专利名称：与组织的维持和/或修复相关联的骨髓相关细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及导入了整合有基因的载体并且与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞，以及该细胞的应用。
背景技术：
以往的医疗的主流是以早期发现作为疾病部位的受到损害的器官和组织，发现疾病的病因，以及在早期切除损害部位作为治疗目的。这种治疗极大地依赖于切除后残存的器官或组织的自然痊愈(或恢复)能力。但是，即使在实施这种治疗时，切除量如果超出一定限度，恢复器官或组织原来的功能也会有困难。对这种患者，需要实施器官或组织再生的治疗或者通过从生物体外移植来补充。
最近，以再生医疗为目标的基础研究进一步发展，使用干细胞进行中枢神经功能的再生，或对肌肉萎缩，帕金森症等极为严重的疾病进行治疗，越来越为人们所期待。作为再生医疗的基础的干细胞在分化的过程中是分级的，分化程度越低的干细胞自我复制能力越高。据报道，包含于骨髓细胞中的骨髓干细胞是分化程度较低的细胞，具有多分化能力，可以跨胚层分化(Jiang等人，2002)。此外，骨髓干细胞在使用骨髓细胞的骨·软骨再生、皮肤再生等组织工程领域中已经应用于临床(黑柳，2003)。另一方面，在再生医疗中，不仅是使用非自身的细胞，使用自身的细胞的研究也进一步进展。设计了以自身的骨髓细胞作为供体来源，使之向血管内皮细胞、心肌细胞、神经细胞或肝细胞诱导分化，并用这些细胞进行细胞疗法的策略(高桥，2002)。
另一方面，器官和组织并非只是由实质细胞构成，它们还由作为细胞附着的落足点的细胞外基质和非实质(或间充质)细胞等多种构成因子所构建。因此，通过仅仅以除去或治愈作为导致疾病的目标细胞为目的的治疗方法，难以修复成具有原来的大小和功能的器官和组织。
最近知道，在骨髓移植后的患者中，在多个器官和组织中存在来源于移植的骨髓细胞的细胞，这提示骨髓细胞可能时组织恢复起某种作用(Krause等人，2001)。此外还报道了通过将在生物体外导入了基因的间充质干细胞(Mesenchymal StemCellMSC)返回到体内提高癌症的治疗效果(Ohlsson等人，2003)。可以说这种骨髓干细胞和间充质干细胞在器官和组织的再生和恢复中起着极为重要的作用。
非专利文献1Jiang，Y.等人，Nature，418，41-49(2002)非专利文献2黑柳能光，日本再生医疗学会杂志《再生医疗》，Vol.2，No.3，39-45(2003)非专利文献3高桥淳，日本再生医疗学会杂志《再生医疗》，Vol.2，No.2，67-74(2002)非专利文献4Krause.D.S.等人，Cell，105，369-377(2001)非专利文献5Ohlsson，L.B.et al.，Exp.Mol.Pathol.，75，248-255(2003)发明的公开发明要解决的问题本发明的目的是提供与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞，该细胞是导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞。此外，本发明的目的在于提供转化的骨髓相关细胞的制备方法，其包括用整合了基因的载体将该基因导入到取自于哺乳动物的骨髓相关细胞中。
本发明中，通过制备导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞并利用该细胞，使诊断和治疗与生物体的组织的维持和修复相关联的疾病成为可能。
用于解决问题的方法如前面所述，一般认为骨髓干细胞和间充质细胞在再生医疗中起着重要的作用。以前，进行了以杀死体内癌变的特定细胞为目的、将导入了特定基因的间充质细胞施用到体内的治疗。但是，不同于直接杀死目的细胞的治疗，通过发挥器官和组织原有的自然痊愈能力来治疗疾病的方法，并不为人所知。因此，本发明人致力于制备导入了特定基因的转化的骨髓相关细胞，用于以组织的维持和/或修复为目标的疾病诊断和治疗。具体的是，本发明人通过向骨髓相关细胞预先导入整合了与组织的维持和/或修复相关的基因的载体，将该转化的骨髓相关细胞施用于疾病模型实验动物，成功地恢复了疾病组织的功能，从而完成了本发明。因此，本发明通过提供导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞，有助于满足再生医疗领域中的该细胞的多种需要。
也就是说，根据本发明，可以提供导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞，其是与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞。更为具体的是，本发明涉及以下的发明。
导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞，其中该细胞是与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞。
[1]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述基因是标记基因，或者前述基因是具有下列功能的基因直接参与组织的维持和/或修复，或辅助转化的骨髓相关细胞的维持和/或修复组织的功能。
[2]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述具有直接参与组织的维持和/或修复功能的基因，或辅助所述转化的骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能的基因编码具有控制细胞分化或增殖的活性或具有控制细胞功能的活性的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽选自HGF、FGF、VEGF、PDGF、白细胞介素、GCSF、MCSF、SCF、IFN、Crx和Otx2。
[1]至[3]任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述载体是腺病毒载体或仙台病毒载体。
[4]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述腺病毒载体是携带了HGF基因的腺病毒载体。
[4]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述仙台病毒载体是携带了FGF2基因的仙台病毒载体。
[4]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述仙台病毒载体是携带了IFN基因的仙台病毒载体。
[1]至[7]任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述骨髓相关细胞是骨髓细胞或骨髓来源的细胞。
[1]至[8]任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述组织是疾病组织。
[9]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述疾病是肝脏疾病。
[10]中记载的转化的骨髓相关细胞，其降低血清肝脏酶水平。
[9]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述疾病是癌症。
[12]中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述癌症是肝癌。
[1]至[13]任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其用于施用到外周血管。
转化的骨髓相关细胞的制备方法，其包括用整合了基因的载体将该基因导入到取自于哺乳动物的骨髓相关细胞中。
携带了基因的重组载体在制备转化的骨髓相关细胞中的用途。
用于组织的维持和/或修复的药物，其含有[1]至[14]任一项中记载的转化的骨髓相关细胞。
