鉴定病毒感染和疫苗接种的生物的制作方法

专利名称：鉴定病毒感染和疫苗接种的生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及参与鉴定病毒感染或疫苗接种的生物(例如，脊椎动物和哺乳动物)的方法与材料。例如，本发明涉及鉴定具有抗病毒(例如，猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒)抗体的哺乳动物(例如，猪)的方法与材料。
2.背景信息 感染某病毒的生物可引发对该感染性病毒的免疫应答。这种免疫应答包括产生能与该病毒结合的抗体。存在抗病毒的抗体可表明该生物接触过该病毒。例如，感染了PRRS病毒的猪可含有能与PRRS病毒结合的猪抗体。
PRRS是一种猪的病毒疾病，其特征在于导致母猪生殖障碍(例如，母猪晚期(late-term)流产和死胎)和仔猪呼吸困难(例如，幼猪间质性肺炎)(Collins等，J.Vet.Diagn.Invest.，4117-126，(1992)和Wensvoort等，Vet Q.，13121-130，(1991))。此病毒于1987年在北美(Keffaber，Am.Assoc.Swine Pract.Newsl.，11-9，(1989)和Hill，“神秘猪疾病的综述和历史(猪不育症与呼吸综合征)”(Overview and History of Mystery Swine Disease(Swine Infertility and Respiratorysyndrome))，刊于《神秘猪疾病委员会纪要》(Proceedings of the Mystery SwineDisease Committee Meeting)，10月6日，Denver CO，第29-30页，LivestockConservation Institute，Madison，WI，(1990))与1990年在欧洲(Paton等，VetRec.，128617，(1991))检测到。致病因子是主要在受感染猪的肺泡巨噬细胞和血液中回收到的小被膜正义链RNA病毒。它是动脉炎病毒科的成员，该病毒科包括马动脉炎病毒(EAV；den Boon等，J.Virol.，652910-2920，(1991))、致小鼠乳酸脱氢酶升高病毒(lactate dehydrogenase elevating virus)(LDV；Plagemann和Moennig，Adv.Vir.Res.，4199-192，(1992))和猿出血热病毒(SHFV；Godeny等，刊于《第九届国际病毒学大会纪要》(In Proceedings of the9th International Congress of Virology)，第22页，8月8-13日，格拉斯哥，苏格兰，(1993)和Plagemann，刊于《Fields病毒学》(Fields Virology)，第三版，第1105-1120页，B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley编，PhiladelphiaLippincott-Raven，(1996))，Order Nidovirales(Cavanagh，Arch.Virol.，142629-633，(1997))。与其它动脉炎病毒相似，PRRS病毒主要感染巨噬细胞并造成许多组织的定居巨噬细胞(resident macrophages)持久感染(Lawson等，VirusRes.，51105-113(1997)和Christopher-Hennings等，J.Vet.Diag.Invest.，7456-464，(1995))。
概述 本发明包括涉及评估生物来测定这些生物是否接触过病毒疫苗或受病毒感染的方法与材料。例如，本发明提供可用于测定某生物(例如，猪类成员，如猪)是否含有抗-PRRS病毒抗体。例如，测定猪是否含有抗-PPRS病毒的抗体可使养猪场主能鉴定可能受到PRRS病毒感染的猪。这使得场主能将怀疑受PRRS病毒感染的与确信未受感染的猪隔离。鉴定不含抗-PRRS病毒抗体的猪可使养猪场主只给先前未感染的猪群，而不是对整个畜群(可能包括许多先前曾受感染的猪)接种疫苗。
在一个实施方案中，本发明提供可用于测定接种了病毒的疫苗形式的某具体生物是受该病毒的天然产生形式感染还是对该病毒是原初状态的方法与材料。就人和农夫而言，区分接种疫苗的生物和受病毒的天然产生形式感染的生物使临床兽医能确定各生物抗该病毒免疫力的免疫学来源。例如，接收猪群的农夫可确定接种PRRS病毒疫苗的猪群是否受该病毒的天然产生形式(例如，PRRS病毒的野生分离物(field isolate))感染或对该病毒是原初状态。利用此信息，农夫可确定畜群是否无需接种疫苗，或者任何未受感染的猪是否处于受，例如受病毒的天然产生形式感染的危险中。
总体上，本发明的特征在于一种检测猪抗-PRRS病毒抗体的试剂盒。此试剂盒装有(a)一种多肽，该多肽含有选自NSP 2多肽和ORF 5多肽的PRRS病毒多肽中的氨基酸序列，其中该多肽含有猪抗-PRRS病毒抗体的表位；和(b)抗-猪Ig抗体。该多肽至少长8个氨基酸残基。该多肽可含有至少长100个氨基酸的氨基酸序列，该序列的全长与SEQ ID NO5所示核酸序列所编码的氨基酸序列至少约80％相同。该多肽可含有至少长100个氨基酸的氨基酸序列，该序列的全长与SEQ ID NO5所示核酸序列所编码的氨基酸序列至少约90％相同。该多肽可含有至少长20个氨基酸的氨基酸序列，该序列的全长与SEQ IDNO22所示序列至少约80％相同。该多肽可含有至少长20个氨基酸的氨基酸序列，该序列在整个长度上与SEQ ID NO22所示序列至少约90％相同。该多肽可含有SEQ ID NO11所示核酸序列所编码的氨基酸序列。该多肽可含有SEQ ID NO32所示的氨基酸序列。该多肽可含有SEQ ID NO16、19、22、26、29、32、39、45、61或64所示的氨基酸序列。该多肽可以是用未受PRRS病毒感染的细胞产生的重组多肽。所述抗-猪Ig抗体可以是抗-猪IgG或IgM抗体。抗-猪Ig抗体可以是山羊抗-猪Ig抗体。此试剂盒可装有包含存在于PRRS病毒NSP 2多肽中的氨基酸序列的多肽与包含存在于PRRS病毒ORF 5多肽中的氨基酸序列的多肽。此试剂盒可装有包含存在于PRRS病毒ORF 7多肽中的氨基酸序列的多肽(例如，含有SEQ ID NO36或54所示氨基酸序列的多肽)。此试剂盒可装有包含存在于PRRS病毒ORF 6多肽中的氨基酸序列的多肽(例如，含有SEQ ID NO32、48、51或67所示氨基酸序列的多肽)。抗-猪Ig抗体可包含某种酶(标记)。此试剂盒可装有包含存在于PRRS病毒NSP 1多肽中的氨基酸序列的多肽。此试剂盒可装有包含猪抗-PRRS病毒抗体的对照样品。此试剂盒可装有包含缺乏猪抗-PRRS病毒抗体的猪血清对照样品。
在另一实施方案中，本发明的特征在于测定样品是否含有猪抗-PRRS病毒抗体的方法。该方法包括(a)在某多肽能与样品中的抗体(如果存在)形成多肽猪抗-PRRS病毒抗体复合物的条件下使该多肽与样品接触，其中该多肽含有存在于选自NSP 2多肽和ORF 5多肽的PRRS病毒多肽中的氨基酸序列，其中该多肽含有猪抗-PRRS病毒抗体的表位；和(b)检测是否存在该复合物，其中存在此复合物表明该样品含有猪抗-PRRS病毒抗体。样品可以是猪血清样品。该多肽可以至少长8个氨基酸残基。该多肽可含有至少长100个氨基酸的氨基酸序列，该序列的全长与SEQ ID NO5所示核酸序列所编码的氨基酸序列至少约80％相同。该多肽可含有至少长20个氨基酸的氨基酸序列，该序列的全长与SEQ ID NO22所示至少约80％相同。该多肽可含有SEQ ID NO11所示核酸序列所编码的氨基酸序列。该多肽可含有SEQ ID NO32所示的氨基酸序列。该多肽可含有SEQ ID NO16、19、22、26、29、32、39、45、61或64所示的氨基酸序列。该多肽可以是未受PRRS病毒感染的细胞产生的重组多肽。步骤(b)可包括使该复合物与抗-猪Ig抗体接触。抗-猪Ig抗体可包含某种酶(标记)。步骤(a)可包括使样品与试剂盒中的多肽接触，其中该试剂盒装有包含存在于PRRS病毒NSP 2多肽中的氨基酸序列的多肽与包含存在于PRRS病毒ORF 5多肽中的氨基酸序列的多肽。此试剂盒可装有包含存在于PRRS病毒ORF 7多肽中的氨基酸序列的多肽(例如，含有SEQ ID NO36或54所示氨基酸序列的多肽)、包含存在于PRRS病毒ORF 6多肽中的氨基酸序列的多肽(例如，含有SEQ ID NO32、48、51或67所示氨基酸序列的多肽)和包含存在于PRRS病毒NSP 1多肽中的氨基酸序列的多肽。此试剂盒可装有包含猪抗-PRRS病毒抗体的对照样品。此试剂盒可装有包含猪血清抗-PRRS病毒抗体的对照样品。该方法可包括使样品与其它多肽接触以形成多肽猪抗-PRRS病毒抗体复合物，其中所述其它多肽含有存在于PRRS病毒ORF 7多肽、PRRS病毒ORF6多肽和PRRS病毒NSP 1多肽中的氨基酸序列。
在另一方面，本发明的特征在于测定某动物是否接受过病毒的疫苗形式或受该病毒的天然产生形式感染的试剂盒。该试剂盒装有(a)第一多肽，其所具有的氨基酸序列使得所制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体能与该第一多肽结合，所制备的抗该病毒的天然产生形式的抗体能与该第一多肽结合，和(b)第二多肽，其所具有的氨基酸序列使得所制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体能与该第二多肽结合，所制备的抗该病毒的天然产生形式的抗体不能与该第二多肽结合。所述动物可以是脊椎动物(例如，禽类或哺乳动物种类)。所述动物可以是猪或人。所述病毒可以是PRRS病毒。所述疫苗形式可以是减毒的PRRS病毒。所述疫苗形式可以是RespPRRS疫苗。所述第一多肽可含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽的C-末端部分中的氨基酸序列。所述第二多肽可含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽的N-末端一半中的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明的特征在于测定某动物对某病毒的免疫状态的方法，其中所述免疫状态是(1)该动物接种病毒的疫苗形式，(2)该动物受该病毒的天然产生形式的感染，或(3)该动物对该病毒在免疫学上原初状态。该方法包括(a)在第一多肽能与该动物第一样品中的种抗体(如果存在)形成第一多肽抗体复合物的条件下使第一样品与第一多肽接触，其中所述第一多肽含有的氨基酸序列能使所制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体与该第一多肽结合，与所制备的抗该病毒的天然产生形式抗体与该第一多肽结合；(b)在第二多肽能与该动物第二样品中的抗体(如果存在)形成第二多肽抗体复合物的条件下使第二样品与第二多肽接触，其中所述第二多肽含有的氨基酸序列能使所制备的抗该病毒疫苗的抗体与该第二多肽结合，与所制备的抗该病毒的天然产生形式的抗体不能与该第二多肽结合；和(c)检测是否存在第一多肽抗体复合物与第二多肽抗体复合物，其中存在第一多肽抗体复合物与第二多肽抗体复合物表明该动物接种过该病毒的疫苗形式，其中存在第一多肽抗体复合物并且不存在第二多肽抗体复合物表明动物受该病毒的天然产生形式感染，其中不存在第一多肽抗体复合物并且不存在第二多肽抗体复合物表明动物在免疫学对该病毒是原初状态。所述动物可以是脊椎动物(例如，禽类或哺乳动物种类)。所述动物可以是猪或人。所述病毒可以是PRRS病毒。所述疫苗形式可以是减毒的PRRS病毒。所述疫苗形式可以是RespPRRS疫苗。所述第一多肽可含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽的C-末端部分中的氨基酸序列。所述第二多肽可含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽的N-末端一半中的氨基酸序列。
