专利名称：用于治疗过敏性疾病的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种用于通过特异性免疫治疗方法预防和治疗过敏性疾病的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
过敏性疾病是当今世界上最常见、最顽固的疾患之一，是一种严重威胁人类健康地疾病。过敏性疾病的发病率大约占人口的20％，从新生儿到中老年人各年龄段都有可能发生，没有明显的性别倾向，但有明显的遗传性倾向。
速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。表现的病症主要为变应性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠胃炎以及湿疹、荨麻疹、斑疹、丘疹、划痕症、异位性皮炎、风团皮疹、皮肤搔痒等过敏性皮肤病。
哮喘是一种常见的呼吸道疾病，被世界医学界公认为四大顽症之一，被列为十大死亡原因之最。据WHO的统计资料显示，各地患病率为1％～5％不等，我国患病率接近1％，儿童可高达2～5％，成人男女患病率大致相同，约20％的患者有家族史。变应性鼻炎在全世界人群中发病率高达10～20％，我国儿童更高达30～40％。随着全球范围内的空气污染和环境恶化，这些疾病的发病率和死亡率呈现逐年上升态势。
引起过敏的主要的变应原有尘螨、花粉、屋尘、霉菌、羽毛等，其中尘螨是一种强烈的变应原，广泛存在于自然界，具有过敏体质的病人吸入微量的尘螨变应原即能引起过敏性疾病。约有80％的哮喘患者对尘螨过敏，儿童对螨的过敏比成人多。尘螨是八条腿的节肢动物，大小约0.2-0.4mm，肉眼几乎无法看到，大量滋生于床垫、被子、枕头、沙发、地毯等织物中。尘螨一般在春秋季大量繁殖，其生长的适宜温度为20-30℃，适宜的相对湿度为65-80％，主要食物来源是皮肤脱落的鳞屑。尘螨的分泌物、排泄物、皮屑及死亡的虫体，在细菌和真菌作用下分解为微小颗粒，飘浮在空气中，通过鼻、口呼吸进入人体内，诱发过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎、皮炎等。
空气中飘散的各种致敏花粉是一组重要变应原，目前已知可以引起人类致敏的花粉多达数百种，其中豚草属(Ambrosia L.)，蒿属(Artemisia L.)，蓖麻属(Ricinus L.)，苋属(Ricinus L.)，律草属(Hummlus L.)，藜属(Chenlpldum L.)，木麻黄属(Xaluarina L.)和臭属(Ailianthus desf)等属的一些植物，因其病原性强，致敏率高，数量大，散播范围广，且植物自身分布的范围广，数量亦丰富，对花粉污染的影响大，因而成为较重要的花粉污染源植物。而木本植物中的松属、悬铃木属也是引起花粉症的重要污染源植物。由于花粉污染源植物的分布受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，因而不同地区，其主要的花粉污染源植物亦不相同。在美国和加拿大，花粉污染源以豚草最为重要；在北美洲，以梯牧草和六月草为主；在英国、捷克、丹麦、法国、意大利、西班牙和瑞士，以禾本科植物为主；在南非、巴勒斯坦、澳大利亚、新西兰和日本，除以禾本科植物为主外，树木类植物也较为重要；而在日本，引起花粉症的主要是美洲杉和雪松木。在我国，因多数地区(如北京、新疆、山西、山东、武汉、沈阳、广州、宁夏等地)的主要花粉均为蒿属植物花粉，因此我国的花粉污染源植物以蒿属植物最为重要。但在不同地区，除蒿属植物外，亦各有侧重。华东地区，蓖麻、悬铃木等为较重要的花粉污染源植物；华南地区，苋属植物和大麻黄，苦楝，藜、桑等植物显得较为重要；在西南地区，以贵阳市为例，蒿属、藜属、禾本科植物以及悬铃木，因其花粉含量大，致敏性较强，成为贵阳市主要花粉污染源植物。另外随季节不同，占主导地位的花粉污染源亦不同。树木类植物主要在春季开花播粉，因而这类植物成为春季主要的花粉污染源植物；在夏季，牧草和禾本科植物占据花粉污染源植物的主导地位；而秋季，则以杂草类(或称莠类)植物为主。
