人sfrp1基因、其编码蛋白及应用的制作方法

专利名称：人sfrp1基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的人基因和蛋白，尤其涉及一种人SFRP1基因的核酸序列、其编码蛋白；此外，本发明还涉及该基因编码蛋白的应用。
背景技术：
SFRP，分泌型Frz相关蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，但缺少七次跨膜域，它可能与卷曲蛋白(frizzled，Frz)竞争结合Wnt蛋白，从而抑制Wnt蛋白的过量表达。Wnt是一类分泌型糖蛋白，对人体正常细胞增殖起调整促进作用。近期实验发现，抑制这种蛋白质作用的基因SFRP发生异常时，Wnt蛋白质的机能会随之出现异常，使得癌细胞不断增殖，导致发生大肠癌。当把正常的SFRP基因注入癌细胞后，就会控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。
Wnt信号途径能引起胞内β-连锁蛋白(β-catenin)积累。β-catenin是一种多功能的蛋白质，在细胞连接处它与钙粘素相互作用，参与形成粘合带，而游离的β-catenin可进入细胞核，调节基因表达。在动物发育中，Wnt信号起重要作用，其异常表达或激活能引起肿瘤。
Frz是Wnt的受体，为7次跨膜蛋白，结构类似于G蛋白偶联型受体，Frz胞外N端具有CRD结构域，能与Wnt结合。Frz作用于胞质内的蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)，Dsh能切断β-catenin的降解途径，从而使β-catenin在细胞质中积累，并进入细胞核，与T细胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，调节靶基因的表达，TCF/LEF是一类具有双向调节功能的转录因子，它与Groucho结合抑制基因转录，而与β-catenin结合则促进基因转录。
研究表明，90％的大肠癌患者与SFRP基因异常有关。
在本发明之前，还没有出现涉及本发明的人SFRP1蛋白抑制肿瘤用途的公开报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种新的人SFRP1基因。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种新的人SFRP1蛋白。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种抑制肿瘤细胞生长的药物组合物。
本发明要解决的技术问题之四是提供本发明的人SFRP1蛋白在制各抑制肿瘤生长的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种人SFRP1基因，它包括下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列；(2)编码序列表中SEQ ID NO.6蛋白质序列的多核苷酸；(3)与序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
较佳地，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.5的DNA序列。更佳地，所述序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸第303-1247位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种人SFRP1蛋白质，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白质，或其保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物。
较佳地，该蛋白质选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.6氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.6氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的蛋白质。
更佳地，所述蛋白质是具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白质。
在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的人SFRP1基因。
在本发明的另一方面，还提供了一种含有上述载体的遗传工程化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，还提供了一种抑制肿瘤细胞生长的药物组合物，该组合物含有安全有效量的所述的人SFRP1蛋白质及药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种人SFRP1蛋白质在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
在本发明中，术语“编码SFRP1蛋白质序列”指编码具有人SFRP1蛋白活性的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中第303-1247位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的编码框第303-1247位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.5中第303-1247位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.6所述的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.5中从核苷酸第303-1247位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与SFRP1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.5中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“SFRP1蛋白”指具有SFRP1蛋白活性的SEQ ID NO.6序列的蛋白质。