本发明另一方面的特征在于一种含有PRRS病毒NSP 2多肽或PRRS病毒NSP 2多肽某片段的氨基酸序列的基本上纯的多肽，其中所述片段长20个氨基酸残基以上。
本发明另一方面的特征在于含有PRRS病毒NSP 4多肽或PRRS病毒NSP4多肽某片段的氨基酸序列的基本上纯的多肽，其中所述片段长20个氨基酸残基以上。
本发明另一方面的特征在于能表达PRRS病毒NSP 1、NSP 2或NSP 4多肽的宿主细胞(例如，细菌细胞)。
本发明另一方面的特征在于在检测猪样品PRRS病毒抗体的试验中降低背景信号的方法。该试验包括使含有PRRS病毒多肽的固体支持物与猪样品接触。该方法包括用pH值大于8.0(例如，8.5、9.0、9.5、10.0或10.5以上)的封闭液处理固体支持物。该封闭液可以是牛奶(例如，PBS配制的脱脂奶粉)、蛋白质溶液或动物血清。
本发明另一方面的特征在于含有PRRS病毒多肽的固体支持物。用pH值大于8.0(例如，8.5、9.0、9.5、10.0或10.5以上)的用封闭液处理固体支持物。此封闭液可以是牛奶(例如，PBS配制的脱脂奶粉)、蛋白质溶液或动物血清。固体支持物可以是塑料板(例如，96孔板)、载玻片、玻璃或塑料珠等。
本发明另一方面的特征在于提高连接于固体支持物的多肽与能结合该多肽抗体的反应能力的方法。该方法包括使该固体支持物与该多肽和溶菌酶接触。所述多肽可以是PRRS病毒多肽。所述多肽可以是PRRS病毒ORF 7多肽。所述多肽可以是用未受PRRS病毒感染的细胞产生的重组多肽。所述抗体可以是抗-PRRS病毒多肽抗体。溶菌酶可以是鸡蛋溶菌酶。多肽和溶菌酶可以每1ng溶菌酶至少4ng多肽的比例与固体支持物接触。溶菌酶和多肽可以每1ng多肽至少1ng溶菌酶的比例与固体支持物接触。
本发明另一方面的特征在于用PRRS病毒多肽与溶菌酶处理的固体支持物。所述多肽可以是PRRS病毒ORF 7多肽。所述多肽可以是由未受PRRS病毒感染的细胞产生的重组多肽。所述溶菌酶可以是鸡蛋溶菌酶。多肽和溶菌酶可以每1ng溶菌酶至少4ng多肽的比例与固体支持物接触。溶菌酶和多肽可以每1ng多肽至少1ng溶菌酶的比例与固体支持物接触。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所常规理解的意义相同。虽然可采用与本文所述相似或等价的方法与材料来实施或测试本发明，但下文所述是合适的方法与材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全文纳入本文作为参考。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法和实施例只是说明性而不是限制性的。
从以下详述和权利要求书中可明白本发明的其它特征和优点。 附图描述

图1是PRRS病毒基因组图。有灰色阴影的基因组区域采用PCR从VR2332病毒RNA中扩增，在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3RP)细胞中克隆并表达。
图2是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO1)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 1多肽。下划线的核酸序列(SEQ ID NO2)编码PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 1多肽。所示的氨基酸序列(SEQ ID NO3)是从起始位点到NSP 1多肽编码区起点的氨基酸序列。
图3是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO4)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 2多肽。下划线的核酸序列(SEQ ID NO5)编码NSP 2多肽。所示的氨基酸序列(SEQ ID NO6)是从起始位点到myc标记编码区的氨基酸序列。LEHHHHHH序列(SEQ ID NO13)含有his标记。
图4是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO7)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 4多肽。下划线的核酸序列(SEQ ID NO8)编码NSP 4多肽。所示的氨基酸序列(SEQ ID NO9)是myc-NSP 4-His多肽的氨基酸序列。
图5是描绘利用Agilent生物分析仪检测到的重折叠NSP 1多肽的荧光水平的图。将纯化的与重折叠的NSP 1多肽加入Agilent 2100生物分析仪(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)并根据标准方案用Protein 50 Assay LabChip试剂盒分析。NSP 1多肽分别得到对应于46 kD(完整多肽)和24和22 kD PCP 1α与PCP 1β的几个峰。
图6是描绘利用Agilent生物分析仪检测到的重折叠NSP 1多肽的荧光水平的图。将纯化的与重折叠的NSP 4多肽加入Agilent 2100生物分析仪(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)并根据标准方案利用Protein 50 Assay LabChip试剂盒分析。NSP 4多肽得到26kD的单峰。
图7描绘了抗NSP1多肽(未重折叠的)、NSP 1多肽(重折叠的)与核衣壳(ORF 7)多肽(重折叠的)的反应性抗体的平均滴度值。测定了感染PRRS病毒株MN30100并在所示时间采血的14只同龄猪的抗-NSP 1或抗-N抗体应答的时间进程。
图8描绘了抗NSP 4多肽(未重折叠的)、NSP 4多肽(折叠的)与核衣壳(ORF 7)多肽(重折叠的)的反应性抗体的平均滴度值。测定了感染PRRS病毒株MN30100的14只同龄猪的抗-NSP 4(未重折叠的)与抗-ORF 7抗体应答的时间进程，而测定了用Ingelac MLV疫苗免疫的猪的抗-NSP 4(折叠的)应答。
图9描绘了用Ingelac MLV免疫的猪中抗重折叠NSP 1和NSP 4多肽的反应性抗体的平均滴度值。
图10描绘了利用可购得的ELISA试剂盒(IDEXX 2XR试剂盒)分析样品的样品/阳性比例(S/P比例)。在0.4处与Y-轴相交的水平线显示阳性结果的截取值。
图11描绘了利用PRRS病毒ORF 5的3’多肽片段在ELISA中分析样品的S/P比例。在0.21处与Y-轴相交的水平线显示阳性结果的截取值。
图12描绘了利用GP5-M嵌合型多肽在ELISA中分析样品的S/P比例。在0.5处与Y-轴相交的水平线显示了阳性结果的截断值。
图13包括描绘样品吸光度的两幅直方图，所述样品取自与MLV或MN30100 PRRS病毒接触的动物。以ELISA用所示多肽检测吸光度值。
图14包括PRRS病毒NSP 2多肽的序列比对。利用核苷酸3490-3495处的天然XhoI限制性位点截短编码VR-2332 PRRS病毒的NSP 2多肽的核酸。
图15包括PRRS病毒ORF 5多肽的序列比对。
图16包括PRRS病毒ORF 7多肽的序列比对。
图17包括所示纯化PRRS病毒多肽的凝胶电泳照片。
图18描绘了含有所示多肽的ELISA吸光度。各组如表6所示。
图19是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO10)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 2P多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO11)编码NSP 2P多肽。第一氨基酸序列(SEQ ID NO12)是myc-NSP2P-His多肽myc标记区的氨基酸序列，而第二氨基酸序列(SEQ ID NO13)是myc-NSP 2P-His多肽的His标记区的氨基酸序列。
图20是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO14)表，所述多肽是PRRS病毒MN30100毒株的ORF 5 5’多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO15)编码ORF 5 5’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO16)是myc-ORF 55’-His多肽的氨基酸序列。
图21是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO17)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 5 5’多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO18)编码ORF 5 5’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO19)是myc-ORF 5 5’-His多肽的氨基酸序列。
图22是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO20)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 5 5’总多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO21)编码ORF 5总多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO22)是myc-ORF 5总-His多肽的氨基酸序列。接头氨基酸序列A(GGGGS；SEQ ID NO23)位于ORF5多肽5’区的第一和第二胞外域之间。
图23是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO24)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 5 3’多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO25)编码ORF 5 3’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO26)是myc-ORF 5 3’-His多肽的氨基酸序列。
