专利名称：PLZF－RARa 和 PLZF－RARa/RARa－PLZF 急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型的制作方法
技术领域：
本发明关于急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型，特别关于PLZF-RARa和PLZF-RARa/RARa-PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型。
背景技术：
自1993年上海血液学研究所在国际上首先报道了1例变异型t(11；17)APL患者以来，迄今为止，世界上先后仅发现十几例类似病例。但因其对维甲酸耐受、对化疗不敏感、预后差等特点而具有重要的基础和临床研究价值。这就需要人们开发研究治疗耐维甲酸APL乃至其它肿瘤的新药。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是一种新型的肿瘤治疗药物，它主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，从而达到调控基因表达。在体内外可诱导肿瘤细胞的生长阻滞、分化和凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。且与维甲酸有相互协同作用，HDACIs能增强维甲酸的诱导分化作用，维甲酸能增强其诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖作用，对耐维甲酸的APL具有较好的治疗作用。t(11；17)导致的PLZF-RARα融合蛋白与CoR有两个结合位点，尽管RARα部分可受ATRA调节，但PLZF部分却不敏感。因此即使在药理浓度的ATRA下，染色质结构仍处于抑制状态，然而联合应用ATRA和HDACIs可以解除PLZF-RARα的转录抑制。PLZF-RARα及PLZF-RARα/RARα-PLZF APL是一好的HDACIs治疗研究模型，但由于临床发病病例少，且PLZF-RARα及PLZF-RARα/RARa-PLZF转基因鼠发病率低，多为散发病例，体内药物研究分组困难，不能作为药物筛选的好模型，每只发病鼠骨髓细胞量有限，作为体外用药研究亦困难，且长期饲养维持转基因鼠所用成本大，用转基因阳性的发病鼠骨髓细胞建立移植鼠模型能较好的解决以上问题。虽然国外研究小组已经建立了PML-RARαAPL移植鼠模型，但目前世界上尚没有PLZF-RARα及PLZF-RARα/RARα-PLZF APL移植鼠模型，因此我们在转基因发病鼠的基础上建立PLZF-RARα及PLZF-RARα/RARα-PLZF APL移植鼠模型，希望通过此模型的建立为HDACIs以及相关中草药提供一好的筛选模型，为耐维甲酸的APL和其它肿瘤的治疗提供理论和动物实验依据。
发明内容
本发明的目的在于(1)提供一种PLZF-RARa急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型；(2)提供一种PLZF-RARa/RARa-PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的(一)PLZF-RARa急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型1、质粒的构建将人的PLZF-RARα融合基因经酶切，连接，克隆入pUG-hCG(人组织蛋白酶G，human CathepsinG，hCG)载体，hCG是调控PLZF-RARα和RARα-PLZF表达的微基因。构建质粒转化大肠杆菌，氨苄青霉素LB平板筛选出阳性克隆，获得的质粒经酶切及测序鉴定，鉴定正确的质粒，用质粒纯化柱(Qiagen公司)大量制备，经PvuI酶切线性化获得相应的转基因构件。
2、转基因构件显微注射到受精卵雄原核。
3、植入假孕母鼠的输卵管中，发育成熟生出子代小鼠，小鼠的品系为C57BL/6J与CBA杂交鼠。子代小鼠经DNA-PCR鉴定阳性者为转基因阳性鼠。
4、子代小鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配生出F1、F2代。
5、取hCG-PLZF-RARαTM发生急性早幼粒细胞白血病的脾脏或骨髓的冻存或新鲜细胞1×105～1×106尾静脉注射入经450cGay的C57BL/6J受体鼠体内，反复传代5代以上，建成了PLZF-RARα阳性稳定的急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型。
(二)PLZF-RARa/RARa-PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型1、质粒的构建将人的PLZF-RARα和RARα-PLZF融合基因经酶切，连接，克隆入pUG-hCG(人组织蛋白酶G，human Cathepsin G，hCG)载体，hCG是调控PLZF-RARα和RARα-PLZF表达的微基因。构建质粒转化大肠杆菌，氨苄青霉素LB平板筛选出阳性克隆，获得的质粒经酶切及测序鉴定，鉴定正确的质粒，用质粒纯化柱(Qiagen公司)大量制备，经PvuI酶切线性化获得相应的转基因构件。
2、转基因构件显微注射到受精卵雄原核。