花粉诱发的过敏性疾病包括季节性变态反应性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮肤病和过敏性哮喘。流行病学调查表明，花粉过敏是一种常见的疾病。据北美洲的调查证实，花粉症的发病率约占正常人群的2～5％，约30％的变态反应疾病患者属于对花粉过敏；美国学者Tuft甚至得出了发病率约占美国总人口的10％，个别流行地区可高达15％的结论；在西欧的调查表明，花粉症的发病率在1～5％。
关于过敏性疾病的治疗国内外都还不能完全解决，目前主要的预防和治疗措施包括避免接触变应原、药物治疗和免疫治疗。
特异性免疫治疗方法，是将不能避免的并经皮肤试验或其他方法证实或怀疑的主要抗原性物质，制成一定浓度的浸出液，以逐渐递增剂量及浓度的方法进行注射，通过反复给病人注射特异性抗原，促使体内产生相应的抗体。这类抗体属于IgG型，当这些特异性抗体在体液中提高之后，如再度接受外来特异性过敏原时，此类抗体首先与之结合，与体内原有的IgE抗体竞争，从而产生免疫反应而不产生过敏反应。血清IgE在连续脱敏治疗以后逐渐下降，到过敏反应阈值以下时，即能防止过敏反应发生，因而达到脱敏目的。
特异性免疫治疗在临床上应用已达70年之久，至今仍是变态反应学界治疗支气管哮喘、变应性鼻炎、花粉症和蜂毒过敏等疾病的主要手段之一。
中国专利CN 1208089C公布了应用粉尘螨浸出液制成制剂并通过脱敏治疗方法达到减轻或控制过敏性疾病的方法。中国专利CN1596309、加拿大专利CA2491038、澳大利亚专利AU2003238199等专利中描述了通过克隆、表达、提取的方式得到不同花粉变应原。
有研究表明，对尘螨过敏的患者中80％以上表现出对花粉过敏。因此，本领域中仍然需要开发新的用于通过特异性免疫治疗来预防和治疗尘螨和花粉混合过敏性疾病的药物及其制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗过敏性疾病(过敏性哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎、荨麻疹等)的抗过敏药物---尘螨和花粉混合变应原制剂。该制剂利用特异性免疫治疗的原理，通过服用由小至大剂量的变应原，使病人逐步提高对外来变应原的耐受性，从而达到减轻发作或控制发作的目的。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，其特征在于，该组合物包含尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体。
在本发明的组合物中，尘螨变应原和花粉变应原是指以尘螨或花粉为来源获得的变应原，优选来自下列尘螨和花粉的变应原粉尘螨、屋尘螨、小角尘螨、埋内欧尘螨、舍赫尘螨等；禾本科植物花粉、蒿属植物花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、苋属花粉、律草属花粉、藜属花粉、木麻黄属花粉、杂草类花粉、桦木花粉、松属花粉、美洲杉花粉、悬铃木属花粉等。所述变应原可以呈液体制剂形式或干粉形式。应当注意的是，该术语中包括了一种或多种变应原。也就是说，本发明的尘螨变应原可以采用一种或多种市售的分离纯化的尘螨变应原作为本发明组合物中的尘螨变应原，也可以采用含有多种尘螨变应原混合物的尘螨浸出液的形式，优选采用含有多种尘螨变应原混合物的尘螨浸出液的形式。