图24是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO27)表，所述多肽是PRRS病毒MN30100毒株的ORF 5 3’多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO28)编码ORF 5 3’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO29)是myc-ORF 53’-His多肽的氨基酸序列。
图25是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO27)表。所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 5+6多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO31)编码ORF 5+6多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO32)是myc-ORF 5+6-His多肽的氨基酸序列。第一接头氨基酸序列(GGGGS；SEQ ID NO23)位于ORF5多肽5’区的第一和第二胞外域之间。第二接头氨基酸序列位于ORF 5多肽5’区的第二胞外域与ORF 6多肽的5’区的第一胞外域之间。第一接头氨基酸序列位于ORF 6多肽5’区的第一和第二胞外域之间。
图26是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO34)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 7多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO35)编码ORF 7多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO36)是myc-ORF 7-His多肽的氨基酸序列。
图27是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO37)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 2HP多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO38)编码NSP 2HP多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO39)是myc-NSP2HP-His多肽的氨基酸序列。
图28是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO40)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 2 S1 HP多肽。下划线的核酸序列(SEQ ID NO41)编码NSP 2 S1 HP多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO42)是myc-NSP 2 S1 HP-His多肽的氨基酸序列。
图29是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO43)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的NSP 2 S2 HP多肽。下划线的核酸序列(SEQ ID NO44)编码NSP 2 S2 HP多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO45)是myc-NSP 2 S2 HP-His多肽的氨基酸序列。
图30是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO46)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 6 5’总多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO47)编码ORF 6 5’总多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO48)是myc-ORF 6 5’总-His多肽的氨基酸序列。
图31是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO49)表，所述多肽是PRRS病毒VR-2332毒株的ORF 6 3’多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO50)编码ORF 6 3’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO51)是myc-ORF 6 3’-His多肽的氨基酸序列。
图32包括描绘样品吸光度的三幅图，所述样品取自与MN 184、SDSU 73或EuroPRRS接触的动物以及两种对照物。采用VR-2332多肽(A)、LV多肽(B)或二者的混合物(C)的ELISA检测吸光度值。
图33A包括NSP 2多肽的Kyte-Doolittle亲水性分布。图33B是NSP 2和NSP 2的片段。根据VR-2332 orf 1(GenBank登录号U87392)进行氨基酸编号。对半胱氨酸蛋白酶催化位点和疏水性结构域作了标记。
图34包括描绘样品吸光度的二幅图，所述样品取自如所示处理的动物。采用NSP 2 HP(ATP)多肽(A)或NSP 2P(VR-2332)多肽(B)的ELISA检测吸光度值。
图35包括描绘如所示稀释的阳性和阴性样品和用含有所示量多肽诸孔的吸光度评估的两幅3D图。封闭步骤期间的pH是7.4(A)或9.6(B)。
图36是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO52)表，所述多肽是PRRS病毒Lelystad病毒株的ORF 7多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO53)编码ORF 7多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO54)是myc-ORF 7-His多肽的氨基酸序列。
图37是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO55)表，所述多肽是PRRS病毒Lelystad病毒株的NSP 2P多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO56)编码NSP 2P多肽。所示氨基酸序列是从起始位点到NSP 2P多肽编码区起点的氨基酸序列(SEQ ID NO3)和从NSP 2P多肽编码区的末端到his标记的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。
图38是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO57)表，所述多肽是PRRS病毒JA 142病毒株的NSP 2P多肽。下划线的核酸序列(SEQ IDNO58)编码NSP 2P多肽。所示氨基酸序列是从起始位点到NSP 2P多肽编码区起点的氨基酸序列(SEQ ID NO3)和从NSP 2P多肽编码区的末端到his标记的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。
图39是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO59)表，所述多肽是PRRS病毒Boehringer Ingelheim Ingelvac ATP病毒株的NSP 2HP多肽。下划线的核酸序列(SEQ ID NO60)编码NSP 2HP多肽。氨基酸序列(SEQID NO61)是myc-NSP 2HP-His多肽的氨基酸序列。
图40是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO62)表，所述多肽是PRRS病毒Lelystad病毒株的ORF 5 3’多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO63)编码ORF 5 3’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO64)是myc-ORF 53’-His多肽的氨基酸序列。
图41是pET 24b myc-多肽-His构建物的核酸序列(SEQ ID NO65)表，所述多肽是PRRS病毒Lelystad病毒株的ORF 6 3’多肽。下划线的核酸序列(SEQID NO66)编码ORF 6 3’多肽。氨基酸序列(SEQ ID NO67)是myc-ORF 63’-His多肽的氨基酸序列。
图42是描绘吸光度与在100ng重折叠myc-ORF 7-His多肽中加入的鸡蛋溶菌酶量的图。这些数值是扣除阴性血清背景后的特异性抗-ORF 7多肽的平均值。各数据点是稀释度为1/300(棱形)、1/600(正方形)、1/1200(三角形)和1/2400(交叉-x)血清的数据。
图43描绘了用所示ELISA检测动物所得吸光度的变化。VR表明该多肽得自毒株VR2332。LV表明该多肽得自Lelystad病毒。剩余误差(residuals)的标准偏差是该数据与线性回归所确定方程拟合优良性的一种衡量。
图44描绘了采用含有所示多肽的ELISA检测到的接种所示PRRS病毒的样品的吸光度。 详述 本发明提供涉及评估生物以确定这些生物是否接种过(例如)病毒疫苗(例如，接种重组病毒多肽疫苗或减毒病毒疫苗)或受病毒感染而与病毒抗原接触的方法与材料。例如，本发明提供检测抗-PRRS病毒抗体的多肽、编码这种多肽的核酸、制备这种多肽的方法、表达这种多肽的宿主细胞、制备这种宿主细胞的方法、试剂盒、检测抗-PRRS病毒抗体的方法、评估某生物关于某病毒的免疫学状态的试剂盒、评估某生物的免疫学状态的方法。