肝脏疾病治疗药物，其含有[10]中记载的转化的骨髓相关细胞。
[18]中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述肝脏疾病是肝功能障碍，肝功能不全，肝硬化或肝炎。
[18]中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述肝脏疾病是肝癌。
[18]或[19]中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述基因是HGF或FGF2。
[18]或[20]中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述基因是IFN。
[18]中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述载体是腺病毒载体或负链RNA病毒载体。
[23]中记载的肝脏疾病治疗药物，前述载体是缺失了F基因的负链RNA病毒载体。
肝脏疾病治疗药物的制备方法，其包括制备含有[10]中记载的转化的骨髓相关细胞和药学上可接受的介质的组合物的步骤。
[25]中记载的方法，其中所述肝脏疾病是肝功能障碍，肝功能不全，肝硬化或肝炎。
[25]中记载的方法，其中所述肝脏疾病是肝癌。
[25]或[26]中记载的方法，其中所述基因是HGF或FGF2。
[25]或[27]中记载的方法，其中所述基因是IFN。
[25]中记载的方法，其中所述载体是腺病毒载体或负链RNA病毒载体。
[30]中记载的方法，前述载体是缺失了F基因的负链RNA病毒载体。
本发明的导入到转化的骨髓相关细胞中的基因包括标记基因，或具有下述功能的基因直接参与组织的维持和/或修复，或辅助转化的骨髓相关细胞的维持和/或修复组织的功能。本发明的转化的骨髓相关细胞可以用作促进组织的维持和/或修复的药物。
本发明的导入到转化的骨髓相关细胞中的整合了基因的载体，一般地说，只要是能在人、小鼠等哺乳动物来源的细胞中实现基因表达的载体即可，没有特别的限定。优选的是，病毒载体，尤其是重组腺病毒载体或仙台病毒载体等负链RNA病毒载体。前述整合了基因的载体的优选实施方式，包括例如携带HGF基因，FGF-2基因或IFNβ基因的腺病毒载体或仙台病毒载体。前述整合了基因的载体的尤为优选的实施方式是推携带HGF基因的腺病毒载体(adexHGF)，携带FGF-2基因但缺失F基因的仙台病毒载体(FGF2-SeV/ΔF)，携带IFNβ基因但缺失F基因的仙台病毒载体(IFNβ-SeV/ΔF)，更优选的是adexHGF，FGF2-SeV/ΔF和IFNβ-SeV/ΔF。本发明的一个实施方式中可以使用hFGF2-SeV/ΔF，IFNβ-SeV/ΔF作为人用重组腺病毒载体。
在本发明中使用的骨髓相关细胞包括骨髓细胞、骨髓来源的细胞。
由本发明的转化的骨髓相关细胞所维持和/或修复的组织，典型的是疾病组织。此外，在以维持组织原来的功能作为目的时，不限于疾病组织。疾病组织中可列举有炎性疾病，肝病，免疫性疾病，癌性疾病(癌疾患)，遗传疾病(遺伝子疾患)。优选的是炎性疾病，肝病，癌性疾病，更优选的是炎性疾病，肝病。也就是说，本发明的转化的骨髓相关细胞可以在炎症疾病，肝病，免疫性疾病，癌性疾病，遗传疾病等中作为疾病治疗剂使用。更优选的是本发明的转化的骨髓相关细胞可以作为肝病治疗剂使用。细胞可以与适当的药学上可接受的介质一起制成药物组合物。本发明还涉及上述疾病治疗剂的制备方法，该方法包括将携带有基因的载体导入骨髓相关细胞的步骤，还涉及上述载体或转化的骨髓相关细胞在上述疾病治疗剂的制备中的用途。基因优选的是HGF，FGF2或IFNβ。
在本发明的一个实施方式中，通过使用本发明的转化的骨髓相关细胞可以降低血清肝脏酶(肝逸脱酵素)值。也就是说，本发明的转化的骨髓相关细胞可以作为肝脏酶值的降低剂使用。此外，本发明还涉及肝酶值降低剂的制备方法，该方法包括将携带有基因的载体导入骨髓相关细胞的过程，还涉及上述载体或转化的骨髓相关细胞在上述肝酶值降低剂的制备中的用途。基因优选可以使用HGF或FGF2。
此外，在本发明的一个实施方式中，通过使用本发明的转化的骨髓相关细胞可以抑制肝癌等癌症的增殖。也就是说，本发明的转化的骨髓相关细胞可以作为针对肝癌等癌症的治疗剂使用。此外，本发明还涉及癌症治疗剂(或癌细胞增殖抑制剂)的制备方法，该方法包括将携带有基因的载体导入骨髓相关细胞的步骤，还涉及上述载体或转化的骨髓相关细胞在癌症治疗剂(或者癌细胞增殖抑制剂)的制备中的用途。基因优选可以使用IFN，尤其可以使用IFNβ。
本发明的转化的骨髓相关细胞可以但不限于施用于外周血管内，皮下，肌肉内，腹腔内，气管内，脑室内，椎管内，胸腔内。优选施用于外周血管内、皮下，更优选的是施用于外周血管内。
根据本发明，提供制备本发明的转化的骨髓相关细胞的方法。本发明的方法，典型的是包括从叶哺乳动物中取出骨髓相关细胞，用整合了基因的载体导入该基因。
根据本发明，可以提供用于制备转化的骨髓相关细胞的携带基因的重组载体的使用方法。
用于实施本发明的最佳方式以下，为了说明本发明，对优选实施方式进行详述。
(1)骨髓相关细胞用于本发明的转化的骨髓相关细胞的骨髓相关细胞包括骨髓细胞、骨髓来源细胞或其它造血干细胞和血液中的细胞成分。优选的是骨髓细胞、骨髓来源细胞。骨髓细胞是构成骨髓的细胞，是与造血相关的前体细胞的群体。因此骨髓细胞包括许多造血干细胞，例如CD34阳性细胞。处于分化的最终阶段的红细胞是历经由造血干细胞分化的原成红细胞，前成红细胞，多染性成红细胞，正常成红细胞而形成的。此外，白细胞根据颗粒的染色性可以分成中性白细胞，嗜伊红性白细胞，嗜碱性白细胞，淋巴细胞，单核细胞等。尤其是，淋巴细胞有骨髓中成熟的细胞和胸腺中成熟的细胞，一般认为胸腺中成熟的细胞是T细胞，而认为骨髓中成熟的细胞是B细胞。
本说明书中所称“骨髓细胞”是指构成骨髓的细胞中参与造血的前体细胞的群体，不限于特定的细胞。此外，已知前述造血干细胞多存在于骨髓中，但在化疗后的骨髓造血的恢复期和使用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)后，也出现于外周血中，这种造血干细胞被特别称为外周血干细胞。本发明的一个实施方式中，骨髓相关细胞还包括外周血干细胞。此外，已知脐带血中也存在造血干细胞，脐带血中的造血干细胞也包括于骨髓相关细胞中。本发明中适合使用外周血造血干细胞，脐带血造血干细胞和骨髓细胞等造血细胞。
在本说明书中，“骨髓来源细胞”包括来源于骨髓的抗体产生细胞的前体细胞，即B细胞。B细胞是在胎儿期在肝脏中、出生后在骨髓中由干细胞分化的细胞，在分化过程中Ig基因座活化，重组酶基因产物表达，同时诱导IgH链的重排，表达μ链。这个时期的细胞称为前B细胞。一般认为在前B细胞中，μ链表达对随后被诱导的B细胞成熟起重要的作用。进而，L链被诱导重排的B细胞在抗原刺激下分化成抗体产生细胞。此外还包括B细胞以外的血液中的各种细胞成分，例如血小板，红细胞，粒细胞，T细胞等。
此外，为了获得骨髓相关细胞，需要从骨髓或其它造血源的其它细胞中分离多能性干细胞。骨髓细胞可以从骨髓源，例如髂嵴，胫骨，股骨，脊椎或其它骨腔中获得。造血干细胞的其它来源包括胚卵黄囊，胎儿肝脏，胎儿和成人的脾脏，和成人外周血液和脐带血等血液。在从胎儿骨或其它骨源中分离骨髓时，可以使用适于从骨中洗出的平衡盐溶液，一般可以使用含有约5-25mM的低浓度的可接受的缓冲液并补充胎牛血清或其它天然因子的平衡盐溶液。优选的是，缓冲液为Hepes、磷酸缓冲液，乳酸缓冲液。作为其它的方法，可以按照常规的方法从骨中吸取骨髓。例如，对于小鼠的股骨和胫骨来源的骨髓细胞的采集，可以按照Terai，S.等人，J.Biochem.134，551-558(2003)中记载的方法进行。
为了获得骨髓来源细胞，可以使用呈现于骨髓来源细胞的膜表面的、作为标志的抗原，从由前述方法获得的骨髓分离。分离这种骨髓来源细胞的装置包括例如FACS(Becton，Dickinson and Company)。此外，也可以通过将针对呈现于细胞表面的抗原的分子吸附于磁性小珠等上来分离骨髓来源细胞。
在本发明中使用的骨髓相关细胞具体包括脊椎动物、优选哺乳动物来源的细胞，例如人来源，小鼠来源，非洲爪蟾来源，大鼠来源，仓鼠来源，或者猴来源的细胞或由这些细胞建立的培养细胞株等。