该术语还包括具有与SFRP1蛋白质相同功能的、SEQ ID NO.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SFRP1蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的人SFRP1蛋白质的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与SFRP1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗SFRP1蛋白质的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白质，如包含SFRP1蛋白质或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括SFRP1蛋白质的可溶性片段。通常，该片段具有SFRP1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“SFRP1保守性变异蛋白质”指与SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白质。本发明还包括SFRP1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SFRP1蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒，噬菌体，病毒等。在生产本发明的SFRP1蛋白质时，可以将本发明的人SFRP1基因序列可操作地连于表达调控序列，形成SFRP1蛋白表达载体。
在本发明中，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与蛋白质的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于蛋白质DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
在本发明中，所述药物组合物含有安全有效量的人SFRP1蛋白质及药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。本发明的药物组合物的施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。优选的施用方式是口服，它可根据疾病程度调节。
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.01微克/千克体重—约5毫克/千克体重。此外，本发明的人SFRP1蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的SFRP1蛋白或其激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.01微克/千克体重—约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的人SFRP1基因也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于SFRP1蛋白的无表达、异常或无活性的SFRP1蛋白的表达所致的细胞的无限生长。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成过量表达本发明的人SFRP1蛋白，以补充内源性的人SFRP1蛋白的缺失或不足。另外重组人SFRP1基因可包装到脂质体中，然后再转染至细胞内。本发明的人SFRP1基因导入组织或细胞内的方法包括将人SFRP1基因序列直接注入到体内组织中，或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将基因序列导入细胞中，再将细胞移植到体内等。也可通过体外补充本发明的人SFRP1蛋白因子，以减轻因人SFRP1蛋白的异常引起的病症，所述的人SFRP1蛋白因子可由基因工程技术产生，并通过进一步分离、提纯而获得。
本发明的人SFRP1蛋白可以施用于病人，以治疗或减轻因人SFRP1缺失、无功能或异常而导致的有关病症，也可通过转基因技术把本发明的正常人SFRP1基因注入癌细胞，以控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。


图1是本发明的人SFRP1基因在人体正常肝和胎肝组织中的表达图；图2是本发明的人SFRP1基因在人肝癌组织和癌旁组织中的差异表达图；图3是本发明的人SFRP1基因过量表达抑制肝癌细胞生长曲线图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1用去甲基化药物DAC(终浓度为2000nM)，处理15株肝癌细胞株后，使用基因芯片检测处理前后基因表达水平的差异，发现在8株细胞株中，SFRP1基因表达上调。其中，基因芯片实验主要包括如下四个步骤芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
1.芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体。通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列在载体上，靶基因可分为基因组DNA、cDNA(或人工合成DNA)。
2.样品制备 待测样品中总RNA的抽提步骤如下分别取用去甲基化药物DAC处理的15株肝癌细胞株和15株未经去甲基化处理的肝癌细胞株，再用TRIZol法抽提总RNA。抽提时，每5×106细胞加入1ml TRIzol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可加入1ml TRIzol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。再加入大约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。然后，4℃，12000rpm离心15分钟后小心将上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟。再4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀15分钟。去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定A260和A280值。
