等不利因素；肽类疫苗往往免疫原性较弱、局限于某些表位并受病人个体的单倍型限制，对肿瘤的治疗或预防意义有限；DNA疫苗则普遍存在抗原基因表达量低，所诱导的免疫应答不足的缺点；虽然mRNA疫苗可克服以上疫苗的缺点，但仍存在体内易降解、半寿期短的缺点。
因此，本领域急需开发出新的、具有较长半寿期的(尤其是通过连接较长的polyA尾来实现半寿期提高的)、用于致敏树突状细胞(DC)的抗肿瘤mRNA疫苗。
发明内容
本发明正是提供了一种新的、具有较长半寿期的、用于致敏树突状细胞(DC)的抗肿瘤mRNA疫苗，并提供一种新的HER2/neu mRNA体外转录载体的构建及其用途。
本发明的第一方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子包含以下元件(a)位于5’端的7-甲基鸟嘌呤帽子结构元件；(b)位于3’端的长度为110-200bp的polyA尾；(c)位于元件(a)和(b)之间的HER2/neu的编码序列。
在另一优选例中，所述的HER2/neu的编码序列具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的polyA尾的长度为120-180bp。
在另一优选例中，所述的核酸分子是DNA或mRNA。
本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有如上所述的核酸分子。在另一优选例中，所述的载体是质粒。
本发明的第三方面，提供了一种如上所述的核酸分子的用途，所述核酸分子用于制备致敏的树突状细胞。
在另一优选例中，所述致敏后的树突状细胞用于制备针对HER2阳性肿瘤的治疗性疫苗。
较佳地，所述的HER2阳性肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原发性肾细胞癌。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物或免疫组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体及赋形剂，以及如上所述的核酸分子或用如上所述的核酸分子所致敏的树突状细胞。
在另一优选例中，所述的核酸分子是mRNA。
本发明的第五方面，提供了一种体外转录载体的构建方法，所述的转录载体用于产生如上所述的核酸分子，所述方法包括步骤(1)通过PCR方法扩增出长度为110-200bp的polyA元件，并将多聚腺苷酸PCR产物poly(A-T)连接入转录载体，获得带有所述polyA元件的转录载体；(2)将HER2/neu的编码序列插入到步骤(1)中制备的带有所述polyA元件的转录载体，并且插入位置为所述polyA元件的上游，且与所述polyA元件的5‘端相距0-20bp，从而制得体外转录载体。
在另一优选例中，所述的HER2/neu的编码序列是SEQ ID NO1中151-2220位。
在另一优选例中，步骤(1)中所述的转录载体是pCI载体。
在另一优选例中，所述的polyA尾的长度为120-180bp。
图1为pMD-HER2/neu载体酶切鉴定图；图2为pCIpA150载体酶切鉴定图；图3为HER2/neu mRNA体外转录载体pHHX17酶切鉴定图；
图4为HER2-PDC小鼠体内诱导的CTL抗原特异性杀伤活性图。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现可以通过体外转录的方法获得HER2/neu mRNA，并且在其3’端带上长度较大(如110-200bp)的polyA尾可显著提高该mRNA在体内的半寿期，从而意外地获得了更好的致敏效果。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人以表达载体pCI(Promega公司)为基础，在限制性酶切位点HpaI处插入一段150A-Tbp的寡核苷酸，构建成体外转录载体pCIpA150，在其多克隆酶切位点Kpn I和Xho I间插入HER2/neu151-2220的编码序列，即构建成HER2/neu体外转录载体pHHX17。其中插入的HER2/neu序列编码HER2/neu的信号肽(1-21aa)、胞外段(22-652aa)、跨膜区(653-675aa)和部分胞内区(676-690aa)。其体外转录出的HER2/neu mRNA 5’端带有7-甲基鸟嘌呤帽子结构，3’端带有150bp长度的polyA尾。基因片段包含多个已被证明的CTL表位，同时又不包含其酪氨酸激酶活性区域，消除了其酪氨酸激酶活性，可用于修饰树突状细胞，并诱导产生针对HER2阳性肿瘤的特异性免疫应答，可用于HER2阳性肿瘤如乳腺癌等肿瘤的预防及治疗。在一优选例中，本发明人构建了一种新的HER2/neu mRNA体外转录载体，获得了所需的带有长达150bp的polyA尾的HER2/neu mRNA，并测定了经其致敏的树突状细胞在体内可显著诱导HER2/neu特异性细胞免疫应答的活性。
活性成分如本文所用，术语“HER2/neu”、“HER2”和“neu”可互换使用，都指GenBank登录号为M11730对应的核酸分子或编码的蛋白。在GenBank登录号为M11730中，HER2的ORF为151-2220bp。该ORF区域也示于SEQ ID NO1中。
如本文所用，“活性成分”是指“HER2/neu mRNA”、“HER2阳性肿瘤特异性mRNA”、“HER2/neu DNA”、“HER2阳性肿瘤的治疗性疫苗”和“致敏树突状细胞(DC)的抗肿瘤mRNA疫苗”(且各术语可互换使用)。本文所用的活性成分即，通过本发明构建的HER2/neu mRNA体外转录载体获得的HER2/neu mRNA。该mRNA的5’端带有7-甲基鸟嘌呤帽子结构，编码区包括信号肽、胞外段、跨膜区和部分胞内区，3’端为长达150bp的polyA尾，基因片段包含多个已被证明的CTL表位，同时又不包含其酪氨酸激酶活性区域，消除了其酪氨酸激酶活性，可用于修饰树突状细胞，并诱导产生针对HER2阳性肿瘤的特异性免疫应答，可用于HER2阳性肿瘤如乳腺癌等肿瘤的预防及治疗。