3、植入假孕母鼠的输卵管中，发育成熟生出子代小鼠，小鼠的品系为C57BL/6J与CBA杂交鼠。子代小鼠经DNA-PCR鉴定阳性者为转基因阳性鼠。
4、子代小鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配生出F1、F2代。
5、在此基础上分别将hCG-PLZF-RARα TM(TM转基因鼠)与hCG-RARα-PLZF TM进行交配繁殖，获得hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性TM。
6、取hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性TM发生急性早幼粒细胞白血病的脾脏或骨髓的冻存或新鲜细胞1×105～1×106尾静脉注射入经450cGay的C57BL/6J受体鼠体内，反复传代5代以上，建成了hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性稳定的急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型。
本发明所公开PLZF-RARa和PLZF-RARa/RARa-PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型，其优点表现在1.可以批量注射，建立足够数量的发病鼠模型，用于药物筛选及发病机制研究，克服了转基因鼠发病散在发病，发病率低的缺陷。2.不需要长期维持传代转基因鼠，降低了成本。
图1 PLZF-RARαAPL移植鼠骨髓细胞形态。
图2 PLZF-RARαAPL移植鼠脾脏细胞形态。
图3 PLZF-RARα/RARa-PLZF APL移植鼠骨髓细胞形态。
图4 PLZF-RARα/RARa-PLZF APL移植鼠脾脏细胞形态。
图5 PLZF-RARαAPL移植鼠骨髓细胞病理。
图6 PLZF-RARαAPL移植鼠脾脏细胞病理。
图7 PLZF-RARα/RARa-PLZF APL移植鼠骨髓细胞病理。
图8 PLZF-RARα/RARa-PLZF APL移植鼠脾脏细胞病理。
图9 显示ZRT-PLZF-RARa APL移植鼠，DT-PLZF-RARa/RARa-PLZFAPL移植鼠，移植小鼠RT-PCR检测结果APLZF-RARa融合基因；BRARa-PLZF融合基因；C管家基因GAPDH、图10 显示PLZF-RARa APL移植鼠原代细胞体外药物处理细胞形态学改变。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1PLZF-RARa急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型1、质粒的构建将人的PLZF-RARα融合基因经酶切，连接，克隆入pUG-hCG(人组织蛋白酶G，human Cathepsin G，hCG)载体，hCG是调控PLZF-RARα和RARα-PLZF表达的微基因。构建质粒转化大肠杆菌，氨苄青霉素LB平板筛选出阳性克隆，获得的质粒经酶切及测序鉴定，鉴定正确的质粒，用质粒纯化柱(Qiagen公司)大量制备，经PvuI酶切线性化获得相应的转基因构件。
2、转基因构件显微注射到受精卵雄原核。
3、植入假孕母鼠的输卵管中，发育成熟生出子代小鼠，小鼠的品系为C57BL/6J与CBA杂交鼠。子代小鼠经DNA-PCR鉴定阳性者为转基因阳性鼠。
4、子代小鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配生出F1、F2代。
5、取hCG-PLZF-RARα TM发生急性早幼粒细胞白血病的脾脏或骨髓的冻存或新鲜细胞1×105～1×106尾静脉注射入经450cGay的C57BL/6J受体鼠体内，反复传代5代以上，建成了PLZF-RARα阳性稳定的急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型。
实施例2PLZF-RARa/RARa-PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型1、质粒的构建将人的PLZF-RARα和RARα-PLZF融合基因经酶切，连接，克隆入pUG-hCG(人组织蛋白酶G，human Cathepsin G，hCG)载体，hCG是调控PLZF-RARα和RARα-PLZF表达的微基因。构建质粒转化大肠杆菌，氨苄青霉素LB平板筛选出阳性克隆，获得的质粒经酶切及测序鉴定，鉴定正确的质粒，用质粒纯化柱(Qiagen公司)大量制备，经PvuI酶切线性化获得相应的转基因构件。
2、转基因构件显微注射到受精卵雄原核。
3、植入假孕母鼠的输卵管中，发育成熟生出子代小鼠，小鼠的品系为C57BL/6J与CBA杂交鼠。子代小鼠经DNA-PCR鉴定阳性者为转基因阳性鼠。
4、子代小鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配生出F1、F2代。
5、在此基础上分别将hCG-PLZF-RARα TM(TM转基因鼠)与hCG-RARα-PLZF TM进行交配繁殖，获得hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性TM。