在较佳的实施方案中，所述尘螨变应原是用以下方法制得的尘螨浸出液以面粉或动物饲料为培养基培养尘螨标准种，用脱脂剂处理尘螨代谢培养基，将处理后的培养基固体浸于含有防腐剂的提取液中处理至少60小时，然后过滤，得到尘螨浸出液。所述尘螨浸出液中的总蛋白浓度宜为1-20毫克/毫升，更佳的为2-10毫克/毫升，还要佳的为3-8毫克/毫升。
在更佳的实施方案中，所述尘螨变应原是用以下方法制得的尘螨浸出液1)取尘螨标准种，实验室纯培养，95％纯种，杂螨不超过5％，符合国际标准；2)在约300克尘螨代谢培养基中，加入适量体积的脱脂剂，清洗脱脂2-5小时；倾倒出脱脂剂，加入新的脱脂剂，重复清洗脱脂2次；3)三次脱脂后，倾倒出上层脱脂剂，保留下层固体，于室温自然吹干，待残留粉末中毫无脱脂剂的刺激性气味即为脱脂剂挥干标准；4)取晾干后的尘螨代谢培养基按照12-6W/V浸于含有防腐剂的提取液中，即每5毫升生理盐水中有1克脱脂后的代谢培养基，4℃磁力搅拌5-9小时；间隔冷浸过夜，再磁力搅拌，至少60小时后取上层清液；5)滤纸去渣；6)0.45μm超滤膜正压过滤，得到原液。
同样，本发明的花粉变应原也可以采用一种或多种市售的分离纯化的花粉变应原作为本发明组合物中的花粉变应原，或可以采用含有多种花粉变应原混合物的花粉浸出液形式。在较佳的实施方案中，所述花粉变应原为用以下方法制得的花粉浸出液用脱脂剂处理干燥的花粉，除去脱脂剂，将花粉粉碎后加入含4-8毫克/毫升氯化钠、2-4毫克/毫升碳酸氢钠、0.4％体积防腐剂的水溶液中浸泡至少40小时，取上清液作为花粉浸出液。所述花粉浸出液中的蛋白浓度宜为0.1-20毫克/毫升，更佳的为0.2-10毫克/毫升，还要佳的为0.5-5毫克/毫升。
在更佳的实施方案中，所述花粉变应原为用以下方法制得的1)花粉自然干燥至恒重；2)乙醚脱脂数次，直至乙醚层无色；3)乙醚彻底挥发后，经手工用研钵研磨6小时以上后再经高速分散器对样品进行粉碎，最后用超声波粉碎，以上操作均在4℃下进行；4)按每克花粉加入5-15ml coca’s(5.0g氯化钠、2.75g碳酸氢钠、4ml苯酚，加蒸馏水至1000ml)，于4℃浸泡40-60小时，期间用磁力搅拌器搅拌几次，每次10-30分钟；5)浸出后离心取上清液，测定蛋白质含量；6)此浸出液置透析袋中用生理盐水或PBS透析至外液无色；7)0.45μm超滤膜正压过滤，分装，冻存。
上述方法中所用的脱脂剂和防腐剂均是常规的，脱脂剂包括但不限制于乙醚、丙酮等，防腐剂包括但不限制于苯酚、硫柳汞等。
在较佳的实施方案中，本发明的药物组合物基本上由尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体组成。此处的术语“基本上由……组成”指的是该组合物中还可以含有任何其它组分，这些组分可以以任何含量存在，只要以该含量存在的该组分对于本发明的药物组合物在治疗过敏性疾病方面的效果没有实质性的影响即可。
所述尘螨变应原的含量为药物组合物的重量的0.001～50％(重量)，更佳的为0.1-30％(重量)，还要佳的为1-20％(重量)；所述花粉变应原的含量为药物组合物的重量的0.001～50％(重量)，更佳的为0.1-30％(重量)，还要佳的为1-20％(重量)。
当采用上述制备的尘螨浸出液和花粉浸出液时，所述尘螨浸出液为药物组合物的体积的1～99％(体积)，更佳的为20-80％(体积)，还要佳的为20-60％(体积)；所述花粉浸出液为药物组合物的体积的1～99％(体积)，更佳的为20-80％(体积)，还要佳的为40-80％(体积)。