如本文所用，术语“树突状细胞”指用本发明的活性成分可致敏的并可在胞内含有导入的外源肿瘤抗原mRNA的树突状细胞。
药物组合物及给药方法利用本发明制备的HER2/neu核酸分子和载体，可以用常规方法制备HER2/neumRNA。
用本发明方法制备的mRNA疫苗可以广泛应用于预防和治疗各种HER2阳性肿瘤，代表性的例子包括(但并不限于)乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性肾细胞癌。
因此本发明还提供了一种用于预防和治疗各种HER2阳性肿瘤药物组合物，它含有安全有效量(如104-108个树突状细胞)的本发明上述的肿瘤抗原mRNA致敏的树突状细胞的细胞群，以及药学上可接受的载体、赋型剂和/或稀释剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约104-108个树突状细胞，更佳地为105-107个树突状细胞。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
在治疗和预防肿瘤时，本发明的树突状细胞可以单用，还可同时和其他治疗剂联用，如TNF-α、TGF-β、IFN-α、Angiostatin、Endostatin、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。
使用药物组合物时，是将安全有效量的肿瘤抗原mRNA致敏的树突状细胞施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常每天约104-108个树突状细胞，更佳地为105-107个树突状细胞。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于(a)本发明的HER2 mRNA在体内较稳定，具有较长的半寿期；(b)本发明的HER2 mRNA致敏的DC疫苗的抗肿瘤谱广，特异性强。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1HER2/neu151-2220cDNA片段的克隆1.反转录收集生长状态良好的HER2/neu阳性的人乳腺癌细胞株SK-BR-3(购买自ATCC，No.HTB-30)，用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取细胞总RNA，在oligo-dT(Takara公司)的引导下，利用AMV逆转录酶(Progema公司)完成。
在200μl无RNase PCR反应管中加入总RNA 1.2μl、oligo-dT 1.0μl和无RNase水7.8μl，混匀，离心，置65℃水浴10分钟，迅速置冰上冷却5分钟，然后在上述反应体系中加入5×缓冲液(AMV)4μl、10mM dNTP 1μl、AMV 1μl和无RNase水4μl，混匀后，42℃孵育1小时，72℃10分钟，加入80μl水。
该反转录产物可直接作为模板用于扩增目的基因片段。
2.PCR扩增以上述反转录产物为模板，用PCR方法克隆HER2/neu cDNA目的片段。
克隆目的序列的引物序列为5’-CAGTGAGCACCATGGAGCTGG-3’(SEQ ID NO2)和5’-TCACAGTCTCCGCATCGTGTACTTCC-3’(SEQ ID NO3)。
在200μl PCR反应管中依次加入反转录产物1μl、dNTP混合物4μl、引物各1μl、2×GC缓冲液12.5μl、LATaq酶0.25μl、水4.95μl，混匀，离心，在PCR仪(PTC-200，MJ Research公司)上完成反应。
反应参数为95℃1分钟；94℃30秒；58℃30秒；72℃2分钟；30个循环；72℃10分钟。
3.连接和转化回收PCR产物。将人HER2/neu cDNA目的片段克隆入pMD18-T载体(Takara公司)。利用T4 DNA连接酶将HER2/neu cDNA目的片段连入T载体。
在200μl PCR反应管中依次加入T4 DNA连接酶0.5μl、10×连接酶缓冲液1μl、pMD18-T载体0.5μl、HER2/neu基因片段8μl，混匀后，连接反应产物在16℃过夜。然后将连接反应产物转化DH5α大肠杆菌感受态，涂板，待克隆长出后，挑单克隆接种2ml Amp+的LB溶液，摇菌过夜，抽提质粒。
4.鉴定质粒应用XbaI/HindIII双酶切进行鉴定。
在1.5ml的离心管中依次加入小量制备的质粒5μl、10×缓冲液M 1μl、XbaI 0.5μl、HindIII 0.5μl和水3.0μl。37℃温育1小时，进行琼脂糖凝胶电泳，能切下片段即为阳性克隆，并将此载体命名为pMD-HER2/neu。pMD-HER2/neu载体酶切鉴定结果见图1。
实施例2体外转录载体pCIpA150的构建1.多聚腺苷酸(polyA)的扩增通过PCR方法扩增出150bp的寡核苷酸polyA。
模板质粒HNA6G1(购自第二军医大学免疫学研究所)。
扩增引物(由上海生工生物公司合成)序列为5’-ACAGGCCTCCACTCCGTTTGCTG-3’(SEQ ID NO4)和5’-CCTCGAGGGATACTCTAGAGCG-3’(SEQ ID NO5)。
在200μl PCR反应管中依次加入质粒1μl(浓度为100ng/μl)、dNTP Mixture4μl、引物(浓度为10μM)各0.5μl、10×Pyrobest缓冲液2.5μl、Pyrobest Enzyme 0.125μl和水16.375μl。混匀后，在PCR仪上完成反应。
反应参数95℃1分钟；94℃30秒；58℃30秒；72℃30秒；25个循环；72℃10分钟。
反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物回收。
2.pCI载体的酶切用Hpa I酶(Takara公司)对载体进行酶切。