包含于骨髓相关细胞的造血干细胞(HSC)可以通过用集落检测法计算粒细胞、单核细胞的前体细胞的数目，或用流式细胞仪测定被认为是HSC特征性的CD34(抗原)阳性细胞来鉴定。具体的是，造血干细胞包括例如具有CD34+，CD38-的表型的细胞，它们为谱系阴性(lineage negative)(lin-)的细胞(Bhatia M.等人，ProcNatl Acad Sci USA，1997；945320-5325)。谱系阴性(lin-)表型可以使用合适的市售试剂盒等进行鉴定和选择；例如GPA，CD3，CD2，CD56，CD24，CD19，CD14，CD16和CD99b均为阴性的表型。
人造血干细胞的分离方法也可以参照以下文献(Leary，AG.Blood 69953，1987；Sutherland HJ，Blood 741563，1989；Andrews RG，J Exp Med 1691721，1989；Terstappen LWMM，Blood 771218，1991；Lansdorp PM，J Exp Med 1751501，1992；Briddell RA，Blood 793159，1992；Gunji Y，Blood 80429，1992；Craig W，J Exp Med1771331，1993；Gunji Y，Blood 823283，1993；Traycoff CN，Exp Hematol 22215，1994；Huang S，Blood 831515，1994；DiGinsto D，Blood 84421，1994；Murray L，Blood85368，1995；Hao QL，Blood 863745，1995；Laver JH，Exp Hematol 231515，1995；Berardi AC，Science 267104，1995；Kawashima I，Blood 874136，1996；Lee mhuis T，Exp Hematol 241215，1996；Civin CI，Blood 884102，1996；Larochelle A，Nature Med21329，1996；Tajima S，J Exp Med 1841357，1996；Sakabe H，Stem Cells 1573，1997；Sakabe H，Leukemia 12728，1998；原田实根等人编，新的造血干细胞移植，南江堂，1998，第9～23页)。
获得骨髓细胞的方法的更具体的例子有，例如，确认骨髓的正常造血后，在全身麻醉下从髂骨和胸骨采集。目标细胞数为3×108至5×108个有核骨髓细胞/Kg左右。1次采集数毫升，经数次采集。在混入了骨组织等的情况下，通过筛网后再装到袋中。在移植时，用粗滤膜输注。同种移植时优选选择人白细胞抗原(humanlymphocyte antigen；HLA)一致的供体。但是，通过移植物抗宿主病(GVHD)预防法的建立，新的免疫抑制剂的开发和CD34阳性细胞的纯化技术等，使得即使HLA不一致的供体也可以移植。作为供体，在HLA-A，HLA-B和-DR这3组6种抗原中优选4种以上，更优选5种以上，更优选全部与受体一致。
从外周血中采集外周血干细胞时，连日皮下注射G-CSF，在被动员的外周血CD34+细胞数达到峰值时进行采集。一般，由于CD34阳性细胞的动员持续数日左右，可以连日进行的外周血干细胞的采集。外周血干细胞(PBSC)的动员和采集还可以参照Harada M.等人J.Hematother 563～71 1996，Waller CF.等人，Bone MarrowTransplant 18279～283，1996 Anderlini P.等人，Blood 90903～908，1997，原田实根等人编，新的造血干细胞移植，南江堂，1998，第67-72页，名古屋BMT小组编，造血细胞移植手册修订第三版，2004，第237-240页。作为动员中使用的G-CSF，除了野生型蛋白质以外，还可以使用改变了N末端的衍生物(nartograstin等)，添加了糖链的修饰蛋白质(lenograstin，非格司亭等)。此外，G-CSF也可以与其它造血因子一起使用。例如，可以与GM-CSF，IL-3或SCF等一起使用(Huhn RD.等人，ExpHematol 24839-847，1996；Begley C G.等人，Blood 903378-3389，1997；Lane TA.等人，Blood 85275-282，1995)。施用G-CSF时，为了减轻腰痛，骨痛和发热等全身症状和防止血小板凝集能力亢进，可以施用阿司匹林。
由于如果直接输注混入的血小板有时会导致塞栓等，优选在采集后除去血小板。例如，可以集中在双袋中进行弱离心(200g，15分钟)，分注到离心管中，以1600rpm离心10分钟除去血小板，再更换为RPMI1640培养基。在冷冻保存采集的细胞时，是指悬浮于含有10％自身血清，10％DMSO的RPMI1640培养基中使之冷冻，用程序式冰箱(programmed freezer)冷冻，在液氮中保存。细胞浓度可以为2×107至6×107/ml。为了较短时间保存细胞，可以将细胞悬浮液(1×108/ml以下的浓度)与等量的冰冷的保存液混合，使得终浓度为6％羟乙基淀粉(Hydrodyethyl Starch，HES)，5％DMSO，4％白蛋白，在-80℃的低温冰箱中冷冻保存(Knudsen LM等人，J.Hematother.5399-406，1996)。
在脐带血干细胞制备时，在脐带血中加入红细胞沉淀剂(HES)，将上层回收到新的袋中，通过离心分离浓缩细胞。回收的细胞可以加入冷冻保护液，用设定程序式冰箱冷冻。
用连续式血液成分分离装置获得的细胞悬浮液由于极少混入粒细胞和红细胞，因此可以省略单核细胞分离操作。在含有很多粒细胞和红细胞时可以通过Ficoll比重离心法分离单核细胞。对于骨髓液，为了除去粒细胞和红细胞和浓缩，可以通过Ficoll处理或血液分离装置进行单核细胞分离。为了从获得的细胞级分中纯化CD34阳性细胞，可以使用例如Isolex system(Nexell公司)或CliniMACS(AmCell公司)等。
并且，分离的骨髓相关细胞，还可以通过例如甲基纤维素法，添加SCF，IL-3，GM-CSF，G-CSF，Epo(Sonoda，Y.等人，Blood 544099-4106，1994；Kimura等人.，Blood 904767-4778，1997)进行培养。以1×102至1×104/ml左右添加细胞，例如在37℃，5％CO2，5％O2下培养。但是，培养条件可以适当调整。
在自身移植时使用的CD34阳性细胞数为例如2×106/Kg左右(SchotsR.等人，Bone Marrow Transplant.17509-515，1996；Zimmerman T等人，Bone MarrowTransplant.15439-444，1995)。CD34阳性细胞数通常可以通过双色流式细胞仪测量。具体的是，通过溶血处理，从骨髓细胞和经过血液成分部分清除(apheresis)的外周血细胞中除去红细胞后，用前向散射和抗CD45抗体展开，设门除去红细胞和血小板。接着，用侧向散射抗CD45抗体展开该门，计算除去嗜中性粒细胞等非特异反应部分的级分中的细胞数与总细胞数的比率。根据该值和预先用血细胞计数器测定的血细胞数，可以计算总CD34阳性细胞数。
包含于冷冻保存的细胞中的活的干细胞的数目可以通过集落形成法计算CFU-GM的方法了解。移植所需要的CFU-GM的标准一般是1×105/kg-2×105/Kg。
(2)本发明的转化的骨髓相关细胞本发明的转化的骨髓相关细胞是导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞。
在骨髓相关细胞的转化中使用的基因包括标记基因，或者直接参与组织的维持和/或修复的基因，或对转化的骨髓相关细胞的维持和/或修复组织的功能起辅助作用的基因。