本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的变应原相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在治疗过敏性疾病方面的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等，其中较佳的载体选自生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。
本发明的药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂是指口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成片剂、胶囊剂等多种其他剂型。较佳的是，所述药物组合物的剂型选自注射剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂或贴剂。
本发明另一方面还提供了一种制备上述的药物组合物的方法，该方法包括将尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体相混合，从而获得所述药物组合物。尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体之间的混合次序没有特别的限制，例如可以先将尘螨变应原与花粉变应原混合起来制成混合制剂，随后再将其与药学上可接受的载体相混合，也可将尘螨变应原与花粉变应原同时加入药学上可接受的载体内。
在一个较佳的实施方案，本发明的药物组合物是通过将上述的尘螨变应原浸出液与花粉变应原浸出液按照一定比例混合而获得的。
本发明另一方面还涉及尘螨变应原和花粉变应原的组合在制备用于通过特异性免疫治疗方法治疗过敏性疾病的药物组合物中的用途。在较佳的实施方案中，所述过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎、荨麻疹等。
本发明可用于过敏性哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎、荨麻疹等症的治疗。治疗时将多个浓度制剂配合使用。对患者先使用较低的浓度进行治疗，然后逐步增加制剂浓度，最后用较高浓度的制剂维持治疗。由于不同浓度的药物被人体吸收的途径不一样，所以治疗时使用的初始浓度和维持浓度也不同。
由于在日常生活中接触多种变应原，过敏性疾病患者的病因与多种变应原有关。若仅用单一的抗原组分进行治疗，则不适用于因为多种变应原过敏引起疾病的患者。而本发明包含多种变应原，治疗时的适用范围更广。因此，本发明药物在过敏性疾病治疗领域有广阔的应用前景和临床价值。
附图简述
图1为BCA法测尘螨变应原浸出液和花粉变应原浸出液中蛋白含量的标准曲线。
具体实施例方式
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
实施例1 尘螨变应原的制备
1.粉尘螨Dermaftophagoides farinae标准种，以面粉作为培养基，实验室纯培养，95％纯种，杂螨不超过5％，符合国际标准；
2.在约310克粉尘螨代谢培养基中，加入500毫升的丙酮，清洗脱脂2小时，倾倒出丙酮；再加入400毫升的丙酮，清洗脱脂2小时，倾倒出丙酮；再加入400毫升的丙酮，清洗脱脂2小时；
3.三次脱脂后，倾倒出上层丙酮，保留下层固体，于室温自然吹干，待残留粉末中毫无丙酮刺激性气味即为丙酮挥干标准；
4.取晾干后的粉尘螨代谢培养基按照12-6W/V浸于含有防腐剂的提取液中，即每5毫升生理盐水中有1克脱脂后的代谢培养基，4℃磁力搅拌5-9小时；间隔冷浸过夜，再磁力搅拌，至少60小时后取上层清液；
5.滤纸去渣；
6.0.45μm超滤膜正压过滤，得到原液；
7.用BCA法测原液的蛋白含量(具体步骤见实施例3)。
实施例2 花粉主要变应原的制备
1.花粉自然干燥至恒重；
2.乙醚脱脂数次，直至乙醚层无色；