在1ml PCR反应管中依次加入小量制备的pCI载体质粒(Progema公司)5μl、10×缓冲液K 1μl、Hpa I Enzyme 0.5μl和水3.5μl。混匀后，37℃温育1小时，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
3.多聚腺苷酸PCR产物连接入pCI载体利用T4 DNA连接酶(Takara公司)将多聚腺苷酸PCR产物poly(A-T)连接入pCI载体。
在200μl PCR反应管中依次加入T4 DNA连接酶0.5μl、10×连接酶缓冲液1μl、pCI载体/Hpa I 1μl、多聚腺苷酸PCR产物7.5μl。连接反应产物在16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，摇菌过夜后，使用抽提质粒。
4.鉴定用限制性内切酶EcoR I和BamH I(Takara公司)进行酶切鉴定，阳性插入质粒记为pCIpA150。pCIpA150载体酶切鉴定结果见图2。
实施例3HER2/neu mRNA体外转录载体pHHX17的构建1.载体pCIpA150的酶切用Xho I/Kpn I(Takara公司)双酶切载体pCIpA150。
在1.5ml的PCR反应管中依次加入小量制备的质粒5μl、10×缓冲液M 1μl、Hpa I Enzyme 0.5μl、Kpn I Enzyme 0.5μl和水3μl。混匀，37℃温育1.5小时，进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段。
2.载体pMD-HER2/neu的酶切用Kpn I和Sal I双酶切。
在1.5ml的PCR反应管中依次加入小量制备的质粒5μl、10×缓冲液T 1.5μl、Sal I Enzyme 0.5μl、Kpn I Enzyme 0.5μl、和水2.5μl。混匀，37℃温育1.5小时，进行1％琼脂糖凝胶电泳，37℃温育1.5小时，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
3.HER2/neu mRNA体外转录载体pHHX17的构建使用T4DNA连接酶将载体酶切后胶回收的pCIpA150载体片段和HER2/neuDNA片段连接。
在1.5ml的PCR反应管中依次加入T4 DNA连接酶0.5μl、10×连接酶缓冲液1μl、pCIpA150酶切回收产物2μl、HER2/neu DNA片段6μl和水0.5μl。混匀，连接反应产物在16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，摇菌过夜后，质粒抽提。
用限制性内切酶EcoR I/Kpn I进行双酶切鉴定，在1.5ml的PCR反应管中依次加入小量制备的质粒5μl、10×缓冲液M 1.0μl、EcoR I Enzyme 0.5μl、Kpn IEnzyme 0.5μl和水3.0μl。混匀，37℃温育1.5小时，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察(见图3)。
酶切鉴定阳性的克隆采用末端终止法进一步进行测序鉴定。使用ABI PRISMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit测序试剂盒(Perkin-Elmer)，数据采集及分析使用AB1377型全自动测序仪。结果显示，已经插入了所设计的HER2/neu151-2220以及150bp长的polyA序列，测定正确的克隆记为pHHX17。
实施例4HER2/neu mRNA的制备1.体外转录载体pHHX17的线性化载体经限制性内切酶Mun I酶切后，采用PCR产物纯化试剂盒回收线性化的载体pHHX17。紫外分光光度仪检测线性化载体的浓度，不低于500μg/ml。
2.HER2/neu mRNA的体外转录用T7RNA聚合酶体外转录HER2/neu mRNA。
3.HER2/neu mRNA的纯化体外转录所得的产物通过乙酸胺沉淀和Oligo(dT)-Cellulose Type 7亲和层析柱进一步纯化，再经乙酸钠及乙醇沉淀后，溶于无RNAase水中即为HER2/neu mRNA制品。
紫外分光光度仪检测mRNA浓度为500ng/μl，纯度OD260/OD280为1.79。
实施例5树突状细胞的培养及致敏1.骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)的获得颈椎脱位法处死HLA-A2.1/Kb转基因小鼠，无菌取股骨，用一次性1ml注射器冲洗出骨髓细胞。1000×g，离心5分钟，弃上清，用剩余的液体弹起沉淀，加入2ml Tris-NH4Cl溶去红细胞，迅速加入无血清1640，1000xg，离心5分钟，弃上清，加入抗Ia、B220、CD4、CD8单抗(终浓度均为10μg/ml)及补体(10∶1稀释)，37℃水浴45分钟溶除T、B及Ia+细胞，洗两次后，以1×107个细胞/孔加入6孔板培养，加mGM-CSF 10ng/ml、mIL-41ng/ml，(Peprotech公司)培养3天后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入新鲜RPMI1640完全培养基及mGM-CSF、mIL-4，继续培养2天后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，即为富集的骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)。
2.HER2/neu mRNA致敏的树突状细胞(HER2/neu mRNA Pulsed HumanDendritic Cells，HER2-PDC)的获得将收集的DC用无RNase的PBS洗两遍，调细胞浓度为1×107个/ml。取200μl加入4mm电击杯中。同时加入5μg HER2/neu mRNA，冰上放置10分钟。应用Bio-Rad电穿孔仪Gene Pulser Xcell进行电穿孔，参数为500V，300μs。电穿孔后，立即小心加入树突状细胞完全培养基中。4小时后加入20ng/ml TNF-α(Peprotech公司)，37℃继续培养至48小时。用50ml离心管收取HER2/neu mRNA转染，并用TNF-α成熟化的树突状细胞悬液，1000×g离心5分钟，收取细胞。再加入40ml无菌生理盐水，1000×g离心5分钟洗涤，连续3次。收集细胞即为HER2/neu mRNA致敏的树突状细胞(HER2/neu mRNA Pulsed Human Dendritic Cells，HER2-PDC)。