直接参与组织的维持和/或修复、或对转化的骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能起辅助作用的基因，可以在转化的骨髓相关细胞中表达，该基因产物在组织的维持和/或修复中直接起作用。或者该基因产物也可以直接或间接地对骨髓相关细胞原有的组织维持和/或修复功能起辅助作用。可以在本发明中使用的基因的实施方案包括这样的基因，该基因编码具有调控细胞的分化、增殖和各种功能的活性的蛋白质或肽，该蛋白质或肽可以选自HGF，FGF，VEGF，PDGF，白细胞介素，GCSF，MCSF，SCF，IFN，Crx和Otx2。这种基因的核酸序列的信息可以从基因数据库(例如，NCBI)获得。因此，本领域技术人员利用获得的基因的信息可以将该基因整合到表达载体等中。
例如，肝细胞增殖因子(HGF)已由Miyazawa等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.163，967～973，1989，Nakamura等人，Nature，342，440～443，1989，Seki等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.172，321～327，1990，Tashiro等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3200～3204，1990，Okajima等人，Eur.J.Biochem.193，375-381，1990，Nakamura等人，J.Clin.Invest.106，1511-1159，2000等报道。HGF除了天然多肽之外已知还有许多变体。例如，还可以使用编码记载于特开平5-111383，美国专利第4683195号，第4816567号，第4745055号，第4444878号，欧洲专利第256654号，第120694号，第125023号，第255694号，第266663号，国际公开第88/03559号，第88/03565号，第94/06456号中的HGF及其衍生物的基因。此外，还可以使用人HGF的氨基酸第534，673和/或692位的氨基酸被取代的HGF(特开2004-000236号)。HGF基因的碱基序列也记载于登录号NM_000601的第166-2349位和NM_001010932的第166-2334位，HGF基因的氨基酸序列也记载于登录号NP_000592和NP_001010932中。进而，作为HGF，也可以使用添加了免疫球蛋白恒定区和纤连蛋白片段等所希望的多肽的融合蛋白质(特开2004-269423，国际公开第91/08298号)。
成纤维细胞生长因子2(FGF2)也称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，已知是具有促进成纤维细胞和血管内皮细胞，软骨，成骨细胞，表皮细胞等各种细胞的增殖的活性的因子(Abraham等人，EMBO J.，5，2523～2528，1986，Prats等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，1836-1840，1989)。例如，FGF2基因的碱基序列也记载于登录号NM_002006第69-932位，FGF2的氨基酸序列也记载于登录号NP_001997中。FGF2不但可以是天然蛋白质，也可以是通过重组DNA技术基因工程制备的蛋白质和它们的修饰体。例如可以列举有记载于国际公开第87/01758号，第89/04832号，第86/07595号和第87/03885号，欧洲专利申请公开第237966号，第281822号，第326907号，第394951号，第493737号等的FGF2。
如果是干扰素(IFN)，例如IFN-α，可以参照Gren等人(1984)J.Interferon Res.4(4)609～617和Weismann等人(1982)Princess Takamatsu Symp.121～22中，IFNβ可以参照Derynck，R.等人，Nature 285，542～547(1980)；Higashi，Y.等人，J.Biol.Chem.258，9522-9529(1983)；KugaT.et al.，NucleicAcids Res.17，3291(1989)。例如，IFN-α1基因的碱基序列也记载于登录号NM_024013的第68-634位，IFN-α1基因的氨基酸序列也记载于登录号NP_076918。IFN-β基因的碱基序列也记载于登录号NM_002176的第76-636位，IFN-β基因的氨基酸序列也记载于登录号NP_002167。IFN-γ基因的碱基序列也记载于登录号NM_000619的第127-624位，IFN-γ基因的氨基酸序列也记载于登录号NP_000610。上述细胞因子存在多态和衍生物。只要是野生型具有同等活性的多态和衍生物，就可以适当使用。在本发明中，IFN包括IFN-α，IFN-β和IFN-γ，优选为I型IFN(IFN-α和-β)。
各种细胞因子及其衍生物的生物学活性可以通过公知的方法检测。例如，对于HGF，可以通过检测体内或体外肝细胞增殖的促进来测定。具体的是，通过向原代培养的肝细胞中添加天然或人工的HGF，检测细胞DNA合成的增强，来鉴定对肝细胞分裂的促进作用。肝细胞的DNA合成可以通过摄取[3H]胸腺嘧啶核苷来检测(Nakamura，Biochem.Biophys.Res.Comm.122，140-1459，1984，同作者，J.Biochem.94，1029-1035，1983)。对于FGF2，可以用与上述相同方式检测对成纤维细胞或血管内皮细胞等的增殖促进活性。对于IFN，通过检测例如对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)的细胞毒性的抑制，可以测定抗病毒活性。具体的是，在WISH细胞(CCL-25；A.T.C.C.(美国典型培养物保藏中心，(American TypeCulture Collection)，Manassas，VA，U.S.A.)中接种水泡性口炎印第安纳病毒(Vesicularstomatitis Indiana virus)[VR-1238AF；A.T.C.C.]，检测由病毒导致的细胞死亡，以测定由IFN产生的保护作用(测定条件按照Knezic，Z.，等人(1993)Antiviral Res.25，215～221)。
本说明书中，所谓“细胞的分化增殖调控活性”是指在量上调控细胞，以增加具有目的功能的细胞的活性。
本说明书中，所谓“细胞的功能调控活性”是指在质上调控细胞的功能，以在已经存在的细胞中提高目的功能。
本说明书中，所谓“与免疫抑制相关的因子”是指具有减弱，避免免疫反应，或主动诱导免疫耐受的活性的蛋白质、肽。
本说明书中，所谓“标记”是指编码适于组织或细胞的免疫组织学染色或者直接或间接免疫荧光染色的蛋白质的基因。优选的是GFP，Liv2，HNF4，A6，白蛋白，荧光素酶，β-半乳糖苷酶，SEAP，更优选的是GFP，荧光素酶，β-半乳糖苷酶，更为优选的是GFP。并且，GFP是绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein)的简称。
这些标记基因在被转化的骨髓相关细胞中被表达，可以通过相应于标记基因的种类的公知方法检测。例如，GFP可以在490nm至520nm的范围内进行荧光检测。因此，通过直接或间接免疫荧光染色，可以用荧光显微镜观察在前述骨髓细胞的组织中的定位。
进而，也可以使用发更强荧光的GFP变异体EGFP(enhanced green fluorescentprotein，增强绿色荧光蛋白)，YFP(yellow fluorescent protein，黄色荧光蛋白)，BFP(blue fluorescent protein，蓝色荧光蛋白)，RFP(red fluorescent protein，红色荧光蛋白)(例如可以从Clontech公司获得)等作为标记。
向骨髓相关细胞中整合基因的载体，可以是在本领域中可以简单获得的表达载体。表达载体的种类，只要是具有在骨髓相关细胞中表达所希望的基因从而生产所希望的蛋白质的功能的载体，没有特别的限定。例如，包括病毒载体，质粒载体，噬菌体载体等。病毒载体优选的是腺病毒载体、包括仙台病毒载体在内的负链RNA病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体和包括慢病毒等在内的逆转录病毒等。特别优选的是腺病毒载体和包括仙台病毒载体等的负链RNA病毒载体。