提取的总RNA可进一步用于样品cDNA探针制备，其过程如下1)荧光探针的制备(cDNA第一链标记)从-70℃冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2ml PCR管中配制反应溶液，若用Cy3/Cy5荧光标记探针，则PCR管中配制的反应溶液体系是，总RNA 5～50μg、荧光标记的引物1μg，再加入无核酸酶的水Xμl使总反应体积为10μl，若用生物素标记探针，则PCR管中配制的反应溶液体系是总RNA 5～50μg、生物素标记的引物1μg，再加入无核酸酶的水Xμl组成10μl的总反应体积，其中，所有荧光标记的引物都采用随机八聚体引物；再在70℃预变性10分钟，变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第一链反应体系，在该体系中分别加入4ul的5 x first-strand buffer(第一链合成缓冲液)、2ul的0.1MDTT、lul的5mM Unlabeled dNTP mix(未标记的dNTP混合液，对于引物用生物素标记的情况则换为加入1μl的10mM dNTP mix)、1μl的1mM Cy3/Cy5dCTP、1μl的RNA抑制剂及1ul的SuperScript II RNaseH reverse transcriptase(逆转录酶，200U/μl)，从而组成20μl的总体积；然后，42℃保温2小时，70℃变性5分钟。在PCR管中加入2μl 2.5N的NaOH水解RNA终止反应，37℃保温15分钟，加入10μl 2 N HEPES中和。
2)荧光探针的纯化可应用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行纯化，首先，标记好的探针转移至1.5ml离心管中，加入大约10倍体积的PN缓冲液，混匀，将QIAquick柱套入2ml离心管中，并转移探针至QIAquick柱，6000rpm离心1分钟，弃去滤过液；再向柱中加入700～750μl的PE缓冲液，6000rpm离心1分钟，弃去滤过液；再于13000rpm离心1分钟，并将QIAquick柱子转入一新的1.5mlEppendorf管上，然后，向柱中加入100～150μl的EB缓冲液，13000rpm离心1分钟。
3)荧光探针的定量将下清液转移至酶标板中，分别测定A260、A550、A650；再通过Cy3-probe(pmol)＝A550×洗脱体积/0.15和Cy5-probe(pmol)＝A650×洗脱体积/0.25的计算公式进行定量；定量后的探针吸回至1.5ml离心管中，加热抽干，保存于-20℃，待杂交。
3.芯片杂交1)准备工作(1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH20、95％乙醇、ddH20，各3min，最后放入干燥的50ml离心管中1000rpm，离心3min，去除残留的水渍，放置待用；(2)配制10％PBS溶液；(3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；(4)配制如下洗片液20×SSC溶液、10％SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5％SDS)、洗液II(1×SSC/0.1％SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。
2)预杂交 预杂交液的配制是30μl的总体积中有9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液及18μl ddH20，再从干燥箱中取出芯片，将适量的预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片，然后将芯片放入加有PBS的杂交盒中，置于42℃杂交箱中预杂交约1小时。预杂交完成之后取出芯片用ddH20浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除残留的水渍，放置待用。
3)杂交 取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，各用9～15μl ddH20充分溶解混合于1.5ml离心管内，然后配制杂交液，Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液由20×SSPE缓冲液、50×Denhandts缓冲液和溶解有探针的ddH20组成，而生物素标记探针的杂交液由20×SSPE缓冲液、50×Denhandts缓冲液、SA-Cy3/SA-Cy5及溶解有探针的ddH20组成，接着，取杂交液滴加在芯片上，并盖上盖玻片，同时保证盖玻片覆盖在含有杂交液的芯片的有效点样区域。最后，将该杂交芯片放入加有PBS的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。
4.洗涤、扫描和数据分析 芯片杂交反应结束后，需进行芯片洗涤。先将洗液I与洗液II置于42℃水浴预热，再用镊子取出片子，浸入经过42℃预热的洗液I中，当盖玻片从芯片上脱离后，再在42℃洗液I中洗涤8～20min。然后将片子换着浸入经过42℃预热的洗液II中，洗涤8～12min，从洗液II中取出片子后，再将片子浸入洗液III中，洗涤3～8min。最后把片子在ddH20中洗涤1～2min，转入干净离心管离心，以去除残留的水滴，经过上述洗涤，可将芯片放入芯片盒，待扫描分析。