多肽 在一个实施方案中，本发明提供可用于检测某生物(例如，猪)的样品中存在的抗-PRRS病毒抗体的多肽。这些抗-PRRS病毒抗体可以是任何类型的抗-PRRS病毒抗体。例如，这些抗-PRRS病毒抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。当某生物与PRRS病毒抗原，例如PRRS病毒多肽、减毒PRRS病毒疫苗或病原性PRRS病毒相接触时，在该生物中可形成这些抗体。此外，抗-PRRS病毒抗体可以是能与以下任何类型PRRS病毒相结合的抗体，包括但不限于VR-2332 PRRS病毒(GenBank登录号PRU87392；美国专利号5,846,805和5,683,865)，MN30100 PRRS病毒(Bierk等，Vet.Rec.，148687-690，(2001))，减毒的PRRS病毒，如RespPRRS病毒(GenBank登录号AF066183)、16244B PRRS病毒(GenBank登录号AF046869)、PA8 PRRS病毒(GenBank登录号AF176348)、SP PRRS病毒(GenBank登录号AF184212)、NVSL97-7985 IA 1-4-2 PRRS病毒(GenBank登录号AF325691)、P129 PRRS病毒(GenBank登录号AF494042)、CH-la PRRS病毒(GenBank登录号AY032626)、JA142 PRRS病毒(GenBank登录号AY424271)、NVSL 97-7895PRRS病毒(GenBank登录号AY545985)或PL97-1 PRRS病毒(GenBank登录号AY585241)。类似地，抗-PRRS病毒抗体可以是能与PRRS病毒的野生分离物或其天然产生形式，包括但不限于采集自北美、欧洲或其它地方(例如，中国)的PRRS病毒分离物及其天然产生形式相结合的抗体。
本文提供的多肽可用于检测怀疑感染了PRRS病毒某生物样品中存在的抗-PRRS病毒抗体。这种生物包括但不限于家养的与野生的猪和野生公猪。在一些情况中，本文提供的多肽可用于检测未怀疑感染了PRRS病毒的某生物样品中存在的抗-PRRS病毒抗体。例如，本文提供的多肽可用于检测通过(例如)注射PRRS病毒多肽、减毒的PRRS病毒疫苗或病原性PRRS病毒而与PRRS病毒抗原相接触的家兔或小鼠样品中存在的抗-PRRS病毒抗体。当在家兔或小鼠中制备抗-PRRS病毒抗体时，检测家兔或小鼠血清样品中的抗-PRRS病毒抗体有助于科学家鉴定产生抗-PRRS病毒抗体的家兔或小鼠。
可从生物获得样品，进而评估其中是否存在抗-PRRS病毒抗体。这种样品包括但不限于血液样品、血清样品、组织样品(例如，淋巴组织、肌肉组织与皮肤组织)。例如，可获得猪的血液样品，进而评估其中是否存在猪抗-PRRS病毒抗体。
本文提供的多肽可以是任何长度(例如，8-2500个氨基酸残基)。在一些实施方案中，该多肽可含有至少8个氨基酸残基。例如，该多肽可长8个以上、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000个以上氨基酸残基。在其它实施方案中，该多肽可长25到800个氨基酸残基、50到800个氨基酸残基、50到450个氨基酸残基、50到400个氨基酸残基、50到300个氨基酸残基、100到400个氨基酸残基或100到300个氨基酸残基。
这些多肽可具有任何氨基酸序列。例如，某多肽可含有存在于PRRS病毒多肽(例如，NSP 1、NSP 2、NSP 3、NSP 4、NSP 5、NSP 6、pol、C/H、HEL、CORONA、ORF 2、ORF 2b、ORF 3、ORF 4、ORF 5、ORF 6或ORF 7多肽)中的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多肽可以是缺乏疏水性区域，例如GenBank登录号PRU87392所示序列的核苷酸1339-3495所编码区域的PRRS病毒NSP 2多肽。在其它实施方案中，该多肽可以是PRRS病毒ORF 5或ORF6多肽的胞外结构域。例如，某多肽可含有PRRS病毒ORF 5多肽5’末端的第一胞外结构域(ORF 5 5’胞外结构域1)、PRRS病毒ORF 5多肽5’末端的第二胞外结构域(ORF 5 5’胞外结构域2)、PRRS病毒ORF 6多肽5’末端的第一胞外结构域(ORF 6 5’胞外结构域1)、PRRS病毒ORF 6多肽5’末端的第二胞外结构域(ORF 6 5’胞外结构域2)或它们的组合。当某多肽含有一个以上(例如，2、3、4、5、6个以上)胞外结构域时，各胞外结构域可彼此相邻或被一接头序列(例如，GGGGS氨基酸接头序列)隔开。
本文提供的多肽可含有其它包含常规使用的标记(例如，多聚组氨酸标记、myc标记、GFP标记和GST标记)的氨基酸序列。例如，PRRS病毒NSP 2多肽的50个氨基酸的片段可含有多聚组氨酸标记的氨基酸序列(例如，HHHHHH，SEQ ID NO33)。
本文提供(1)具有一定长度，和(2)在该长度上与所鉴定的氨基酸序列具有一定序列相同性百分比的氨基酸序列。类似地，本文提供的分离的核酸能编码这种多肽或可含有(1)具有一定长度，和(2)在该长度上与所鉴定的核酸序列具有一定序列相同性百分比的核酸序列。所鉴定的核酸或氨基酸序列一般是有具体的序列鉴定号或具体的GenBank登录号的序列或是具体的PRRS病毒核酸或多肽(例如，PRRS病毒NSP 2多肽)。与所鉴定的序列相比较的核酸或氨基酸序列一般称作靶序列。例如，所鉴定的序列可以是SEQ ID NO16、19或22所示的PPRS病毒ORF 5多肽序列。
按照下文确定核酸或氨基酸序列的长度和该长度上的相同性百分比。首先，利用包括BLASTN，2.0.14版和BLASTP，2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2 Sequences(B12seq)程序将某核酸或氨基酸序列与所鉴定的核酸或氨基酸序列作比较。此单机版的BLASTZ可从纽约洲立大学(State University ofNew York)-Old Westbury校区图书馆(目录号QH 447.M6714)以及Fish &Richardson的网址(fr.com/blast/)或美国政府的生物技术信息国家中心的网址(ncbi.nlm.nih.gov)获得。解释如何使用B12seq程序的说明见BLASTZ伴有的自述文件。B12seq采用BLASTN或BLASTP算法执行两条序列间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两条核酸序列，如下设置选项-i设置为含有待比较的第一条核酸序列的文件(例如，C:\seq1.txt)；-j设置为含有待比较的第二条核酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何所需的文件名(例如，C:\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；所有其它选项为其默认设置。例如，可利用以下指令产生含有两条序列之间比较(结果)的输出文件C:\B12seq-i c:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r 2。为比较两条氨基酸序列，如下设置B12seq的选项-i设置为含有待比较的第一条氨基酸序列的文件(例如，C:\seq1.txt)；-j设置为含有待比较的第二条氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何所需的文件名(例如，C:\output.txt)；所有其它选项为其默认设置。例如，可利用以下指令产生含有两条氨基酸序列间比较(结果)的输出文件C:\B12seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-oc:\output.txt。如果靶序列与所鉴定序列的任何部分有同源性，则指定的输出文件将显示比对序列的那些同源性区域。如果靶序列与所鉴定序列的任何部分不享有同源性，则指定的输出文件将不显示比对序列。
比对后，通过计算靶序列中始于任一匹配位置终于其它任一匹配位置的连续核苷酸或氨基酸残基数目来确定长度，所述核苷酸或氨基酸残基存在于与所鉴定序列的序列比对中。匹配的位置是靶序列和所鉴定序列中存在同一核苷酸或氨基酸残基的任何位置。由于靶序列中存在的空位不是核苷酸或氨基酸残基，不计算这些空位。类似地，由于计算的是靶序列核苷酸或氨基酸残基，不是所鉴定序列的核苷酸或氨基酸残基，不计算所鉴定序列中存在的空位。
通过计算某确定长度上的匹配位置数目，将该数目除以该长度后乘以100得到该长度的相同性百分比。例如，如果(1)将1000个核苷酸的靶序列与PRRS病毒NSP 2多肽序列作比较，(2)B12seq程序将该靶序列的200个核苷酸与PRRS病毒NSP 2多肽序列的某区域作比对，其中该200个核苷酸的区域的第一与最后一个核苷酸匹配，和(3)在那200个比对的核苷酸中匹配数是180，则该1000个核苷酸的靶序列具有长度200，该长度上的序列相同性百分比是90(即，180/200×100＝90)。
应该知道与某鉴定的序列作比对的一条核酸或氨基酸靶序列可具有许多不同的长度，各长度具有其自己的相同性百分比。例如，与某鉴定序列作比对的以下含20个核苷酸区域的靶序列可具有表A所示许多不同的长度。
1 20 靶序列AGGTCGTGTACTGTCAGTCA | || ||| |||| |||| | 鉴定的序列ACGTGGTGAACTGCCAGTGA 表A 应注意将相同性百分比四舍五入为最接近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14向下四舍五入为78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上四舍五入为78.2。也应注意长度数值始终为整数。
在一些实施方案中，所述多肽可含有在例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个以上氨基酸残基的长度上与SEQ ID NO9、16、19、22、26、29、32、36、39、42、45、48、51、54、61、64或67所示序列具有至少约70％(例如，至少约75、80、85、90、95或99％)相同性的氨基酸序列。
本文提供的多肽可以是基本上纯的。本文所用的术语“基本上纯的”指多肽时表示该多肽基本上不含与其天然相伴随的其它多肽、脂类、碳水化合物与核酸。例如，基本上纯的多肽是从其天然环境中取出，至少60％纯的多肽。本文所用的术语“基本上纯的”指多肽时也包括化学合成的多肽。基本上纯的多肽可以是至少约65、70、75、80、85、90、95或99％纯。基本上纯的多肽在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上通常将产生一个主要条带。
可采用任何方法获得多肽或基本上纯的多肽。例如，可采用常规的多肽纯化技术，如亲和层析和HPLC以及多肽合成技术。此外，可利用任何材料作为获得基本上纯的多肽的来源。例如，可利用工程改造的培养细胞以超量表达感兴趣的某具体多肽来获得基本上纯的多肽。这种细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞，如大肠杆菌细胞)或真核细胞(例如酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞)。可将多肽设计为含有能使该多肽被亲和基质捕获的氨基酸序列。例如，可利用标记，如c-myc、血凝素、多聚组氨酸或FlagTM标记(Kodak)来协助多肽纯化。可将这种标记插入多肽的任何地方，包括羧基或氨基末端。其它可用的融合(蛋白)包括有助于检测多肽的酶，例如碱性磷酸酶。