3.乙醚彻底挥发后，经手工用研钵研磨6小时以上后再经高速分散器对样品进行粉碎(30000g，30次，5s/次)，最后用超声波粉碎(20次，5s/次)，以上操作均在4℃下进行；
4.按每克花粉加入10ml coca’s(5.0g氯化钠、2.75g碳酸氢钠、4ml苯酚，加蒸馏水至1000ml)，于4℃浸泡48小时，期间用磁力搅拌器搅拌几次，每次20分钟；
5.浸出后离心取上清液，测定蛋白质含量；
6.此浸出液置透析袋中用生理盐水或PBS透析至外液无色；
7.0.45μm超滤膜正压过滤，分装，冻存；
8.用BCA法测原液的蛋白含量(具体步骤见实施例3)。
实施例3 原液中蛋白含量的测定
选用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定尘螨和花粉浸出液原液中蛋白含量，按下列步骤进行
1.将实施例1和2中提取到的变应原浸出液稀释10倍，作为待测样品；
2.分别量取50ml的BCA试剂A和1ml的BCA试剂B至烧杯内，充分混合，配制成工作液；
3.将BSA(白蛋白)浓度为2mg/ml的标准品稀释为以下一系列浓度的标准品溶液，使其中BSA终浓度分别为2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml；
4.分别吸取待测样品10μl、上述系列标准品10μl至试管中，空白管中则加入10μl蒸馏水；
5.在每一试管中加入200μl的工作液，混匀；
6.室温反应2小时；
7.以蒸馏水作对照；在562nm波长下测各管的吸收值；
8.各吸收值减去空白管的吸收值，做标准曲线(如图1所示)；
9.样品的平均吸收值分别为，由标准曲线读得所测溶液中蛋白含量为610μg/ml和100μg/ml，再乘以稀释倍数10，计算得提取的螨浸出液原液中蛋白含量为6.1mg/ml，花粉浸出液原液中蛋白含量为1.0mg/ml。
实施例4 舌下含服剂的制备
将实施例1和2获得的原液用生理盐水和等体积甘油稀释，并按4∶6比例(体积比)混合制成混合变应原制剂。按照治疗所需浓度，稀释成1∶100(V/V)至1∶100000000(V/V)范围内的多个浓度的制剂；分装、灌封；56℃灭活1小时左右除菌，即得舌下含服剂。
实施例5 变应原制剂的药效学实验
在药效学实验中，尘螨和花粉单独给药方案见表1-6，尘螨和花粉混合给药的剂量为单独给药的1/2。
A)豚鼠致敏取健康豚鼠进行给药，给药方案见表2和表4。给药开始的第8天，于每只豚鼠两后腿各肌肉注射5％卵白蛋白生理盐水溶液0.4ml，同时腹腔注射同浓度的卵白蛋白生理盐水溶液1ml，以后继续按预定的方案每日舌下给药，3-4周后进行试验。
B)大鼠致敏取健康大鼠(给药方案见表1和表3)，给药开始的第20天，于每只大鼠两后腿肌肉注射1％卵白蛋白生理盐水溶液0.1ml，同时腹腔注射百白破疫苗1.2ml/只，以后按预定方案每日舌下给药，13天后进行试验。
主要药效学实验
1).混合变应原滴剂对大鼠同种被动皮肤过敏反应的影响
IgE血清的制备取健康大鼠5只，体重180～200g，雌雄兼用，将卵白蛋白的生理盐水溶液按10mg/kg的剂量肌肉注射于后腿两侧，同时腹腔注射百白破疫苗1.2ml/只，第13天将动物乙醚麻醉后，腹主动脉取血，2000rpm离心，分离血清，置冰箱备用。
分组和给药取健康大鼠100只，雌雄各半，按体重随机分为10组，10只/组。设立空白对照组、三个剂量的混合变应原给药组(剂量分别为临床拟用剂量的2、5、10倍，)、三个剂量的尘螨变应原给药组(剂量分别为混合变应原药物中尘螨变应原含量的2倍)、三个剂量的花粉变应原给药组(剂量分别为混合变应原药物中花粉变应原含量的2倍)。