使用病毒载体的基因导入法和基因表达可以按照村松，山本编辑《实验医学增刊新订新基因工程手册》修订版(羊土社)，1999年，p202-215进行。已知病毒载体在动物培养细胞中表达效率高。如后述实施例1中所记载的，对于骨髓细胞中的基因表达，腺病毒载体和仙台病毒载体均在80％以上的细胞中确认了表达。通过使用这种病毒载体，可以在不杀死导入基因的细胞的条件下进行基因表达，从而可以研究该基因的功能。此外，已知重组病毒载体的制备法的效率极低，但是通过采用例如COS-TPC法(Miyake，S.，等人，Proc.Natl.Aca d.Sci.USA，93，1320-1324(1996)，可以提高制备效率。
进一步的例子还有，腺病毒载体的制备可以按照齐藤等人的方法及其它方法(Miyake等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，1320～1324，1996，Kanegae等人，Acta Paediatr.Jpn，第38卷，182～188，1996，鍾ケ江等人，细胞工程，第13卷，第8期，757-763，1994)进行制备。此外，例如如果是逆转录病毒，可以通过胁本等人，蛋白质核酸酶，第40卷，2508-2513，1995的方法制备载体，如果是腺相关病毒，可以通过玉寄等人，蛋白质核酸酶，第40卷，2532-2538，1995的方法制备载体。可以在哺乳动物中导入基因的其它病毒载体的制备方法在如下有详细说明制备重组痘苗病毒的方法，有特表平6-502069，特公平6-95937，特公平6-71429。制备重组乳头瘤病毒的方法有特公平6-34727，特表平6-505626。制备重组腺相关病毒的方法有特开平5-308975。制备重组腺病毒的方法有特表平6-508039。对负链RNA病毒，已知有国际公开号97/16539，97/16538，00/70055，00/70070等中记载的方法。
作为负链RNA病毒，尤为优选的是在基因组中具有单链负链(negative)[即负链(minus)]RNA的单链负链RNA病毒(也称为非分节型(non-segmented)负链病毒)。这样的病毒包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae；包括副粘病毒属(Paramyxovirus)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)和肺病毒属(Pneumovirus)等)，弹状病毒科(Rhabdoviridae；包括水泡性病毒属(Vesiculovirus)，狂犬病毒属(Lyssavirus)，和短暂热病毒属(Ephemerovirus)等)，纤丝病毒科(Filoviridae)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae；包括流感病毒(Influenza virus)A，B，C，和索哥托样病毒(Thogoto-like viruses)等)，布尼亚病毒科(Bunyaviridae；包括布尼亚病毒属(Bunyavirus)，汉坦病毒属(Hantavirus)，内罗病毒属(Nairovirus)和白蛉病毒属(Phlebovirus)等)，和沙粒病毒科(Arenaviridae)等科的病毒。
可以在本发明中使用的负链RNA病毒，更为优选的是属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属(Respirovirus)，腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，更优选的是属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中包括以不损害病毒的基因导入能力的方式改变了病毒基因的病毒和经化学修饰的病毒等。可以应用于本发明的呼吸道病毒属病毒包括例如人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(Sendai virus；也称为小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明中的副粘病毒最优选为仙台病毒。这些病毒也可以是来源于天然株，野生株，变异株，实验室传代株及人工构建株等的病毒。
此外，本发明中使用的负链RNA病毒载体优选为缺失了1个或多个包膜构成蛋白质的基因的载体。所谓包膜构成蛋白质，是指作为病毒的包膜成分的病毒蛋白质，其包括露出于包膜表面的在向细胞粘着或感染中起作用的刺突蛋白质和在包膜形成等中起作用的衬底(裹打ち)蛋白质。通常，包膜构成蛋白质的基因包括例如F(融合)，HN(血凝素-神经氨酸酶)和M(基质)，某些病毒种类包括H(血凝素)，M1和G等基因。由于这些包膜结构蛋白质的1个或多个基因变异和/或缺失的病毒感染细胞中感染性病毒颗粒的形成能力降低，因此安全性高。此外，细胞毒性显著降低。从基因组中缺失的基因包括例如F基因，HN(或者H)基因和M基因或它们的任意组合。特别优选的是F基因缺失。缺失F基因是指至少缺失F基因，还可以缺失其它基因。更优选的是至少缺失F基因和HN(或者H)基因。更为优选的是缺失F基因、HN(或者H)基因和M基因。
更具体的重组负链RNA病毒载体的重建可以参照以下文献(国际公开号(WO)97/16539；WO97/16538；WO00/70055；W00/70070；W01/18223；WO03/025570；Durbin，A.P.等人，Virology，1997235；323～332；Whelan，S.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，199592；8388～8392；Schnell.M.J.等人，EMBO J.，199413；4195～4203；Radecke，E.等人，EMBO J.，199514；5773～5784；Lawson，N.D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，924477～4481；Garcin，D等人，EMBO J.，199514；6087-6094；Kato，A.等人，Genes Cells.，19961；569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，J.Virol.199771；1265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，199693；15400-15404；Hasan，M.K.等人，J.Gen.Virol.，199778；2813-2820，Kato，A.等人，EMBO J.，199716；578-587，Yu，D.等人，GenesCells，19972；457-466，Tokusumi，T.等人，Virus Res.，200286；33-38，Li，H.O.等人，J.Virol.，200074；6564-6569；Hirata，T.等人，J.Virol.Methods，2002104；125～133；Inoue，M.等人，J.Virol.，200377；6419～6429；Inoue M.等人，J.Gene Med..2004；61069～1081)。通过这些方法，可以从DNA重建包括副流感病毒，水泡性口炎病毒，狂犬病病毒，麻疹病毒，牛瘟麻疹病毒，仙台病毒等的负链RNA病毒。
重组病毒载体的优选实施方式为adexHGF(携带了HGF基因的腺病毒载体)，FGF2-SeV/ΔF(携带了FGF-2基因且缺失F基因片段的仙台病毒载体)和IFNβ-SeV/ΔF(携带IFNβ基因且缺失F基因片段的仙台病毒载体)。更优选的是adexHGF，hFGF2-SeV/ΔF和IFNβ-SeV/ΔF。具体的是，如后述实施例2所记载的，本发明的骨髓相关细胞可以通过感染adexHGF，hFGF2-SeV/ΔF，IFN β-SeV/ΔF等来制备。