可将本文提供的多肽配制为含有其它成分的多肽组合物。例如，可将本文提供的多肽与其它多肽相混合从而形成含有多种不同多肽(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种以上不同的多肽)的组合物。例如，组合物可含有PRRS病毒NSP 2多肽和PRRS病毒NSP 1多肽。含有一种或多种本文提供的多肽的组合物可含有一种或多种运载体，例如溶剂、助悬剂或任何其它运载体。载体可以是液体或固体，可根据考虑的所需应用来选择运载体从而能提供所需的体积、一致性与有关的其它运输和化学性质。典型的运载体包括但不限于水；盐水；黏合剂(如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如，乳糖和其它糖，明胶或硫酸钙)；润滑剂(如，淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(如，淀粉或淀粉羟乙酸钠)；和润湿剂(如，月桂基硫酸钠)。
核酸 本文所用的术语“核酸”包括RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA与合成的(例如，化学合成的)DNA。核酸可以是双链或单链。单链核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环状或线形。
本文所用的术语“分离的”提及核酸时指与衍生此核酸的生物或病毒的天然基因组中直接毗连的两条序列(一条在5’端，一条在3’端)不直接毗连的天然核酸。例如，分离的核酸可以是(但不限于)任何长度的重组DNA分子，只要正常情况下直接侧接该重组DNA分子两端的核酸序列已被除去或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于作为独立于其它序列的分离分子存在的重组DNA(例如通过PCR技术或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)以及掺入到载体、能自身复制的质粒、病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)中或掺入原核细胞或真核细胞基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可包括是杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。
由于非天然产生的核酸并非在自然界中发现的故而在天然产生的基因组中没有直接毗邻的序列，所以本文所用的术语“分离的”指核酸时也包括任何非天然产生的核酸。例如，可认为非天然产生的核酸，如工程改造的核酸是分离的核酸。可采用常规的分子克隆或化学核酸合成技术来制备工程改造的核酸。分离的非天然产生的核酸可以是独立的其它序列，或掺入到载体、能自身复制的质粒、病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)中或原核细胞或真核细胞的基因组DNA中。此外，非天然产生的核酸可包括是杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
本领域技术人员知道存在于，例如cDNA或基因组文库，或含有基因组DNA限制性消化产物的凝胶切片内的数百到数百万种其它核酸分子中的核酸不能认为是分离的核酸。
本文所用术语“外源性”提及核酸与某具体细胞时指自然界中不来源于该具体细胞的任何核酸。因此，一旦导入细胞，可认为所有非天然产生的核酸对该细胞是外源性的。应注意非天然产生的核酸可以含有自然界中发现的核酸序列或核酸序列片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的某核酸分子是非天然产生的核酸，因此一旦导入细胞，其对该细胞是外源性的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加上载体DNA)不存在于自然界中。因此，可认为作为整体不存在于自然界中的任何载体、自身复制性质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)是非天然产生的核酸。由此可认为PCR或限制性内切酶处理得到的基因组DNA片段以及cDNA是非天然产生的核酸，因为在自然界中未发现它们以独立分子存在。也可认为在自然界中未发现的配置的启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)的任何核酸是非天然产生的核酸。
天然产生的核酸对某具体细胞可能是外源性的。例如，当将分离自人X的细胞的整条染色体导入人Y的细胞中时，该染色体对人Y的细胞而言是外源性核酸。
分离的核酸可编码本文提供的任何多肽。例如，分离的核酸可编码缺乏PRRS病毒NSP 2多肽中通常存在的疏水性区域(例如，VR-2332 PRRS病毒NSP2多肽的氨基酸残基1-722)的PRRS病毒NSP 2多肽。在一些实施方案中，该核酸编码的多肽的氨基酸序列在例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个以上氨基酸残基长度上与SEQ ID NO9、16、19、22、26、29、32、36、39、42、45、48、51、54、61、64或67所示序列至少有约70％(例如，至少约75、80、85、90、95或99％)相同。在另一些实施方案中，核酸可包含在例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个以上核苷酸长度上与SEQ ID NO2、5、8、11、15、18、21、25、28、31、35、38、41、44、47、50、53、56、58、60、63或66所示序列至少有约70％(例如，至少约75、80、85、90、95或99％)相同的核酸序列。
本文提供的分离的核酸可以至少长约5个碱基(例如，至少长约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基)，在杂交条件下可与编码本文所提供多肽(例如，PRRS病毒NSP 2P多肽或PRRS病毒ORF 5/ORF 6嵌合型多肽)的核酸的有义或反义链杂交。杂交条件可以是中等或高度严谨性杂交条件。
为本发明的目的，中等严谨性杂交条件表示在约42℃用含有25mM KPO4(pH 7.4)、5×SSC、5×Denhart溶液、50μg/mL变性的超声波处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，在约50℃用含有2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。
高严谨性杂交条件表示在约42℃用含有25mM KPO4(pH 7.4)、5×SSC、5×Denhart溶液、50μg/mL变性的超声波处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，在约65℃用含有0.2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。
可采用任何方法获得分离的核酸，包括但不限于常规的分子克隆与化学核酸合成技术。例如，可采用PCR获得含有与(例如)GenBank提供的PRRS病毒核酸序列(如，GenBank登录号PRU87392)具有相似性的分离的核酸。PCR指用类似于美国专利号4,683,195所述的方法与该方法随后的改进形式来扩增靶核酸的方法或技术。总体上，可利用感兴趣区域的两端或远处的序列信息来设计与待扩增的潜在模板两条相反链相同或相似的寡核苷酸引物。可采用PCR从RNA或DNA扩增核酸序列。例如，可采用PCR扩增细胞总RNA、基因组总DNA和cDNA以及细菌噬菌体序列、质粒序列、病毒序列等的核酸序列。当利用RNA作为模板来源时，可采用逆转录酶来合成互补的(complimentary)DNA链。
此外，可利用核酸与氨基酸数据库(例如，GenBank)获得分离的核酸。例如，与编码本文所提供多肽的核酸序列具有一定同源性的任何核酸序列可用作检索GenBank的查询(序列)。
宿主细胞 可将宿主细胞设计为含有本文所述分离的核酸。这种细胞可以是原核生物(例如，细菌细胞，如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumifaciens)、链霉菌(Streptomyces)细胞)或真核细胞(例如，真菌细胞，如酵母菌细胞，包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces)细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞；昆虫细胞；或哺乳动物细胞)。应注意含有本文所提供分离的核酸的那些细胞不需要表达多肽。此外，可将该分离的核酸整合入细胞的基因组或维持于附加体状态。因此，可用含有本文所提供的分离的核酸构建物稳定或瞬时转染宿主细胞。宿主细胞一般含有编码本文所提供多肽并表达该编码的多肽的外源性核酸分子。
可采用任何方法将分离的核酸分子引入细胞。例如，将分离的核酸分子引入细胞的常规方法有磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移。
检测抗-PRRS病毒抗体 可采用本文提供的方法与材料检测生物(例如，猪)中的抗-PRRS病毒抗体。一般可通过在PRRS病毒多肽能与抗-PRRS病毒抗体(如果存在于样品中)相结合从而形成抗体-多肽复合物的条件下使本文提供的PRRS病毒多肽与生物样品相接触来检测抗-PRRS病毒抗体。可利用，例如能与该生物的抗体相结合的标记抗体来检测这种复合物。
可利用本文提供的任何PRRS病毒多肽来检测抗-PRRS病毒抗体。此外，可联用本文提供的多种不同的PRRS病毒多肽来检测抗-PRRS病毒抗体。例如，可利用装有PRRS病毒NSP 1、NSP 2、NSP 4和ORF 7多肽的试剂盒来检测抗-PRRS病毒抗体。
一般将PRRS病毒多肽固定于固体基质上，例如浸渍片、微滴定板、颗粒(如珠)、亲和柱与免疫印迹膜。固体基质及其用法的示范性描述可参见美国专利号5,143,825；5,374,530；4,908,305和5,498,551。例如，可采用已知的方法将PRRS病毒多肽固定于固体基质上(例如96-孔板)，然后在样品中存在的抗-PRRS病毒抗体能与固定的PRRS病毒多肽相结合的条件下与猪的样品相接触从而形成抗体-多肽复合物。合适的条件包括于室温在合适的缓冲液(例如，磷酸钠缓冲液，pH 7.2-7.4)中培育约至少10分钟到约10小时(例如，约1-约2.5小时)。然后，洗去未结合的物质，检测抗体-多肽复合物。