大鼠被动皮肤致敏和抗原攻击取上述大鼠，于给药开始后的第28天用乙醚浅麻醉，在大鼠背中线两侧距脊柱1.5厘米处，将毛剪光，于左侧剪毛处皮内注射IgE血清。48小时后进行抗原攻击，静脉注射0.75％Evans blue生理盐水溶液1ml/100g，内含卵白蛋白2mg/ml。30分钟后处死大鼠，剪下背部皮肤，测量注射抗体处的蓝斑直径并剪下蓝斑，置5ml丙酮生理盐水溶液(7∶3)中浸泡72小时，2000rpm离心，取上清液，在610nm波长处测定吸收度，进行统计学检验。
结果发现，混合变应原滴剂按拟定的临床给药方案4周能够明显减小大鼠PCA反应的蓝斑直径，减少染料的渗出，中、高剂量组(5、10倍剂量组)的蓝斑直径和吸收度的值与空白对照组比较，差异均有显著意义(P＜0.05或P＜0.01)；与尘螨和花粉单独给药组比较，虽无统计学意义，但蓝斑直径和吸收度的值均减小。
2).混合变应原滴剂对小鼠异种被动皮肤过敏反应的影响
IgE血清的制备取健康大鼠5只，体重180～200g，雌雄兼用，将卵白蛋白的生理盐水溶液按10mg/kg的剂量肌肉注射于后腿两侧，同时腹腔注射百白破疫苗1.2ml/只，第13天将动物乙醚麻醉后，腹主动脉取血，2000rpm离心，分离血清，置冰箱备用。
分组和给药取健康小鼠100只，雌雄各半，按体重随机分为10组，10只/组。设立空白对照组、三个剂量的混合变应原给药组(剂量分别为临床拟用剂量的2、5、10倍，)、三个剂量的尘螨变应原给药组(剂量分别为混合变应原药物中尘螨变应原含量的2倍)、三个剂量的花粉变应原给药组(剂量分别为混合变应原药物中花粉变应原含量的2倍)。
小鼠被动皮肤致敏和抗原攻击取上述小鼠，于给药开始后的第24天用乙醚浅麻醉，在大鼠背中线两侧距脊柱1.5厘米处，将毛剪光，于左侧剪毛处皮内注射IgE血清。48小时后进行抗原攻击，静脉注射1％Evans blue生理盐水溶液1ml/100g，内含卵白蛋白2mg/ml。30分钟后处死小鼠，剪下背部皮肤，测量注射抗体处的蓝斑直径并剪下蓝斑，置5ml丙酮生理盐水溶液(7∶3)浸泡72小时，2000rpm离心，取上清液，在610nm波长处测定吸收度，进行统计学检验。
混合变应原滴剂按拟定的临床给药方案4周能够明显减小小鼠PCA反应的蓝斑直径，减少染料的渗出，低、中、高三个剂量组的蓝斑直径与空白对照组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)；高剂量组的吸收度的值与空白对照组比较，差异具有显著性意义(P＜0.05)；与尘螨和花粉单独给药组比较，虽无统计学意义，但蓝斑直径和吸收度的值均减小。
3.混合变应原滴剂对致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩的影响(Schultz-Dale反应)
取致敏豚鼠，击昏，取长度约为1.5cm左右的回肠，下端固定在通气钩上，下端连于肌张力换能器上，置10ml 37℃保温的浴槽中，加入37℃的台氏液10ml，通入氧气，气泡数大约为每分钟20个，调节初始张力约为0.5g，用Metter-lab生理记录仪记录回肠张力的大小。混合变应原滴剂按拟定的临床给药方案给药能够明显抑制豚鼠的Schultz-Dale反应时的回肠收缩，抑制率分别为39％、40％、42％，与空白对照组比较，三个给药组豚鼠的回肠收缩力均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)；与尘螨和花粉单独给药组比较，回肠收缩能力降低虽无统计学意义，但有降低趋势。
4.混合变应原滴剂对致敏大鼠肺内嗜酸性粒细胞浸润的影响