在本发明的一个实施方式中，不限于病毒载体，还可以使用通常使用于动物细胞的重组载体。将基因整合到质粒等载体中的方法包括例如Sambrook，J.等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，1.1(2001)中记载的方法。简便地，还可以使用市售的连接(ligation)试剂盒(例如宝酒造制等)。这样制得的重组载体(例如重组质粒)可以通过氯化钙法，电穿孔法，和PEG等化学处理方法导入宿主细胞(例如，大肠杆菌DH5αDH10BAC或XL-1Blue等)，并扩增和纯化(Sambrook，J.等人，前述)。另外，重组表达载体的构建可以按照常规方法进行，也可以使用例如不需要限制性酶处理和连接操作的Gateway系统(Invitrogen公司)进行。表达载体的种类没有特别的限定，例如用于哺乳类细胞的表达载体优选的是pFLAG-CMV1，pcDNA3.1，pGreenLantern等。本发明的转化的骨髓相关细胞可以通过将重组表达载体导入到骨髓相关细胞中来获得。
在本发明的一个实施方式中，维持和/或修复的对象组织包括疾病组织。这里，所谓疾病是指由细菌感染，病毒感染，乙醇摄入，药物施用，癌变，基因表达异常等导致的生物体的一部分或全部器官或组织无法维持正常的功能的状态，或者存在这种状态的患者。所述疾病包括，但不限于，炎性疾病，肝病，免疫性疾病，癌性疾病，遗传疾病等。在本发明的一个实施方式中，炎性疾病包括肝病。优选的是肝功能障碍，肝功能不全，肝炎，肝硬化，脂肪肝，肝癌，更优选的是肝功能障碍，肝功能不全，肝炎。也就是说，本发明涉及肝脏疾病治疗药物的制备方法，该方法使用携带基因的载体，所述基因具有对骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能进行辅助的功能；本发明还涉及携带了所述具有对骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能进行辅助的功能的基因的所述载体在该肝脏疾病治疗药物的制备中的用途，和导入了该载体的骨髓相关细胞的相同用途。通过施用本发明的转化的骨髓相关细胞，可以降低血清肝脏酶GOT，GPT，LDH的测定值，并改善肝功能。因此，本发明涉及肝功能改善剂的制备方法，该方法使用携带基因的载体，所述基因具有对骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能进行辅助的功能；本发明还涉及携带了所述具有对骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能进行辅助的功能的基因的所述载体在该肝功能改善剂的制备中的用途，和导入了该载体的骨髓相关细胞的相同用途。作为携带于载体中的基因，特别是，可以列举有HGF，FGF2和IFNβ。
具体的是，本发明还包括以下发明。
(1)肝病治疗药物的制备方法，其包括向骨髓相关细胞导入编码HGF，FGF2或IFN的载体的步骤。
(2)根据(1)中记载的方法，所述载体编码HGF或FGF2。
(3)根据(1)中记载的方法，所述载体编码IFN。
(4)根据(2)中记载的方法，所述肝病是肝功能障碍，肝功能不全，肝硬化或肝炎。
(5)根据(3)中记载的方法，所述肝病是肝癌。
(6)根据(1)至(5)任一项中记载的方法，该载体是腺病毒载体或负链RNA病毒载体。
(7)根据(6)中记载的方法，该载体是缺失了F基因的负链RNA病毒载体。
(8)根据(6)或(7)中记载的方法，所述负链RNA病毒载体是仙台病毒载体。
(9)通过上述(1)-(8)任一项中记载的方法制备的肝病治疗药物(10)抗癌剂，其含有导入了编码IFN的载体的骨髓相关细胞和药学上可接受的介质。
(11)根据(10)中记载的抗癌剂，所述癌是肝癌。
(12)根据(10)或(11)中记载的抗癌剂，所述载体是腺病毒载体或负链RNA病毒载体。
(13)根据(12)中记载的抗癌剂，所述载体是缺失了F基因的负链RNA病毒载体。
(14)根据(12)或(14)中记载的抗癌剂，所述负链RNA病毒载体是仙台病毒载体。
在本发明的一个实施方式中，通过使用本发明的转化的骨髓相关细胞被维持和/或修复的对象可以是器官。器官包括例如肝脏，肾脏，心脏。
在本发明的一个实施方式中，作为维持和/或修复的对象的组织包括组织移植后的组织。移植组织包括但不限于皮肤组织和各种器官(例如肝脏，肾脏，心脏)的组织。另外，移植组织可以是自身或非自身的组织。此外，移植组织不限于从生物体取出的组织，也可以是从生物体取出细胞或组织的一部分，并在生物体外培养增殖的培养组织，或将该细胞或组织整合到生物相容材料中的人工培养组织。
在说明书中，所谓组织的“维持和/或修复”是指组织或构成组织的细胞保持其一定功能，将因疾病而受损的功能恢复到一定水平，或者在疾病部位切除后组织的重建(再生)。例如，在本发明的一个实施方式中，可以降低肝脏疾病中的血清肝脏酶GOT，GPT，LDH的测定值。这里，通过使用本发明的转化的骨髓相关细胞，所谓“降低血清肝脏酶水平”是指在肝病中血清肝脏酶值降低到1/3或以下，优选1/5或以下，更优选1/10或以下，更优选1/20或以下，更为优选1/30或以下，最优选降低到正常值。如后述实施例2中所记载的，本发明的转化的骨髓相关细胞可以将肝脏疾病的GOT，GPT，LDH分别降低到大约1/23，1/22和1/14。GOT是谷氨酸草酰乙酸转氨酶的简称，GPT是谷氨酸丙酮酸转氨酶的简称，LDH是乳酸脱氢酶的简称。
按照本发明，只要可以安全且有效地施用本发明的转化的骨髓相关细胞，其施用途径没有特别的限定。只要满足这种条件，也可以施用于外周血管内、皮下、肌肉内、局部、腹腔内、脑室内、椎管内、胸腔内。优选施用于外周血管内、皮下，更优选施用于外周血管内。施用施用剂型没有特别的限定，本领域技术人员可以选择适合前述施用途径的剂型。例如，本发明的转化的骨髓相关细胞可以在缓冲溶液等中悬浮，作为溶液剂型使用。一般而言，施用时的转化的骨髓相关细胞的使用浓度，对于溶液剂型，为每天约1×104细胞/ml至约1×1011细胞ml的细胞密度，施用量为约1ml至约100ml。此外，也可以将每日的量适当分成多次施用。本领域技术人员可以根据施用患者的年龄，体重，症状，施用途径，给药时程，治疗过程，施用剂型进行变化。作为施用对象的动物没有特别的限定，包括例如所希望的哺乳动物，如小鼠，大鼠，狗，猪，猫，牛，家兔，绵羊，山羊，猴等非人类哺乳动物和人。
为了防止由于血小板混入输液而导致的血栓和栓塞，可以预先施用抗组胺剂(羟嗪(hydroxyzine)25mg或氯苯那敏(chlorphenirmine)5mg)或肾上腺皮质类固醇(氢化可的松(hydrocortisone)100mg)。移植时使用冷冻细胞时，抑制细胞溶液中的红细胞的溶血成为问题时，可以通过用4000单位的触珠蛋白制剂点滴等预防肾小管损伤。在外周血干细胞移植时还优选分成两天输注。
根据本发明，可以提供制备转化的骨髓相关细胞的方法，其包括使用整合有基因的载体将该基因导入取自于哺乳动物的骨髓相关细胞中。制备本发明的转化的骨髓相关细胞的方法包括(i)从哺乳动物中取出骨髓相关细胞，(ii)将基因整合到载体中，和(iii)将(ii)制备的载体导入到(i)的骨髓相关细胞中。可以在各步骤中使用的方法如上所述。但是骨髓相关细胞的制备和载体的制备可以与载体向骨髓相关细胞的导入分开独立进行。
载体向骨髓相关细胞的导入，如果是质粒载体等，可以使用例如磷酸钙法(Graham，F.L.和Van Der Eb，J.Virology，197352；456；Wigler，M.和Sflverstein，S.，Cell.197711；223；Chen，C.和Okaynma，H.Mol.Cell.Biol.，19877；2745)，使用各种转染试剂的方法或电穿孔法等。对于转染试剂，可以使用DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885M.W.5×105)，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TransIT-LT1(Mirus，产品号.MIR 2300)等。使用病毒载体时，可以通过在适当的生理水溶液中使骨髓相关细胞与病毒载体接触而导入。病毒载体与骨髓相关细胞的接触可以在体内(in vivo)或体外(体外(in vitro)或回体(exvivo))进行，可以在例如培养液，生理盐水，血液，血浆，血清，体液等所希望的生理水溶液中实施。