6、取hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性TM发生急性早幼粒细胞白血病的脾脏或骨髓的冻存或新鲜细胞1×105～1×106尾静脉注射入经450cGay的C57BL/6J受体鼠体内，反复传代5代以上，建成了hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性稳定的急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型。
实施例3PLZF-RARα和PLZF-RARα/RARa-PLZF APL移植鼠骨髓和脾脏甩片和病理6-8周龄C57BL/6J小鼠(C57BL/6J小鼠从中科院上海动物中心购买，均为6-8周龄，在SPF级环境下饲养)经450cGy放射照射后，经尾静脉注射1×106发生急性早幼粒细胞白血病的脾脏细胞，观察小鼠的活动状态，两周后开始每周检测血常规，并观察外周血形态，待小鼠发病后，颈椎脱臼法处死小鼠，取骨髓细胞和脾脏细胞用Cytopro甩片仪甩片后晾干，瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态，骨髓象有核细胞分类计数，包括原+早幼粒，中幼+晚幼粒，成熟粒细胞，有核红细胞，淋巴及其他细胞的比例。用部分脾脏细胞继续传代，剩余骨髓和脾脏细胞液氮冻存备用。第三代时同时传代至6-8周龄C57BL/6J小鼠，照射剂量为450cGy。见图1-图8。
实施例4RT-PCR检测PLZF-RARα和RARα-PLZF融合基因在移植鼠模型中的表达分别取PLZF-RARa第3代移植鼠和PLZF-RARa/RARa-PLZF第2代移植鼠的骨髓细胞，用RT-PCR法检测融合基因的表达情况。以野生型小鼠为对照，管家基因GAPDH作为内参。设计的引物跨越hCG基因的第一内含子，以排除基因组DNA的干扰。结果PLZF-RARa第3代移植鼠和PLZF-RARa/RARa-PLZF第2代移植鼠的PLZF-RARa RT-PCR产物经电泳后出现503bp的特异性融合基因条带，RARa-PLZF RT-PCR产物经电泳后前者未见条带，后者出现307bp的特异性融合基因条带，说明移植鼠均有相应特异的融合基因表达。所有被检测小鼠均出现455bp的内参条带见图9。
实施例5移植鼠表面抗原检测为了更加充分地检测移植鼠骨髓和脾脏细胞群体变化，我们利用流式细胞仪分析了骨髓和脾脏细胞表面抗原的改变。共选取四个表面抗原标志小鼠骨髓造血干祖细胞标志CD117，髓系祖细胞标志CD34，髓系晚期标志Gr-1和CD11b。见表1。
表1移植鼠骨髓和脾脏细胞表面抗原 实施例6荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测移植鼠中外源基因的整合情况1 小鼠染色体标本的制备颈椎脱臼法处死小鼠，75％酒精消毒后，于超净台内无菌操作解剖小鼠腹腔，取出后腿骨，冲出骨髓细胞，1000rpm离心10min，计数后以5×105/ml浓度接种于含20％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，按0.4μg/ml终浓度加入秋水仙素使细胞终止于中期分裂相，作用2h后收集细胞悬液，离心弃上清，加入37℃预温0.075mol/L KCl低渗1h，加入0.5ml新鲜配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液预固定，1000rpm离心10min，弃上清。根据细胞量的多少加入固定液，1h后1000rpm离心10min，弃上清。依此方法进行第二、三次固定。固定后按常规方法制备中期染色体标本片，-20℃保存备用。
2 探针制备采用转基因质粒载体hCG作为探针，用Biotin-16-dUTP按试剂盒说明书进行缺口平移标记探针。标记后用琼脂糖凝胶电泳检测探针大小，片段长度在100～1000bp范围为宜。经Sephadex G-50柱层析纯化，去除未标记的寡核苷酸，乙醇沉淀，干燥，溶于杂交液中。-20℃保存备用。
3 染色体荧光原位杂交标本预处理取制备好的小鼠染色体玻片标本，RNase A(100μg/ml)37℃消化1h，2xSSC洗5min×3次，梯度乙醇(70％、90％、100％)脱水，干燥。(2)标本变性及蛋白酶K处理将玻片浸于70％甲酰胺(pH7.0)70℃变性2.5min，迅速浸入预冷70％乙醇中，梯度乙醇脱水，空气干燥；变性后玻片置于0.1μg/ml蛋白酶K溶液中，37℃孵育5min，梯度乙醇脱水；(3)探针变性及预杂交将250ng标记好的探针置75℃水浴中变性10min，立即冰浴5min，37℃水浴1h预杂交；(4)杂交将变性后的探针加在经变性处理后的染色体玻片上，盖玻片覆盖，橡皮水泥封边，37℃湿盒杂交18h；(5)洗脱玻片浸入50％甲酰胺/2xSSC混合液中45℃清洗3次，每次3min，2xSSC清洗3次，每次3min，0.1xSSC清洗2次，每次3min，最后用4xSSC/0.1％Tween20清洗3min并浸于该溶液中；(6)杂交信号的显示和放大向玻片上依次加Avidin-Texred、封闭血清、抗Avidin抗体、Avidin-Texred，其间每个抗体于37℃湿盒孵育45min，然后用4xSSC/0.1％ Tween20清洗3次，每次3min，最后浸于该溶液中；在玻片上滴加DAPI II 10μl，-20℃复染过夜；(7)观察和分析荧光显微镜下观察核型，染色体被染成蓝色，杂交信号为红色。转基因阴性对照小鼠，无杂交信号；PLZF-RARa APL移植鼠，一对杂交信号；PLZF-RARa/RARa-PLZF APL移植鼠两对杂交信号。