取致敏大鼠，置3L的玻璃罩内，用超声雾化器雾化4％卵白蛋白生理盐水溶液10分钟，24小时后用乙醚麻醉大鼠，腹主动脉放血处死，细心地取左肺置4％甲醛溶液中固定，24小时后切片，石蜡包埋，苏木素-伊红染色，显微镜下观察支气管周围嗜酸性粒细胞的浸润情况。结果显示，空白对照组大鼠肺内支气管周围均有大量嗜酸性粒细胞浸润，尘螨和花粉单独给药组低、中剂量组各有两只大鼠肺内支气管周围有少量嗜酸性粒细胞浸润，高剂量组大鼠肺内支气管周围则未见明显的嗜酸性粒细胞浸润；混合变应原给药组低、中剂量组各有一只大鼠肺内支气管周围有少量嗜酸性粒细胞浸润，高剂量组大鼠肺内支气管周围则未见明显的嗜酸性粒细胞浸润。
5.混合变应原滴剂对致敏大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞数的影响
取致敏大鼠，置3L的玻璃罩内，用超声雾化器雾化4％卵白蛋白生理盐水溶液10分钟，24小时后用乙醚麻醉大鼠，腹主动脉放血处死，打开胸腔，细心地结扎左支气管，进行右支气管插管，用5ml生理盐水分两次灌洗右肺后取所得灌洗液进行白细胞计数。结果表明，混合变应原滴剂按拟定的临床给药方案给药，能够明显减少大鼠肺内过敏性白细胞渗出，抑制率分别为63％、68％、73％，与空白对照组比较，三个给药组大鼠的肺灌洗液中的白细胞数均显著降低(P＜0.01)；与尘螨和花粉单独给药组比较，白细胞降低数虽无统计学意义，但在数目上也有减少。
6.混合变应原滴剂对大鼠被动肥大细胞脱颗粒的影响
致敏大鼠血清的制备取健康大鼠，给药开始的第20天，于每只大鼠两后腿肌肉注射1％卵白蛋白生理盐水溶液0.1ml，同时腹腔注射百白破疫苗1.2ml/只，以后按预定方案每日舌下给药，13天后眼球取血，2000rpm离心，分离血清，置冰箱备用。
肥大细胞的制备取正常未致敏大鼠30只，乙醚麻醉后颈总动脉放血处死，向其腹腔内注射含肝素的台氏液10ml，并轻揉大鼠腹部3分钟，打开腹腔，用吸管吸取腹腔内液体，1000rpm离心15分钟，弃上清液，用台氏液稀释管底的肥大细胞至5ml，置冰浴中备用。
染色玻片的制备取中性红，用无水乙醇制成0.025％(W/V)的溶液即为染液。取染液2滴，滴于清洁玻片上，自然晾干，即为染色玻片。
脱颗粒实验取已制得的致敏大鼠血清0.5ml，加入肥大细胞悬液1ml，混匀，置37℃温箱中孵育2小时，取出，加入台氏液1ml和0.1％卵白蛋白0.1ml，使卵白蛋白总浓度为40μg/ml，37℃水浴中放置5分钟取出，冷却后1000rpm离心15分钟，小心吸取上清液后，取管底沉积的肥大细胞2滴滴于染色玻片上，混匀，37℃保温3分钟，显微镜下观察。检查50个肥大细胞，如形态为圆形，边缘光滑，细胞内有均匀分布的红色颗粒即记为未脱颗粒；如颗粒褪色或颗粒已从膜内向外流出或为空泡即记为脱颗粒。
实验结果显示，与空白对照组比较，三个混合变应原滴剂给药组肥大细胞脱颗粒百分率均显著降低(P＜0.01)，抑制率分别为29％、33％、26％，说明大鼠给予混合变应原滴剂后能拮抗抗原刺激所产生的肥大细胞脱颗粒反应。与尘螨和花粉单独给药组比较，混合变应原滴剂给药组抑制率有所提高。
7.混合变应原滴剂对大鼠肥大细胞释放组胺的影响
与空白对照组比较，三个给药组大鼠的回肠收缩力均显著降低(P＜0.01)，抑制率分别为38％、46％、31％，说明大鼠给与混合变应原滴剂后能抑制抗原刺激时肥大细胞释放组胺。与尘螨和花粉单独给药组比较，混合变应原滴剂给药组抑制率有所提高。
根据上述试验结果可以知道，尘螨变应原与花粉变应原的组合产生了协同脱敏的作用，降低了活性成分的用量，活性成分用量仅为单独活性用量的1/2，而作用与原来相比有所提高，同时还减少了副作用。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
表1 尘螨变应原小鼠实验浓度(μg/ml)
表2 尘螨变应原大鼠实验浓度(μg/ml)
表3 尘螨变应原豚鼠实验浓度(μg/ml)
表4 花粉变应原小鼠实验浓度(μg/ml)
表5 花粉变应原大鼠实验浓度(μg/ml)
表6 花粉变应原豚鼠实验浓度(μg/ml)
权利要求