实施例6HER2/neu mRNA致敏的树突状细胞诱导的HER2/neu特异性细胞免疫用无菌生理盐水调细胞浓度为1×106个/400μl，体内免疫前钴60照射(30Gy)。
分组处理将6～8周HLA-A2.1/Kb转基因小鼠随机分为3组，每组10只，分别腹腔注射处理(每只小鼠共免疫三次，间隔一周)第一组，HER2/neu mRNA致敏的树突状细胞(1×106个/鼠)；第二组，未经致敏的树突状细胞(1×106个/鼠)；第三组，400μl生理盐水。
HLA-A2.1/Kb转基因小鼠末次免疫后7天，无菌操作摘取小鼠脾脏，制成单细胞悬液。脾细胞悬液(2×106个/ml)与HER2-PDC以10∶1比例置于RPMI 1640完全培养基中培养。7天后，收集效应细胞，进行特异性杀伤活性测定，采用标准的4小时51Cr释放实验。
靶细胞分别用人结肠癌细胞系SW620(购买自ATCC，ATCC No.CCL-227，HLA-A2.1+及HER2/neu+)、阳性对照负载HER2/neu HLA-A2.1限制性表位E75(对应于HER2/neu基因产物的369-377位氨基酸，KIFGSLAFL)、无关对照表位CAP-1(YLSGANLNL)的T2细胞及未加负载的T2细胞作为靶细胞。
首先进行靶细胞的标记，将靶细胞浓度调至1×106个/ml，加入Na251CrO4(Amersham公司，100μCi/106个细胞)，置37℃水浴中标记90分钟，无血清RPMI 1640洗3遍，彻底洗去残余Na251CrO4，标记好的靶细胞用完全培养基调整细胞浓度为1×105个/ml，加入96孔圆底板，每孔100μl。按50∶1、25∶1、12.5∶1三个不同效靶比加入相应的效应细胞，混匀，500×g离心5分钟，37℃孵育4小时，收集各孔上清各100μl，用γ计数仪检测cpm值，结果用三复孔均值表示。最大释放组各孔为单独的靶细胞加100μl 2％Triton X-100；自发释放孔为单独的靶细胞加100μl完全培养基。
杀伤率％＝(实验组cpm-自发释放组cpm)/(最大释放组cpm-自发释放组cpm)结果见图4。
结果表明采用HER2/neu mRNA致敏的小鼠树突状细胞免疫的小鼠的T细胞可以杀伤负载HER2/neu HLA-A0201限制性T细胞表位E75的T2细胞，和表达HLA-A0201和HER2/neu的小鼠肿瘤细胞SW620，但不杀伤负载无关抗原肽CAP-1、表达HLA-A0201的T2细胞以及未负载抗原的T2细胞，表明采用HER2/neumRNA致敏的树突状细胞可以诱导出HER2/neu特异性的细胞免疫，用于HER2/neu阳性肿瘤的治疗和预防。因此，HER2/neu mRNA致敏的树突状细胞能够在小鼠体内有效诱导HER2/neu特异性细胞免疫应答。
实施例7不同长度polyA对致敏效果的影响比较组(1)按实施例1所述方法制得HER2/neu151-2220cDNA片段的克隆；(2)利用T4 DNA连接酶(Takara公司)将人工合成的长度为40bp、或50bp的poly(A-T)连接入pCI载体，经连接、转化、酶切鉴定，获得阳性插入质粒记为pCIpA40和pCIpA60；(3)按实施例3、4、5、6所述的方法对所得比较mRNA进行特异性杀伤活性测定；(4)将比较组杀伤率％与采用了pCIpA150载体的HER2/neu mRNA的杀伤率％进行比较。
结果显示，采用带有40bp和50bp长度polyA尾的比较HER2/neu mRNA致敏的小鼠树突状细胞免疫的小鼠T细胞对HER2/neu特异性细胞的杀伤率％仅为带有150bp长度polyA尾的HER2/neu mRNA的40-60％。
结果提示，带有较长的150bp的polyA尾时，HER2/neu mRNA不易降解且半寿期延长，从而更有效地进行转录和表达并致敏树突状细胞，因此获得了更好的诱导HER2/neu特异性细胞免疫应答的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海海欣生物技术有限公司<120>一种新的HER2/neu mRNA体外转录载体的构建及其用途<130>059024<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2070<212>DNA<213>寡核苷酸<220>
<221>CDS<222>(1)..(2070)<400>1atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag96Pro Pro Gly Ala Ala Set Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac etg gaa ctc acc tac192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Ash Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag gac aac tat336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga gac ccg ctg aac aat acc acc cct384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag480