在载体与骨髓相关细胞的接触中，MOI(感染复数；均值每个细胞的感染病毒数)优选1-500，更优选2-300，更优选3-200，更优选5-100，更优选7-70。导入了载体的骨髓相关细胞可以与药学上可接受的所希望的载体或介质组合形成移植组合物。所谓“药学上可接受的载体或介质”只要是可以悬浮活细胞的溶液即可，没有限制。例如有磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，氯化钠溶液，林格溶液，培养液等。
根据本发明，可以提供用于制备本发明的转化的骨髓相关细胞的携带基因的重组载体的使用方法。
根据本发明，可以提供组织维持和/或修复的方法，其包括向生物体内施用本发明的转化的骨髓相关细胞。
根据本发明，可以提供使用本发明的转化的骨髓相关细胞诊断疾病的方法。本发明的方法可以以如下方式进行在生物体内施用导入了整合有标记基因的载体的本发明的转化的骨髓相关细胞，并观察疾病组织中的修复过程。
在发明的一个实施方式中，可以使用在病毒载体中整合了编码GFP的基因作为标记基因的adexGFP，GFP-SeV/ΔF等。更具体的是，如后述实施例3中记载的，使用大鼠时，将adexGFP或GFP-SeV/ΔF导入到采集的骨髓细胞中，再将被转化的骨髓细胞施用于大鼠的外周血管。骨髓细胞的采集的详细的方法可以按照Terai等人(2003)的报告(前述)进行。在对大鼠施用后经过一定时间后(例如24小时后，48小时后)，从大鼠采集组织(例如肝脏，肝组织)，冷冻干燥后制成组织切片。这种组织的采集，固定法，切片的制作等可以按照常规方法进行。组织中的修复过程的经过可以这样来观察对经过一定时间后的各组织进行例如直接或间接免疫荧光染色，再利用荧光显微镜观察前述骨髓细胞在组织中的定位。通过荧光染色的组织观察可以按照Terai等人(2003)，Li等人(2003)的报告(前述)中记载的方法进行。本领域技术人员也可以根据使用的标记基因的种类使用适当的组织观察方法。
实施例以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明不应为以下的本领域技术人员根据本说明书的描述可以容易地对本发明进行修改、变化，这些修改和变化均包含于本发明的技术范围中。
并且，本说明书中引用的文献作为本说明书的一部分并入本文。
实施例1基因表达的评价使用携带GFP基因的腺病毒载体(adexGFP)，携带GFP基因的F基因缺失型仙台病毒(GFP-SeV/ΔF)载体进行骨髓细胞中的基因表达的评价。骨髓细胞从雄性Wister大鼠(10-12周龄，体重250-300g/只；日本CLEA)的股骨中采集。骨髓细胞的采集按照Terai等人(前述)中记载的方法进行。将制备的骨髓细胞悬浮液以每孔1ml分别接种于24孔板中(Corning)。立刻用adexGFP以20MOI，或用GFP-SeV/ΔF以10MOI的浓度感染培养的骨髓细胞。用磁力搅拌器搅拌15分钟，然后在37℃下培养30分钟。将该步骤再进行一遍。然后，用PBS清洗骨髓细胞两次，以1ml/孔加入生理盐水，导入基因48小时后回收骨髓细胞，用FACS(Becton，Dickinson andCompany)评价基因表达。
adexGFP和GFP-SeV/ΔF均在80％以上的骨髓细胞中确认了基因表达。此外，基因表达强度(均值通道偏移(mean channel shift))，adexGFP为12.6±0.2，GFP-SeV/ΔF为16.6±0.4，故仙台病毒较优。并且，在对照组的非感染细胞中为1.9±0.5。
实施例2肝疾病动物模型中肝功能的修复使用实验动物来研究疾病组织的修复中本发明的转化的骨髓相关细胞的作用。动物使用与实施例1相同的雄性Wister大鼠。作为肝疾病的急性肝功能不全模型通过以0.4ml/kg/只给大鼠腹腔内注射四氧化碳(CCl4；Sigma)制备。骨髓细胞的采集按照Terai等人的报告(前述)中记载的方法进行。将从同系大鼠的股骨采集的骨髓细胞用平衡盐溶液调整成1×108细胞/ml。导入到该细胞中的基因是编码HGF或hFGF-2的基因，分别整合这些基因的携带HGF基因的腺病毒载体(adexHGF；理研GenBank，RDB No.1553)和携带hFGF-2的F基因缺失型仙台病毒载体(hFGF2-SeV/ΔF；Li，O.H.et al.，J.Virol.，74，6564-6569(2000)，Masaki，I.et al.，Circ.Res.，90，966-976(2002)作为重组载体使用。
将制备的细胞悬浮液以每孔1ml分别接种于24孔板(Corning)中。立刻用adexHGF以20MOI，或用hFGF2-SeV/ΔF以10MOI的浓度感染培养的骨髓细胞。用磁力搅拌器搅拌15分钟，然后在37℃下培养30分钟。将该步骤再进行一遍。然后，用PBS清洗骨髓细胞两次，以1ml/孔加入生理盐水，制备作为用于施用的骨髓细胞的悬浮液。另一方面，CCl4施用4小时后，从大鼠的外周静脉(尾静脉)注射1ml(1×108细胞/ml)准备的骨髓细胞，采集CCl4施用24小时后的血清，测定血清肝脏酶(GOT，GPT，LDH)值。用CicaLiquid AST测定GOT的酶活性，用CicaLiquid ALT测定GPT的酶活性，用CicaLiquid LDHJ(均为关东化学制)测定LDH的酶活性。
大鼠急性肝功能不全模型中的CCl4施用24小时后的血清肝脏酶(GOT，GPT，LDH)的测定值示于表1。GOT，GPT，LDH的任一项的正常值都在30IU/l或以下。
表1由转化的骨髓细胞产生的肝功能不全模型中的血清肝脏酶值的改善
(单位IU/l)通过施用导入了HGF或hFGF-2的基因的骨髓细胞，与未治疗组相比，观察到血清肝脏酶值显著降低。HGF和hFGF-2比较，hFGF-2的效果更好。与未治疗组相比，GOT值减少至约1/23，GPT值减少至约1/22，LDH值减少至约1/14。以上结果提示在肝功能障碍进行的过程中通过从外周静脉施用导入基因的骨髓相关细胞可以促进肝功能障碍的修复，治疗。
实施例3组织修复的过程观察急性肝功能不全模型大鼠的肝组织中的修复过程可以通过施用导入了GFP等标记基因的骨髓细胞进行研究。可以通过大鼠的外周血管施用adexGFP或GFP-SeV/ΔF基因导入的骨髓细胞，在一定时间后从大鼠采集肝脏，冷冻干燥后制成肝组织切片。肝组织中的修复过程的过程观察可以这样进行将经过一定时间后的各肝组织直接或间接免疫荧光染色，再用荧光显微镜观察前述骨髓细胞在组织中的定位。通过荧光染色的组织观察可以按照Terai等人(2003)，Li等人(2000)的报告(前述)中记载的方法进行。
实施例4基因导入的骨髓细胞对肝癌的治疗效果雄性Wister大鼠(日本CLEA)出生后5周起，每周一次腹腔内注射1％二甲基亚硝胺(DMN)，注射7周，进而每天饲喂加入了苯巴比妥的饲料(中部科学饲料)喂养12周，从而制成肝癌模型。这些大鼠于实验开始6个月后在以下实验中使用。骨髓细胞移植实验按照Terai等人的报告(Terai，S.等人，J.Biochem.134，551-558(2003)))中记载的方法进行。从相同Wister大鼠的股骨采集骨髓细胞，调整成1×108细胞/ml。基因导入使用携带人干扰素β(IFNβ)基因的F基因缺失型仙台病毒载体(hIFNβ-SeV/ΔFLi，HO.等人，J.Virol 71，6564-6569(2000))。用24孔板以MOI＝10进行hIFN β-SeV/ΔF感染。用磁力搅拌器搅拌15分钟，进行两次30分钟温育。用PBS清洗骨髓细胞两次，加入lml生理盐水。从外周静脉(尾静脉)注射这样制备的通过hIFNβ-SeV/ΔF导入了hIFNβ基因的骨髓细胞(1×108细胞/ml)。骨髓细胞注射1个月后处死所述动物，测定肿瘤数和肿瘤长径，与在没有进行骨髓注射的对照的肝癌模型中的肿瘤数、肿瘤长径进行比较。