1.一种治疗过敏性疾病的药物组合物，其特征在于，该组合物包含尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自注射剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂、鼻腔剂或贴剂。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述尘螨变应原为用以下方法制得的尘螨浸出液以面粉或动物饲料为培养基培养尘螨标准种，用脱脂剂处理尘螨代谢培养基，将处理后的培养基固体浸于含有防腐剂的提取液中浸泡至少60小时，然后过滤，得到尘螨浸出液；所述花粉变应原为用以下方法制得的花粉浸出液用脱脂剂处理干燥的花粉，除去脱脂剂，将花粉粉碎后加入含4-8毫克/毫升氯化钠、2-4毫克/毫升碳酸氢钠、0.4％体积防腐剂的水溶液中浸泡至少40小时，取上清液作为花粉浸出液。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述尘螨浸出液的含量为药物组合物的体积的1～99％(体积)；所述花粉浸出液的含量为药物组合物的体积的1～99％(体积)。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述尘螨和花粉的混合变应原包括下列尘螨和花粉的组合粉尘螨、屋尘螨、小角尘螨、埋内欧尘螨、舍赫尘螨等；禾本科植物花粉、蒿属植物花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、苋属花粉、律草属花粉、藜属花粉、木麻黄属花粉、杂草类花粉、桦木花粉、松属花粉、美洲杉花粉、悬铃木属花粉等。
6.一种制备权利要求1所述的药物组合物的方法，其特征在于，将尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体相混合。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述尘螨变应原为用以下方法制得的尘螨浸出液以面粉或动物饲料为培养基培养尘螨标准种，用脱脂剂处理尘螨代谢培养基，将处理后的培养基固体浸于含有防腐剂的提取液中浸泡至少60小时，然后过滤，得到尘螨浸出液；
所述花粉变应原为用以下方法制得的花粉浸出液用脱脂剂处理干燥的花粉，除去脱脂剂，将花粉粉碎后加入含4-8毫克/毫升氯化钠、2-4毫克/毫升碳酸氢钠、0.4％体积防腐剂的水溶液中浸泡至少40小时，取上清液作为花粉浸出液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述尘螨浸出液的含量为药物组合物的体积的1～99％(体积)，所述花粉浸出液的含量为药物组合物的体积的1～99％(体积)。
9.尘螨变应原和花粉变应原的组合在制备用于通过特异性免疫治疗方法治疗过敏性疾病的药物组合物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎、荨麻疹。
全文摘要
本发明提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，该组合物包含尘螨变应原、花粉变应原以及药学上可接受的载体。本发明还提供了该组合物的制备方法。本发明还提供了尘螨变应原和花粉变应原的组合在制备用于通过特异性免疫治疗方法治疗过敏性疾病的药物组合物中的用途。本发明的药物组合物包含多种变应原，因此适用范围更广，在过敏性疾病治疗领域有广阔的应用前景和临床价值。
文档编号A61K9/12GK1840190SQ20051011014
公开日2006年10月4日 申请日期2005年11月9日 优先权日2005年11月9日
发明者东楠 申请人:浙江我武生物科技有限公司