通过特定的扫描仪比如激光共聚焦扫描仪进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，随后进行数据分析和处理。所得复合图须经软件分割成单色荧光图像，再将图像导入图像分析软件Imagene，经过自动和人工定位与排列，确定杂交点的范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出，从而完成将扫描得到的图像定量转化为数值。输出的数据通常需要包括信号强度，背景，信噪比等参数。
由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization正是基于此种目的。数据导入分析软件Genespring，用Background subtraction based on negativecontrols和perspot and per chip Intensity dependentnormalization(non-linear or LOWESSnormalization)方法标准化，计算得到ratio值(两种荧光Cy3与Cy5的比值)。一般认为ratio值在0.5-2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变，此域值范围可根据具体实验条件有所调整，再通过使用genespring和cluster分析软件进行聚类分析，建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene tree，experiment tree，K-means，SOM，PCA等方法均可通过Genespring实现和展示。由cluster软件分析结果可通过treeview软件以图形显示。
实施例2RT-PCR实验检测SFRP1基因在肝脏组织中的表达。
1.组织分离(Tissue isolation)实验用组织来源于72例HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。另外，也分别取2例正常肝和胎肝组织做相同处理，即放入液氮中(-80℃)保存。
2.总RNA的抽提试剂盒 抽提RNA试剂采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。
3.RNA的抽提步骤将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4℃离心沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定紫外分光光度计测定260/280比值(比值均在1.7～2.0)；并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。
4.cDNA的合成 取总RNA2μg，OligodT16 1μL，70℃保温3min，立即冰上变性5min。加入5×buffer，DTT和50mg/L的dNTP各2μL及1μL的逆转录酶，充分混匀后，42℃2h。模板使用终浓度通常为1μg/100μL。
5.RT-PCR扩增Beta-actin(F)前向引物为5’-TCACCCACACTGTGCCCA TCTACGA-3’(SEQ ID NO1)；Beta-actin(R)后向引物为5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(SEQ ID NO2)。
SFRP1(F)5’-AAAGCAAGGGCCATTTAGATTAG-3’(SEQ ID NO3)；SFRP1(R)5’-TTCTGGGCTTGACCTTAATTGTA-3’(SEQ ID NO4)。
以β-actin作内对照，反应混合物中各成分为β-actin(F)、β-actin(R)、SFRP1(F)、SFRP1(R)、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分别为0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后补充ddH20使反应体系为10μL。PCR的反应条件是94℃变性5min；然后每个循环94℃30s、53℃30s、72℃30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。电泳检测PCR扩增产物。
6.实验结果显示，在正常肝和胎肝组织中，有长度为328bp的SFRP1的特异扩增片断，内参β-actin的长度为300bp(图1)，说明本发明的SFRP1基因在人体正常肝和胎肝组织中表达，图中，“NL1”和“NL2”分别代表“正常肝脏样品1”和“正常肝脏样品2”，“FL1”和“FL2”分别代表“胎肝样品1”和“胎肝样品2”。另外，由图2所示结果表明，在肝癌组织中，SFRP1基因的表达水平明显低于癌旁组织中SFRP1基因的表达水平，其中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织。本发明的SFRP1基因是一个抑癌基因，在肝癌组织中，SFRP1基因的表达下降可能使原本受其抑制的基因过量表达，从而引起细胞的恶性增殖。
实施例3利用转基因技术使SFRP1基因的过量表达抑制肝癌细胞生长。
1.PCDNA3.1-SFRP1质粒构建 PCR扩增SFRP1的ORF区共314个氨基酸，两端引入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后与用同样的酶消化的PCDNA3.1连接，转化大肠杆菌后挑单克隆，测序。
所用的引物序列如下，SFRP1的引物为(不去除终止密码不含his-myc)Sfrpl 3.1B(-)F5’-CGGGATCCATGGGCATCGGG-3’R5’-CGGAATTCCGTCACTTAAACACGGACT-3’。
将质粒转染细胞株，用抗SFRP1的抗体做western检测SFRP1蛋白的表达情况。
2.转染(1)第一天铺细胞(35mm)密度达80％，摇匀37℃，5％C02培养过夜；(2)转染，tubel质粒pcDNA3.1-LZP 1～2μg加入到100μl DMEM(FCS free)中，混匀；tube2脂质体(lipofectamin)2～5μl加入到100μl DMEM(FCS free)中，混匀；混合tube1、2，室温静置30min；贴壁细胞吸去培养上清，用无血清DMEM洗2次，每次2ml；培养皿中加入1.5ml DMEM(FCS free)，将转染混合物逐滴滴入，混匀；37℃，5％C02培养。