其结果是，在骨髓细胞注射1个月后的肝癌模型中，肿瘤数(number)/肿瘤直径(mm)为未治疗组(n＝5)11±2.3/2.6±0.8用hIFNβ-SeV/ΔF导入骨髓细胞注射组(BM+hIFNβ-SeV/ΔF)(n＝5)3.6±0.5/0.7±0.1(均值±S.D.)。以上结果显示，施用通过hIFNβ-SeV/ΔF导入了hIFNβ基因的骨髓细胞抑制肝癌的进展或者对肝癌有修复、治疗作用。
实施例5肝切除模型中基因导入骨髓细胞的治疗效果使用雄性Wister大鼠(10-12周龄，250-300g日本CLEA)，施行70％肝切除(肝左叶切除)，切除后立即注射导入了基因的骨髓细胞。这种细胞移植实验按照Terai等人的报告(Terai，S.等人J.Biochem.134，551-558(2003)))中记载的方法进行。从相同Wister大鼠的股骨采集骨髓细胞，调整成1×108细胞/ml。基因导入使用携带人FGF-2基因的F基因缺失型仙台病毒载体(hFGF2-SeV/ΔFLi，HO.等，J.Virol 71，6564-6569(2000)，Masaki，I.等人，Circ.Res.90(9)，966-973(2002))。用24孔板以MOI＝10进行感染。用磁力搅拌器搅拌15分钟，进行两次30分钟温育。用PBS清洗骨髓细胞两次，加入1ml生理盐水。施行70％肝切除(肝左叶切除)后立即从外周静脉(尾静脉)注射这样制备的骨髓细胞，24小时后采集血清，测定血清肝脏酶值。
其结果是，在70％肝切除和骨髓细胞注射后24小时后的GOT/GPT/LDH值分别为未治疗组(n＝5)1186±137/662±49/3250±205BM+hFGF2-SeV/ΔF(n＝5)764±82/356±41/1266±110(均值±S.D.)。以上结果显示通过在大量肝切除时的肝组织损害的进行过程中施用由hFGF2-SeV/ΔF导入了hFGF2基因的骨髓细胞，可以修复和治疗肝功能障碍。
工业上利用的可能性根据本发明，通过使用导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞，可以进行疾病组织的修复。疾病不限于炎性疾病，无论是免疫疾病，癌性疾病，遗传疾病等，本发明的转化的骨髓相关细胞都显示出参与疾病或病理状态的组织修复的可能性。
权利要求
1.导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞，其中该细胞是与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞。
2.根据权利要求1中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述基因是标记基因，或者是具有下列功能的基因直接参与组织的维持和/或修复，或辅助所述转化的骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能。
3.根据权利要求2中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述具有直接参与组织的维持和/或修复功能的基因，或辅助所述转化的骨髓相关细胞的组织维持和/或修复功能的基因编码具有控制细胞分化或增殖的活性或具有控制细胞功能的活性的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽选自HGF、FGF、VEGF、PDGF、白细胞介素、GCSF、MCSF、SCF、IFN、Crx和Otx2。
4.根据权利要求1-3任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述载体是腺病毒载体或仙台病毒载体。
5.根据权利要求4中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述腺病毒载体是携带了HGF基因的腺病毒载体。
6.根据权利要求4中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述仙台病毒载体是携带了FGF2基因的仙台病毒载体。
7.根据权利要求4中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述仙台病毒载体是携带了IFN基因的仙台病毒载体。
8.根据权利要求1-7任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述骨髓相关细胞是骨髓细胞或骨髓来源的细胞。
9.根据权利要求1-8任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述组织是疾病组织。
10.根据权利要求9中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述疾病是肝脏疾病。
11.根据权利要求10中记载的转化的骨髓相关细胞，其降低血清肝脏酶水平。
12.根据权利要求9中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述疾病是癌症。
13.根据权利要求12中记载的转化的骨髓相关细胞，其中所述癌症是肝癌。
14.根据权利要求1-13任一项中记载的转化的骨髓相关细胞，其用于施用到外周血管。
15.转化的骨髓相关细胞的制备方法，其包括用整合了基因的载体将该基因导入到取自于哺乳动物的骨髓相关细胞中。
16.携带了基因的重组载体在制备转化的骨髓相关细胞中的用途。
17.用于组织的维持和/或修复的药物，其含有权利要求1-14任一项中记载的转化的骨髓相关细胞。
18.肝脏疾病治疗药物，其含有权利要求10中记载的转化的骨髓相关细胞。
19.根据权利要求18中记载的肝病治疗药物，其中所述肝病是肝功能障碍，肝功能不全，肝硬化或肝炎。
20.根据权利要求18中记载的肝病治疗药物，其中所述肝脏疾病是肝癌。
21.根据权利要求18或19中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述基因是HGF或FGF2。
22.根据权利要求18或20中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述基因是IFN。
23.根据权利要求18中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述载体是腺病毒载体或负链RNA病毒载体。
24.根据权利要求23中记载的肝脏疾病治疗药物，其中所述载体是缺失了F基因的负链RNA病毒载体。
25.肝脏疾病治疗药物的制备方法，其包括制备含有权利要求10中记载的转化的骨髓相关细胞和药学上可接受的介质的组合物的步骤。
26.根据权利要求25中记载的方法，其中所述肝脏疾病是肝功能障碍，肝功能不全，肝硬化或肝炎。
27.根据权利要求25中记载的方法，其中所述肝脏疾病是肝癌。
28.根据权利要求25或26中记载的方法，其中所述基因是HGF或FGF2。
29.根据权利要求25或27中记载的方法，其中所述基因是IFN。
30.根据权利要求25中记载的方法，其中所述载体是腺病毒载体或负链RNA病毒载体。
31.根据权利要求30中记载的方法，其中所述载体是缺失了F基因的负链RNA病毒载体。
全文摘要
本发明提供了与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞。进而，本发明还提供了使用转化的骨髓相关细胞对疾病组织进行诊断和治疗的方法。本发明的转化的骨髓相关细胞是导入了整合有基因的载体的转化的骨髓相关细胞，是与组织的维持和/或修复相关联的转化的骨髓相关细胞。此外，本发明的转化的骨髓相关细胞的制备方法包括用整合了基因的载体将该基因导入到取自于哺乳动物的骨髓相关细胞中。
文档编号A61K48/00GK1957084SQ200580016598
公开日2007年5月2日 申请日期2005年3月22日 优先权日2004年3月23日
发明者林众治, 井上诚, 长谷川护 申请人:株式会社载体研究所