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc cac aag aac528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175aac cag ctg gct ctc aca ctg ata gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt624His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205tct gag gat tgt cag agc ctg acg cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt672Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc act gac tgc tgc cat gag cag tgt720Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc768Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255cac ttc aac cac agt ggc atc tgt gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc816His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270acc tac aac aca gac acg ttt gag tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg864Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg act gcc tgt ccc tac aac tac ctt912Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300tct acg gac gtg gga tcc tgc acc ctc gtc tgc ccc ctg cac aac caa960Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320gag gtg aca gca gag gat gga aca cag cgg tgt gag aag tgc agc aag1008Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt ctg ggc atg gag cac ttg cga gag1056Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350gtg agg gca gtt acc agt gcc aat atc cag gag ttt gct ggc tgc aag1104Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac1152Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc cag cca gag cag ctc caa gtg ttt1200Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400gag act ctg gaa gag atc aca ggt tac cta tac atc tca gca tgg ccg1248Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415gac agc ctg cct gac ctc agc gtc ttc cag aac ctg caa gta atc cgg1296
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430gga cga att ctg cac aat ggc gcc tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg1344Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga1392Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460ctg gcc ctc atc cac cat aac acc cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg1440Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac ccg cac caa gct ctg ctc cac act1488Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495gcc aac cgg cca gag gac gag tgt gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac1636Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt1584Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc1632Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg gag tat gtg aat gcc agg cac tgt1680Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt1728Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575ttt gga ccg gag gct gac cag tgt gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt cca gat gag gag ggc gca tgc cag1872Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620cct tgc ccc atc aac tgc acc cac tcc tgt gtg gac ctg gat gac aag1920Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc agc cct ctg acg tcc atc gtc tct1968Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser645 650 655gcg gtg gtt ggc att ctg ctg gtc gtg gtc ttg ggg gtg gtc ttt ggg2016Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670atc ctc atc aag cga cgg cag cag aag atc cgg aag tac acg atg cgg2064Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685aga ctg2070
Arg Leu690<210>2<211>690<212>PRT<213>寡核苷酸<400>2Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Set130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Ash165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685Arg Leu690<210>3
<211>21<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3cagtgagcac catggagctg g21<210>4<211>26<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4tcacagtctc cgcatcgtgt acttcc 26<210>5<211>23<212>DNA<213>寡核苷酸<400>5acaggcctcc actccgtttg ctg 23<210>6<211>22<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6cctcgaggga tactctagag cg 2权利要求
1.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包含以下元件(a)位于5’端的7-甲基鸟嘌呤帽子结构元件；(b)位于3’端的长度为110-200bp的polyA尾；(c)位于元件(a)和(b)之间的HER2/neu的编码序列。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的HER2/neu的编码序列具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的polyA尾的长度为120-180bp。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子是DNA或mRNA。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核酸分子。
6.一种权利要求1所述的核酸分子的用途，其特征在于，用于制备致敏的树突状细胞。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述致敏后的树突状细胞用于制备针对HER2阳性肿瘤的治疗性疫苗。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的HER2阳性肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、或原发性肾细胞癌。
9.一种药物组合物或免疫组合物，其特征在于，它含有药学上可接受的载体及赋形剂，以及权利要求1所述的核酸分子或用权利要求1所述的核酸分子所致敏的树突状细胞。
10.一种体外转录载体的构建方法，所述的转录载体用于产生权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述方法包括步骤(1)通过PCR方法扩增出长度为110-200bp的polyA元件，并将多聚腺苷酸PCR产物poly(A-T)连接入转录载体，获得带有所述polyA元件的转录载体；(2)将HER2/neu的编码序列插入到步骤(1)中制备的带有所述polyA元件的转录载体，并且插入位置为所述polyA元件的上游，且与所述polyA元件的5‘端相距0-20bp，从而制得体外转录载体。
全文摘要
本发明提供了一种用于制备HER2阳性肿瘤治疗性疫苗的HER2/neu核酸分子及其用途，它包括以下元件(a)位于5’端的7－甲基鸟嘌呤帽子结构元件；(b)位于3’端的长度为110－200bp的polyA尾；(c)位于元件(a)和(b)之间的HER2/neu的编码序列。其中，所述的编码序列包含多个已被证明的CTL表位，同时又不包含其酪氨酸激酶活性区域，消除了其酪氨酸激酶活性，可用于修饰树突状细胞，并诱导产生针对HER2阳性肿瘤的特异性免疫应答，因而可用于HER2阳性肿瘤如乳腺癌等肿瘤的预防及治疗。本发明还提供了所述HER2/neu mRNA的体外转录载体的构建方法。
文档编号A61K48/00GK1966684SQ200510110390
公开日2007年5月23日 申请日期2005年11月16日 优先权日2005年11月16日
发明者万涛, 王燕兰, 王建莉 申请人:上海海欣生物技术有限公司