(3)5～8小时后吸去转染上清，用新鲜的DMEM(10％FCS)洗2次换液，每次2ml，随后加入2ml DMEM(10％FCS)。
(4)48小时后收蛋白做Western Blot。
3.Western Blot将收集好的原始细胞蛋白和过表达后的细胞株蛋白同时电泳做对比。
(1)电泳常规蛋白电泳分离样品(根据蛋白大小选用胶的浓度为12％)；NC膜去离子水冲洗，再转移到转移缓冲液(Transferring buffer)中平衡20分钟；电泳胶置Transferring buffer中平衡20分钟。
(2)转膜按负极-2层滤纸垫-电泳胶-PVDF膜-2层滤纸垫-正极顺序装好转膜装置(blot)，18V，40分钟。
(3)膜封闭2小时。
(4)加一抗兔抗来源的抗体，稀释度为(1300～500)2小时。
(5)加二抗抗属的荧光二抗，稀释度为(12000)40分钟。
(6)检测在L02、7721、YY-8103、MHCC-H等细胞株中过表达成功。
4.细胞生长曲线采用Cell Counting Kitt-8试剂盒(1)选择L02、7721、YY-8103、MHCC-H等过表达成功的细胞株做细胞转染；(2)第二天细胞接种于96孔培养皿，每孔5×102个细胞(SMMC-7721)或1×103个细胞(L02)，每个细胞株取三孔，加10μl CCK-8，继续培养1小时；(3)读取450nm吸光度值，计算平均值和标准误，连续测量5-7天，画生长曲线。
5.结果如图3所示，过量表达本发明的人SFRP1基因的肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞，说明人SFRP1基因的过量表达能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>人SFRP1基因、其编码蛋白及应用<130>NP-10012<160>6<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1TCACCCACACTGTGCCCA TCTACGA25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG 25
<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3AAAGCAAGGGCCATTTAGATTAG23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4TTCTGGGCTTGACCTTAATTGTA23<210>5<211>4465<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(303)..(1247)<400>51 cctgcagcct ccggagtcag tgccgcgcgc ccgccgcccc gcgccttcct gctcgccgca61 cctccgggag ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc gccgcctccg121 accgcaggcc gagggccgcc actggccggg gggaccgggc agcagcttgc ggccgcggag181 ccgggcaacg ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt ttgcggcagg241 acgcgcgcgg ggaggcggcg gaggcagccc cgacgtcgcg gagaacaggg cgcagagccg301 gcatgggcat cgggcgcagc gaggggggcc gccgcggggc agccctgggc gtgctgctgg361 cgctgggcgc ggcgcttctg gccgtgggct cggccagcga gtacgactac gtgagcttcc421 agtcggacat cggcccgtac cagagcgggc gcttctacac caagccacct cagtgcgtgg481 acatccccgc ggacctgcgg ctgtgccaca acgtgggcta caagaagatg gtgctgccca541 acctgctgga gcacgagacc atggcggagg tgaagcagca ggccagcagc tgggtgcccc601 tgctcaacaa gaactgccac gccggcaccc aggtcttcct ctgctcgctc ttcgcgcccg661 tctgcctgga ccggcccatc tacccgtgtc gctggctctg cgaggccgtg cgcgactcgt721 gcgagccggt catgcagttc ttcggcttct actggcccga gatgcttaag tgtgacaagt781 tccccgaggg ggacgtctgc atcgccatga cgccgcccaa tgccaccgaa gcctccaagc841 cccaaggcac aacggtgtgt cctccctgtg acaacgagtt gaaatctgag gccatcattg901 aacatctctg tgccagcgag tttgcactga ggatgaaaat aaaagaagtg aaaaaagaaa961 atggcgacaa gaagattgtc cccaagaaga agaagcccct gaagttgggg cccatcaaga1021 agaaggacct gaagaagctt gtgctgtacc tgaagaatgg ggctgactgt ccctgccacc1081 agctggacaa cctcagccac cacttcctca tcatgggccg caaggtgaag agccagtact1141 tgctgacggc catccacaag tgggacaaga aaaacaagga gttcaaaaac ttcatgaaga1201 aaatgaaaaa ccatgagtgc cccacctttc agtccgtgtt taagtgattc tcccgggggc1261 agggtgggga gggagcctcg ggtggggtgg gagcgggggg gacagtgccc