检测到这种抗体-多肽复合物的存在表明PRRS病毒感染。可采用任何方法来检测抗体-多肽复合物。例如，可利用对该抗体-多肽复合物具有结合亲和力的指示剂分子来检测抗体-多肽复合物。本文所用的“指示分子”是可通过裸眼或合适的仪器来目测观察给定多肽、抗体或抗体-多肽复合物存在的任何分子。指示分子一般是对取得样品的生物(例如，猪)的抗体具有结合亲和力的抗体，例如抗-猪IgG抗体。可采用标准方法直接或间接检测指示分子。参见，例如《免疫学最新方法》(Current Protocols in Immunology)，第2和8章，Coligan等编，John Wiley & Sons，(1996)。为直接检测，可用放射性同位素、荧光染料、其它非放射性标记物或任何其它合适的发色团来标记指示分子。就间接检测方法而言，可将诸如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)连接于指示分子，采用HRP或AP的标准试验检测抗体-多肽复合物的存在。或者，可将指示分子连接于亲和素或链霉亲和素，利用，例如与荧光染料相偶联的生物素检测抗体-多肽复合物的存在，或反之亦然。因此，检测抗体-多肽复合物的试验形式可包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，例如竞争性ELISA，放射性免疫测定(RIA)，荧光试验，化学发光试验，免疫印迹测定(Western印迹)，微粒试验与其它已知的技术。在一些实施方案中，抗体-多肽复合物在溶液中形成。可通过免疫沉淀检测这种复合物。参见，例如《分子生物学简易方法》(Short Protocolsin Molecular Biology)，第10章，第VI部分，Ausubel等编，Green PublishingAssociates and John Wiley & Sons，(1992)。
检测抗-PRRS病毒抗体的试剂盒 可利用本文提供的PRRS病毒多肽制造检测抗-PRRS病毒抗体的试剂盒。这种试剂盒可装有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种以上不同的PRRS病毒多肽。例如，试剂盒可装有PRRS病毒NSP 1多肽、PRRS病毒NSP 2多肽、PRRS病毒NSP 4多肽、PRRS病毒ORF 5多肽、PRRS病毒ORF 6多肽、PRRS病毒ORF 7多肽或它们的任何组合。在一些实施方案中，试剂盒可装有PRRS病毒NSP 2P多肽与ORF 7多肽。
装有PRRS病毒多肽的试剂盒可装有其它组分，包括但不限于包装材料(例如，书面使用说明书)、指示分子(例如，抗-猪Ig抗体)、缓冲液、阳性对照样品(例如，含有猪抗-PRRS病毒抗体的样品)和阴性对照样品(例如，不含猪抗-PRRS病毒抗体的猪血清样品)。
评估某生物的免疫学状态 本文提供的方法与材料可用于测定某生物对某种病毒的免疫学状态。这种方法与材料可用于测定任何生物的免疫学状态。例如，可采用本文提供的方法与材料测定猪、狗、猫、鸟(例如，鸡、火鸡或鸭)、绵羊、母牛、马、山羊、猴或人的免疫学状态。此外，可测定某生物对任何病毒的免疫学状态。例如，可测定某生物对PRRS病毒、环状病毒、流感病毒、疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、冠状病毒、小RNA病毒、副流感病毒或丝状病毒的免疫学状态。
在一个实施方案中，可采用本文提供的方法与材料来测定某生物的免疫学状态是(1)该生物接种过病毒的疫苗形式，(2)该生物受该病毒的天然产生形式感染，还是(3)该生物在免疫学对该病毒是原初状态。在一些情况中，可采用本文提供的方法与材料来区分具有以下免疫学状态的生物(1)该生物接种过病毒的疫苗形式，(2)该生物受该病毒的天然产生形式感染。
总体上，可利用至少两种多肽来评估某生物的免疫学状态。第一多肽可以是具有在病毒的疫苗形式与该病毒的天然产生形式之间保守性(例如，高度保守或者，在一些情况中是完全保守)氨基酸序列的多肽。例如，第一多肽可具有能使所制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体与该第一多肽结合，所制备的抗病毒的天然产生形式的抗体与该第一多肽结合的氨基酸序列。当评估猪对PRRS病毒的免疫学状态时，第一多肽是具有PRRS病毒的疫苗形式与天然产生形式之间保守性氨基酸序列(例如PRRS ORF5多肽的C-末端区域)的多肽。可通过标准序列比对获得PRRS病毒的疫苗形式与天然产生形式之间的其它保守性氨基酸序列(图14-16)。
第二多肽可以是具有在病毒的疫苗形式与该病毒的天然产生形式之间不十分保守的氨基酸序列(例如，可变序列)的多肽。第二多肽可具有与该病毒的疫苗形式中的序列相似或相同的序列。例如，第二多肽可具有能使所制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体与该第二多肽结合，所制备的抗该病毒的天然产生形式的抗体不与该第二多肽结合的氨基酸序列。当评估猪对PRRS病毒的免疫学状态时，第二多肽可以是具有PRRS病毒的疫苗形式与天然产生形式之间不同的氨基酸序列(例如PRRS ORF 5多肽的N-末端区域)的多肽。这种第二多肽的氨基酸序列可来自VR-2332或RespPRRS PRRS病毒。可通过标准序列比对获得PRRS病毒的疫苗形式与天然产生形式之间其它不保守氨基酸序列(图14-16)。
为评估某生物对某种病毒的免疫学状态，可在第一和第二多肽能与样品中的抗病毒抗体(如果存在)结合的条件下使第一与第二多肽与该动物样品相接触以形成(1)第一多肽-抗体复合物或(2)第一多肽-抗体复合物与第二多肽-抗体复合物。形成第一多肽-抗体复合物而不形成第二多肽-抗体复合物表明该样品来自与该病毒的天然产生形式相接触过的生物。形成第一多肽-抗体复合物与第二多肽-抗体复合物表明该样品来自与该病毒的疫苗形式接触过的生物。既不形成第一多肽-抗体复合物也不形成第二多肽-抗体复合物表明该样品来自对该病毒处于原初状态的生物。
在评估猪对PRRS病毒的免疫学状态情况中，可在第一和第二多肽能与猪的血液样品中抗PRRS病毒抗体(如果存在)结合的条件下使该第一与第二多肽与样品相接触以形成(1)第一多肽-抗体复合物或(2)第一多肽-抗体复合物与第二多肽-抗体复合物。形成第一多肽-抗体复合物而不形成第二多肽-抗体复合物表明该样品来自与PRRS病毒的天然产生形式接触过的猪。形成第一多肽-抗体复合物与第二多肽-抗体复合物表明该样品来自与PRRS病毒的疫苗形式接触过的猪。既不形成第一多肽-抗体复合物也不形成第二多肽-抗体复合物表明该样品来自对PRRS病毒处于原初状态的猪。
一般将所述病毒多肽固定于固体基质上，例如浸渍片、微滴定板、颗粒(如珠)、亲和柱与免疫印迹膜。固体基质及其用法的示范性描述可参见美国专利号5,143,825；5,374,530；4,908,305和5,498,551。例如，可采用已知方法将PRRS病毒多肽(例如，具有限于保守性PRRS病毒氨基酸序列的PRRS病毒序列的一种多肽与具有限于不同PRRS病毒氨基酸序列的PRRS病毒序列的另一种多肽)固定于固体基质上(例如96-孔板)，然后在样品中存在的抗-PRRS病毒抗体能与固定的PRRS病毒多肽结合的条件下与猪样品相接触而形成多肽-抗体复合物。合适的条件包括于室温在合适的缓冲液(例如，磷酸钠缓冲液，pH 7.2-7.4)中培育至少约10分钟到约10小时(例如，约1-约2.5小时)。然后，洗去未结合的物质，如本文所述检测多肽-抗体复合物。
评估某生物的免疫学状态的试剂盒 可联用具有能使制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体与第一多肽结合，所制备的抗病毒的天然产生形式的抗体与第一多肽结合的氨基酸序列的第一多肽与第二多肽来制造评估某生物的免疫学状态的试剂盒。第二多肽可具有与存在于该病毒疫苗形式中的序列相似或相同的序列。此外，第二多肽可具有能使所制备的抗该病毒的疫苗形式的抗体与第二多肽结合，所制备的抗病毒的天然产生形式的抗体不与第二多肽结合的氨基酸序列。这种试剂盒可装有其它多肽。例如，试剂盒可装有2、3、4、5、6、7、8、9、10种以上不同的多肽，这些多肽各具有在该病毒的疫苗与天然产生形式之间保守的不同序列。类似地，试剂盒可装有2、3、4、5、6、7、8、9、10种以上不同的多肽，这些多肽各具有在该病毒的疫苗与天然产生形式之间不保守的不同病毒序列。
此试剂盒可装有其它组分，包括但不限于包装材料(例如，书面使用说明书)、指示分子(例如，抗-生物Ig抗体)、缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品。
在一些情况中，可使固体支持物与多肽和溶菌酶相接触以提高连接于固体支持物的该多肽与能和该多肽结合的抗体发生反应的能力。任何多肽可连接于固体支持物，包括但不限于本文提供的PRRS病毒多肽(例如，PRRS病毒ORF7多肽)。可利用溶菌酶。溶菌酶一般是能降解某些细菌，特别是革兰阳性细菌细胞壁的N-乙酰基胞壁酸和N-乙酰基葡糖胺之间β-1，4糖苷键的水解酶。溶菌酶可在动物分泌物与组织，包括但不限于唾液、泪水、乳汁、尿液、宫颈黏液、白细胞和肾脏中发现。例如，可在猪的子宫分泌物中发现溶菌酶(Roberts和Bazer，J.Reprod.Fertil.，82875-892，(1988))。鸡卵白溶菌酶已得到充分研究，它是第一个经解析有晶体结构的酶(Diamond，J.Mol.Biol.，82371-391，(1974))。溶菌酶广泛分布于鸟类卵白中(Prager等，J.Biol.Chem.，2497295-7297，(1974))。其它(文献)描述了溶菌酶的结构-功能关系(Imoto等，J.Vertebrate Lysozymes，The Enzymes 7，P.Boyer，Academic Press，NY，1972))。
多肽与溶菌酶可采用任何比例。例如，可将多肽与溶菌酶以每1ng溶菌酶至少4ng多肽的比例(例如，4∶1、5∶1、6∶1、7∶1以上)与固体支持物相接触。在一些情况中，可将溶菌酶与多肽以每1ng多肽至少1ng溶菌酶的比例(例如，1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1以上)与固体支持物相接触。
所述固体支持物可以是任何类型的固体支持物，包括但不限于载玻片、塑料板、96-孔板、珠等。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明范围。
实施例实施例1-制备重组PRRS病毒多肽 方法与材料 质粒克隆载体pET24b、pET25b和pETBlue2得自Novagen(Madison，WI)，pGEM-T得自Promega(Madison，WI)。大肠杆菌BL21(DE3)细胞得自Novagen。大肠杆菌BL21(DE3)菌株Tuner、RP和ABLE-K得自Stratagene(La Jolla，CA)。DH5α细胞得自Invitrogen(Carlsbad，CA)。质粒与DNA纯化试剂盒得自Qiagen(Valencia，CA)。PCR试剂得自Applied Biosystems(Roche Molecular Systems，Branchburg，NJ)。标准实验室用品、细菌生长培养基与电泳化学试剂得自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。通过逆转录酶-PCR扩增编码NSP 1α和1β、NSP2与NSP 4的VR-2332基因组RNA区域得到用于克隆的PRRS病毒cDNA片段。