实施例7ATRA和SAHA诱导PLZF-RARa APL移植鼠骨髓原代细胞分化凋亡1 小鼠原代细胞培养取PLZF-RARa第五代移植发病鼠骨髓细胞，加入Myelocult M5300培养液(Stemcell technologies)和10ng/ml重组的鼠IL-6(R&D)和10％W3上清培养，细胞密度为3×105。分设对照组、ATRA(1μM)、SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，0.6μM)和ATRA(1μM)与SAHA(0.6μM)(Merck公司惠赠)合用4组，培养24、48、72、96、120小时后分别甩片，24、48小时检测分化指标CD11b，24小时检测凋亡指标AnnexinV。
2 AnnexinV检测取上述加药培养的细胞1×106，用1×PBS洗两次，取1×105细胞加入200μl 1x结合缓冲液(BD Biosciences Phamingen USA)加入FITC标记的Annexin V(50μg/ml，(BD Biosciences Phamingen USA))2.5μl，PI 50μg/ml(BD Biosciences Phamingen，USA)5μl，混匀后室温避光孵育20分钟。补加400μl结合缓冲液，用流式细胞仪检测。
3 观察和分析用ATRA、SAHA和二者联合应用处理第5代PLZF-RARa APL移植鼠原代骨髓细胞，24h后骨髓细胞AnnexinV分别为15.6％、42.4％和40.6％，对照为16.7％；CD11b分别为96％、98.2％和94.5％，对照为95.7％，其它时间点CD11b量亦无明显改变，但各时间点ATRA、SAHA和二者联合应用组荧光强度均有所增强。细胞形态观察发现单用SAHA组或/和与ATRA联用组24h白血病细胞凋亡明显，72h后白血病细胞明显向成熟粒细胞分化，单用ATRA组细胞形态虽然有分化趋势，但与对照相比改变不明显，见图10。
权利要求
1.PLZF-RARa急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型，由以下方法建立(1)质粒的构建PLZF-RARa克隆入pUG-hCG；(2)hCG-PLZF-RARa注射到受精卵雄原核；(3)将步骤(2)的受精卵植入假孕母鼠，获得子代鼠；(4)子代鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配。
2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于还包括(5)取急性早幼粒细胞白血病细胞注射入经450cGay的C57BL/6J受体鼠体内，反复传代5代以上。
3.根据权利要求2所述的模型，其特征在于急性早幼粒细胞注射量为1×105～1×106。
4.根据权利要求2所述的模型，其特征在于注射的细胞为急性早幼粒细胞白血病的脾脏或骨髓的冻存或新鲜细胞。
5.根据权利要求1所述的模型，其特征在于(3)步骤中还包括对子代小鼠DNA-PCR及及RT-PCR鉴定。
6.PLZF-RARa/RARa-PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型，由以下方法建立(1)质粒的构建PLZF-RARα克隆入pUG-hCG、RARα-PLZF克隆入pUG-hCG；(2)hCG-PLZF-RARa注射到受精卵雄原核，RARα-PLZF注射到受精卵雄原核；(3)将步骤(2)的受精卵分别植入假孕母鼠，获得子代鼠；(4)子代鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配。(5)将步骤(4)的hCG-PLZF-RARαTM与hCG-RARα-PLZF TM进行交配繁殖，获得hCG-PLZF-RARα/hCG-RARα-PLZF双阳性TM。
7.根据权利要求6所述的模型，其特征在于还包括(6)取急性早幼粒细胞白血病细胞注射入经450cGay的C57BL/6J受体鼠体内，反复传代5代以上。
8.根据权利要求6所述的模型，其特征在于急性早幼粒细胞注射量为1×105～1×106。
9.根据权利要求6所述的模型，其特征在于注射的细胞为急性早幼粒细胞白血病的脾脏或骨髓的冻存或新鲜细胞。
10.根据权利要求6所述的模型，其特征在于(3)步骤中还包括对子代小鼠DNA-PCR及RT-PCR鉴定。
全文摘要
本发明关于PLZF－RARa和PLZF－RARa/RARa－PLZF急性早幼粒细胞白血病移植鼠模型，其主要由以下方法建立质粒的构建PLZF－RARa克隆入pUG－hCG；hCG－PLZF－RARa注射到受精卵雄原核；将受精卵植入假孕母鼠，获得子代鼠；子代鼠与野生性C57BL/6J小鼠交配。其优点表现在1.可以批量注射，建立足够数量的发病鼠模型，用于药物筛选及发病机制研究，克服了转基因鼠发病散在发病，发病率低的缺陷。2.不需要长期维持传代转基因鼠，降低了成本。
文档编号A61K49/00GK1785434SQ200510110088
公开日2006年6月14日 申请日期2005年11月7日 优先权日2005年11月7日
发明者陈赛娟, 陈竺, 陈丽娟, 任志宏 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院