cgggaacccg1321 gtgggtcaca cacacgcact gcgcctgtca gtagtggaca ttgtaatcca gtcggcttgt1381 tcttgcagca ttcccgctcc cttccctcca tagccacgct ccaaacccca gggtagccat1441 ggccgggtaa agcaagggcc atttagatta ggaaggtttt taagatccgc aatgtggagc1501 agcagccact gcacaggagg aggtgacaaa ccatttccaa cagcaacaca gccactaaaa1561 cacaaaaagg gggattgggc ggaaagtgag agccagcagc aaaaactaca ttttgcaact1621 tgttggtgtg gatctattgg ctgatctatg cctttcaact agaaaattct aatgattggc1681 aagtcacgtt gttttcaggt ccagagtagt ttctttctgt ctgctttaaa tggaaacaga1741 ctcataccac acttacaatt aaggtcaagc ccagaaagtg ataagtgcag ggaggaaaag1801 tgcaagtcca ttatgtaata gtgacagcaa agggaccagg ggagaggcat tgccttctct1861 gcccacagtc tttccgtgtg attgtctttg aatctgaatc agccagtctc agatgcccca1921 aagtttcggt tcctatgagc ccggggcatg atctgatccc caagacatgt ggaggggcag1981 cctgtgcctg cctttgtgtc agaaaaagga aaccacagtg agcctgagag agacggcgat2041 tttcgggctg agaaggcagt agttttcaaa acacatagtt aaaaaagaaa caaatgaaaa2101 aaattttaga acagtccagc aaattgctag tcagggtgaa ttgtgaaatt gggtgaagag2161 cttaggattc taatctcatg ttttttcctt ttcacatttt taaaagaaca atgacaaaca2221 cccacttatt tttcaaggtt ttaaaacagt ctacattgag catttgaaag gtgtgctaga
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<400>61 MGIGRSEGGR RGAALGVLLA LGAALLAVGS ASEYDYVSFQ SDIGPYQSGR50 FYTKPPQCVD IPADLRLCHN VGYKKMVLPN LLEHETMAEV KQQASSWVPL100 LNKNCHAGTQ VFLCSLFAPV CLDRPIYPCR WLCEAVRDSC EPVMQFFGFY150 WPEMLKCDKF PEGDVCIAMT PPNATEASKP QGTTVCPPCD NELKSEAIIE200 HLCASEFALR MKIKEVKKEN GDKKIVPKKK KPLKLGPIKK KDLKKLVLYL250 KNGADCPCHQ LDNLSHHFLI MGRKVKSQYL LTAIHKWDKK NKEFKNFMKK300 MKNHECPTFQ SVFK
权利要求
1.一种人SFRP1基因，其特征在于，它包括下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列；(2)编码序列表中SEQ ID NO.6蛋白质序列的多核苷酸；(3)与序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.5的DNA序列。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸第303-1247位的核苷酸序列。
4.一种人SFRP1蛋白质，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白质，或其保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.6氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.6氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的蛋白质。
6.如权利要求4或5所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白质。
7.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的人SFRP1基因。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体。
9.一种抑制肿瘤细胞生长的药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求4所述的蛋白质及药学上可接受的载体。
10.权利要求4至6中任一项所述的人SFRP1蛋白质在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人SFRP1基因序列及其编码蛋白，本发明还公开了人SFRP1蛋白在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。本发明的人SFRP1蛋白可以施用于病人，以治疗或减轻因人SFRP1蛋白缺失、无功能或异常而导致的有关病症，且可通过转基因技术使本发明的人SFRP1基因在癌细胞中过量表达，或通过体外补给人SFRP1蛋白，以控制癌细胞增殖并杀死癌细胞。
文档编号A61P35/00GK1962865SQ20051011011
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月8日 优先权日2005年11月8日
发明者黄健, 韩泽广, 张云丽 申请人:上海人类基因组研究中心