DNA片段的PCR扩增、克隆，与限制性分析 利用Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Massachusetts)与PRRS病毒株VR2332序列(GenBank登录号U87392或PRU87392)(表1)设计用于PCR的引物。由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成、纯化与定量测定诸引物。PCR反应利用Applied Biosystems的热激活AmpliTaq Gold试剂盒(Roche Molecular Systems，Branchburg，NJ)。反应混合物(50μL总体积)含有10×Buffer II(1×浓度)，1.5mM MgCl2，200μM各dATP、dCTP、dGTP、dTTP；0.2μM各引物对(表1)；1.0U AmpliTaqGold和适当的cDNA。混合后，立即将溶液置于热循环仪中(GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，Shelton，CT)。热循环1轮(95℃10分钟)；35轮(94℃30秒；55℃30秒；72℃45秒)；1轮(72℃7分钟，4℃维持)。然后采用琼脂糖凝胶电泳分离得到的扩增DNA。从凝胶提取对应于预计大小的产物条带(凝胶提取试剂盒，Qiagen)，然后利用PCR纯化试剂盒进一步纯化。然后将分离的产物克隆入pGEM-T载体，转化入DH5α细胞中包被于含有IPTG和X-Gal的LB 100μg/mL氨苄西林(Amp)琼脂板上。选出并培养白色菌落。利用标准T7和SP6引物(高级遗传分析中心(Advanced Genetic Analysis Center)，明尼苏达大学(University of Minnesota)，St，Paul MN)测定选出菌落的核酸序列。经初步BLAST检索筛选(GeneBank NCBI，Bethesda，MD)后，编辑跟踪文件(trace file)以除去载体序列(Seqman，DNASTAR，Inc.，Madison，WI)并比对(Megalign，DNASTAR)。
将含有myc标记5’前导序列和末端3’His标记的Pet 24b专门化载体(Novagen，Madison，WI)工程改造为高效表达和分离多肽。此质粒(pET 24b mycHis)在紧靠myc标记3’端的含Bam HI位点与在末端6X His标记之前含Xho I位点。利用Bam HI和Xho I消化，然后用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)(Promega)脱磷酸制备用于插入的载体。PCR条件、插入片段的分离与纯化如上所述，然后进行限制性消化(BamHI，Xho I)来制备用于连接的插入(片段)。连接反应一般包括100ng脱磷酸载体、20ng插入(片段)、1×连接缓冲液与400单位T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，总体积10μL。该连接反应于16℃进行16小时，然后转化入DH5α细胞中。如上所述选出菌落并培养。测定并分析所选出菌落的核酸(得到质粒pET 24b myc-多肽-His)序列。
检测蛋白表达 为检测多肽表达，将重组质粒转化入含精氨酸和脯氨酸的真核tRNA与氯霉素(cam)抗性的BL21(DE3)-RP细胞中。将转化细胞包被在(含有)卡那霉素30μg/mL(kan 30)、氯霉素35μg/mL(cam 35)的LB板上，利用pET 24b质粒的T7和SP6引物对菌落作PCR筛选。将10个阳性菌落于30℃在2ml 2xYT培养基(kan 30，cam 35)中培养过夜。将200μL各过夜培养液接种于10份温度平衡(30℃)的10mL 2xYT(kan 30)等份培养基中。于30℃培养这些培养物至OD600为0.4，取200μL作SDS-PAGE分析，加入IPTG至终浓度1.0mM。诱导的样品在30℃生长4小时，然后取200μL作SDS-PAGE分析。
大规模多肽表达与纯化 可利用含His作标记的天然蛋白的Qiagen Ni-NTA琼脂糖亲和分离改进方法纯化多肽。简言之，4℃以4000g离心20分钟沉淀1升培养液中诱导的细菌细胞，倾弃上清液。将沉淀物重悬在30mL裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑、1μM胃蛋白酶抑制剂A、1μM亮抑肽酶和1mMPMSF，pH 8.0)中，然后加入溶菌酶至终浓度1.0mg/mL。将溶液在冰上培育60分钟，然后在冰上超声处理250W，6次10秒脉冲，间隔10秒。然后加入RNA酶A(10μg/mL终浓度)与DNA酶I(5μg/mL终浓度)，该溶液在冰上再培育15分钟进一步降解核酸。然后10,000×g离心(4℃)裂解物30分钟沉淀不溶性凝聚物和细胞碎片。沉淀物含有包涵体形式的大多数表达重组多肽，分离变性形式(的多肽)然后重折叠。离心后立即将沉淀物重悬在30mL含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl和尿素，pH 8.0的溶液中。室温离心(200rpm)重悬的沉淀物30分钟后置于4℃等待随后的处理。
将含有不同水平可溶性多肽的上清液倾析入6mL 50％Ni-NTA浆液中，在4℃轻柔搅拌(200rpm)1小时。然后将上清液-Ni-NTA混合物倾倒入1.5×30cm柱上，通过重力流出。用20mL含有50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑、1μM胃蛋白酶抑制剂A、1μM亮抑肽酶和1mM PMSF，pH 8.0的溶液洗涤该柱两次。用四份3mL含有50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑、1μM胃蛋白酶抑制剂A、1μM亮抑肽酶和1mM PMSF，pH 8.0的洗脱缓冲液洗脱多肽。利用切向流过滤盒(Pellicon XL Ultracel PLC 5 kD，Millipore，Bedford MA)或YM-3 Amicon Centriprep离心过滤装置(MilliporeCorp.Bedford，MA)浓缩纯化的多肽，然后用50％甘油和20mM Tris HCl，pH7.5透析(Spectra/Por MWCO6-8,000，Spectrum Laboratories，RanchoDominguez，CA)。利用Bio-Rad RC DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)测定多肽的浓度。将纯化的多肽溶液保藏于-20℃。
4℃以10,000×g离心保藏于4℃的变性不溶性重组多肽混合物30分钟以沉淀细胞碎片。上清液含有高水平的上述不溶性变性重组多肽，将其倾析入6mL 50％Ni-NTA浆液中，在4℃轻柔搅拌(200rpm)1小时。然后将上清液-Ni-NTA混合物倾倒入1.5×30cm柱上，通过重力流出。用20mL含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl和8M尿素，pH 6.3的溶液洗涤该柱两次。然后用3mL含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl和8M尿素，pH 5.9的等份洗脱缓冲液洗脱多肽4次。如上所述进行SDS凝胶分析、多肽浓缩、PBS透析并浓度测定。
多肽重折叠 利用其它文献所述方法的变化形式(Buchner等，Anal.Biochem.，205263-270，(1992)与Clark，Curr.Opin.Biotechnol.，9157-163，(1998))进行变性重组多肽的重折叠。简言之，合并含有纯化多肽的变性多肽溶液，在4℃用500mL 0.1M Tris，pH 8.0，6M胍-HCl和2mM EDTA透析4小时(Spectra/PorMWCO6-8,000，Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA)。然后用新鲜的缓冲液再透析4小时。将多肽浓度调整为3mg/ml(用Bio-Rad RC DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)测定浓度)后，加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度300mM DTT。室温搅拌得到的5mL溶液搅拌2小时，然后用0.45μm滤膜(注射器滤膜，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)过滤。然后在4℃将还原的多肽溶液快速加入(适当搅动)500mL重折叠缓冲液(100mM Tris HCl，pH8.0，0.5ML-精氨酸，8mM氧化的谷胱甘肽，2mM EDTA，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM亮抑肽酶和1mM PMSF)中，相当于最终约1∶100稀释。然后用0.22μm膜(Steritop，Millipore，Bedford MA)过滤得到的溶液以除去颗粒物，搅拌过夜。利用切向流过滤盒(Pellicon XL Ultracel PLC 5kD，Millipore，Bedford MA)将纯化的多肽浓缩至10mL体积，然后用50％甘油和20mM TrisHCl，pH 7.5透析(Spectra/Por MWCO6-8,000，Spectrum Laboratories，RanchoDominguez，CA)。利用Bio-Rad RC DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)测定多肽的浓度。纯化的多肽溶液保藏于-20℃。
凝胶电泳与免疫印迹 利用Laemmli缓冲液系统(Laemmli，Nature，227680-684，(1974))在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析细菌裂解液、各纯化组分和纯化的多肽。用0.025％考马斯蓝染色来目测观察蛋白质条带。为进行免疫印迹，将凝胶(条带)电印迹到支撑的硝酸纤维素膜上(MSI Separations，Westbrook MA)。在室温用抗-myc单克隆抗体9E10培育膜1小时。利用碱性磷酸酶偶联的山羊-抗小鼠IgG检测抗体的结合，用ECL Western印迹系统(Amersham Pharmaciea Biotech，Piscataway，NJ)目测观察。
ELISA 用100μL碳酸缓冲液(15mM Na2CO3和35mM NaHCO3)，pH9.6配制的各PRRS病毒多肽或只用缓冲液包被ELISA板过夜，用PBS-吐温(0.1％吐温-20)洗涤6次。室温加入200μL含有2.5％脱脂奶的PBS-吐温以封闭未结合的位点，洗涤板5次。在室温加入各种稀释度的100μL猪血清(一式两份)，(静置)2小时，用PBS-吐温洗涤板4次。各孔以1∶5000稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊-抗猪IgG(重链+轻链)(KPL，Gaithersburg MD)培育1小时来测定特异性抗体水平。洗涤各孔5次，用100μL TMB底物(KPL)显色。15分钟后加入100μL 1M磷酸终止反应，在450nm对板读数。
pETBlue2(Novagen) 将pGEM-T克隆转化入DH5α细胞中。菌落生长过夜，用Qiagen Miniprep纯化试剂盒分离质粒。分别用Nco I和Not I消化纯化的质粒和2μg pETBlue24小时。在消化的后20分钟用CIAP使pETBlue2脱磷酸。用Qiagen凝胶纯化试剂盒凝胶纯化插入片段与线形pETBlue2，然后将载体与插入(片段)以约1∶2比例连接。
将连接(产物)转化入DH5α细胞中。每板两个菌落培养过夜，在培养物上进行质粒制备以分离质粒。然后将纯化的质粒转化入BL-21(DE3)RP细胞中。培养每克隆两个菌落，30℃用400μM IPTG诱导4小时。随后作全细胞裂解物的SDS-PAGE凝胶电泳显示无特异性多肽诱导证据。类似地，在包被的微滴定板上使诱导的细胞裂解物与PRRS+和PRRS-猪血清反应作ELISA测试未显示有PRRS病毒多肽的证据。此时结束对PRRS病毒多肽表达的pETBlue2评估。
pET24d/pET25b(Novagen) 用Nco I和Not I消化2μg pET24d，用CIAP脱磷酸。然后用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化片段。利用琼脂糖凝胶电泳进一步纯化该片段，用QIAquick凝胶提取试剂盒从凝胶中提取载体片段。然后将pET24d片段以插入(片段)与载体约1∶2的比例与该克隆片段连接。将这些质粒转化入DH5α细胞中未导致菌落生长。克隆入未脱磷酸的pET24d载体或克隆入脱磷酸或未脱磷酸的pET25d后也得到类似结果。
克隆 采用PCR扩增通过其活性位点鉴定的三种PRRS病毒蛋白酶(基因)，它们位于PRRS病毒株VR2332的ORF 1a的以下氨基酸位置木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶α和β(PCP α/β)(氨基酸74-146与268-339)、稀有的半胱氨酸蛋白酶(氨基酸435-506)和脊髓灰质炎病毒3C-样丝氨酸蛋白酶(氨基酸1840-1946)。图1显示了PRRS病毒基因组中这些功能性蛋白酶结构域的位置。表1列出了PCR扩增的PRRS病毒株VR2332的核苷酸序列区域并总结了所有结果。
表1.克隆的PRRS病毒NSP片段 非结构蛋白1(NSP 1) 转化大肠杆菌DH5α细胞后，此片段与pET24b的连接产物产生了多个菌落。这些菌落生长缓慢，一般需要在37℃生长48小时才可见。通过PCR筛选的菌落得到与存在克隆片段相一致的阳性结果。从生长在培养肉汤中的大肠杆菌回收重组质粒的尝试不成功。看来重组质粒不稳定。为克服此问题，利用以下各大肠杆菌菌株作为质粒受体DH5α、JM109、HB101、SURE(Stratagene)和ABLE(Stratagene)。37℃、30℃与22℃培养转化板与肉汤培养物。培养物体积是1、2、5、10和25mL。尝试了质粒纯化的各种方法，包括Qiagen miniprep、采用苯酚/氯仿提取的标准碱性裂解法与用氯化锂/异丙醇沉淀的煮沸裂解法。这些条件和处理均未能回收到重组质粒。通过菌落PCR筛选到总共353个转化子，约70次反应得到了条带。质粒纯化得到的不可见条带或高分子量条带经诊断性限制性消化后从凝胶上消失。此结果与基因组DNA的情况一致。
非结构蛋白2(NSP 2) 得到与NSP 1相同的结果。在LB琼脂板上得到PCR阳性转化菌落，但分离质粒DNA的尝试不成功。
非结构蛋白4(NSP4) 除了有一个例外，NSP 4的结果与NSP 1和NSP 2的相同。成功地从一个克隆中回收到质粒DNA，DNA测序表明其含有预计的NSP 4。注意到有一个点突变导致氨基酸16从异亮氨酸变为苏氨酸。
将NSP片段克隆入pET24bmycHis PCR扩增对应于NSP 1、NSP 2和NSP 4的DNA片段，并将其克隆入pET24b-mycHis中(图2、3和4)。通过各菌落的小规模试验诱导鉴定功能阳性克隆，选出一个高表达克隆，使之生长、纯化并测序。各克隆的5’端含有EcoR1和BamHI位点，3’端含有XhoI位点。所编码的多肽含有氨基末端myc标记与羧基末端6×His标记。
重组NSP的表达与纯化 如本文所述培养各菌落并诱导多肽表达。用Ni-NTA固定的金属亲和层析纯化多肽。在所述条件下，重组NSP 1和NSP 4在摇瓶中不难以mg/L水平表达，亲和层析与重折叠后约可回收50％多肽(表2)。纯化与重折叠的多肽是均质的，含有与预计的蛋白酶活性相一致的片段大小。NSP 1和NSP 4多肽由均质多肽构成，其中NSP 1制品含有完整的多肽与自我蛋白水解切割为PCP1α和PCP1β的两个片段，而NSP 4制品是单一条带(图5和6)。
表2.多肽表达产量 NSP 2表达水平低，在全细胞裂解物中用考马斯蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶上不可见，但可用抗-myc抗体作western印迹来观察。存在多条大小小于132kD的所编码多肽序列的条带表明在细菌生长与多肽表达期间或在细胞裂解与样品处理期间发生了蛋白水解降解。ELISA检测结果获得的Western印迹条带含有PRRS病毒NSP 2的进一步证据，所述ELISA检测中用表达NSP 1、NSP 2或NSP 4的克隆经诱导的细菌裂解液包被微滴定板诸孔。含有NSP 2多肽的各孔以特异性与稀释度依赖方式强烈反应。NSP 2多肽的表达水平低可能是因为该多肽羧基末端存在疏水性区域。
重折叠对ELISA反应性的作用 在初步ELISA检测中观察到这三种NSP多肽的抗体反应性有明显差异，可能是该纯化的重组多肽构象发生改变而可能影响其免疫反应性。取决于表达、纯化和重折叠的条件，重组核衣壳(N)的免疫反应性不同。因此，评估了重折叠前后NSP 1和NSP 4的免疫反应性。
重折叠对NSP 1的免疫反应性有影响(图7)。未重折叠的亲和纯化的NSP 1多肽对PRRS病毒感染120天后的猪的血清基本上无反应性。
相反，抗-NSP 4抗体对未重折叠的或重折叠的NSP 4多肽的(反应)滴度基本上无差异(图8)。由于两种形式的NSP 4没有明显差异，重折叠多肽反应性的分析在第52天结束。选择用于分析的血清样品再一次强调了重折叠没有影响。预计在用同源病毒(VR2332是Ingelvac MLV疫苗的亲代病毒株)免疫的动物中将产生最大的抗体应答，用假定的重折叠天然多肽检测到这种应答。预计在用异源毒株(MN30100)感染的动物中将产生最低应答，用未重折叠的多肽检测到这种应答。在这些条件下未观察到差异。
这些结果证明多肽重折叠影响NSP 1的免疫反应性而对NSP 4不明显。然而，常规重折叠各重组NSP多肽并以可溶形式保存在甘油中以维持产品均匀。
诱导对NSP重组多肽的抗体应答及持续时间 在4个月大的小母猪中抗-NSP 1抗体应答的动力学与抗N应答相似。感染后第14天的抗-NSP 1滴度约为1/50,000，感染后第21天达到约1/140,000的峰值。感染后28-120天抗体水平快速下降，与N(ORF 7)相当。在用IngelvacMLV免疫的一小组幼猪中(4-6周龄)，抗NSP 1的抗体滴度显示相似的尖峰(sharp peak)并快速下降，但在感染后第28天而不是第21天出现高峰(图9)。
在小母猪中，与抗N与抗NSP 1抗体应答相比，抗NSP 4抗体应答微弱。有证据表明感染后40-55天滴度升高，在感染后100-110天可能再次升高。在幼猪中，免疫后约28-35天抗-NSP 4滴度开始有相似的滞后与中等升高(图9)。此时间范围对应于可分辨的急性感染期。
猪抗-NSP抗体对VR2332 NSP重组多肽的交叉反应性 纯化并重折叠PRRS病毒VR2332毒株在细菌中表达的NSP 1和NSP 4多肽，二者与接触过PRRS病毒同源毒株(Ingelvac MLV)和异源毒株(MN30100)的猪抗血清的反应相当。
实施例2-制备其它重组PRRS病毒多肽 制备了以下多肽PRRS病毒NSP 2P多肽(图19)、PRRS病毒第一N-末端胞外结构域ORF 5多肽(ORF 5 5’；图20和21)、PRRS病毒第一和第二N-末端胞外结构域ORF 5多肽(ORF 5’总肽；图22)、PRRS病毒胞外结构域ORF5多肽(ORF 5 3’；图23和24)、联合了PRRS病毒第一和第二N-末端胞外结构域ORF 5多肽与PRRS病毒第一和第二N-末端胞外结构域ORF 6多肽的嵌合型多肽(ORF 5+6；图25)与PRRS病毒ORF 7多肽。编码这些多肽的核酸是PRRS病毒的VR-2332毒株(GenBank登录号PRU87392)或MN30100毒株的核苷酸序列。
PCR扩增与克隆 用于克隆的片段得自如其它文献(Nelsen等，J.Virol.，73270-280，(1999))所述制备的质粒。利用合适的克隆位点通过PCR分离所需片段。采用Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Massachusetts)设计引物。寡核苷酸引物得自IDT(Coralville，IA)。利用AmpliTaq Gold试剂盒(RocheMolecular Systems，Branchburg，NJ)在不同反应中通过PCR扩增编码ORF 7、ORF 5 5’和ORF 5 3’多肽的核酸。通过cDNA的PCR与随后的寡聚物退火、PCR扩增和连接构建了编码ORF 5 5’总肽和ORF 5+6多肽的核酸。反应混合物(50μL总体积)含有10×Buffer II(1×浓度)；1.5mM MgCl2；200μM各dATP、dCTP、dGTP和dTTP；0.2μM各引物对；1.0U AmpliTaq Gold与衍生自cDNA的适当连续稀释(1∶10...1∶10,000)的mRNA。混合后，立即将溶液置于热循环仪中(GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，Shelton，CT)。热循环1轮(95℃10分钟)；35轮(94℃30秒；55℃30秒；72℃45秒)；1轮(72℃7分钟，4℃维持)。然后在琼脂糖凝胶上分离得到扩增的DNA。凝胶提取对应于预计大小产物的条带(凝胶提取试剂盒，Qiagen，Valencia，CA)，然后利用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进一步纯化。然后将分离的产物克隆入pGEMT载体(Promega，Madison，WI)，转化入DH5α细胞中(Invitrogen Corp.，Carlsbad，California)，涂布在含有IPTG和X-Gal的LB 100mg/mL氨苄西林(Amp)琼脂板上。通过颜色选出并培养菌落，核酸测序(高级遗传分析中心(Advanced Genetic Analysis Center)，明尼苏达大学(University ofMinnesota)，St，Paul MN)。进行初步BLAST检索筛选(GeneBank NCBI，Bethesda，MD)后，编辑跟踪文件除去载体序列(SeqmanDNASTAR，Inc.，Madison，WI)并比对重叠的序列(MegalignDNASTAR，Inc.，Madison，WI)。用XhoI消化克隆pET 24b myc-NSP 2-His(图3)再与载体连接获得编码NSP 2P多肽的核酸。
亚克隆入表达质粒 利用合适的pGEMT构建物作为含有BamHI和XhoI末端位点的引物的模板来扩增这些克隆。PCR条件与插入(片段)分离和纯化是标准方法，然后限制性消化(BamHI、XhoI)制备用于连接的插入(片段)。连接条件是100ng脱磷酸载体、20ng插入(片段)、1×连接缓冲液与400U T4连接酶(NewEngland Biolabs)，总体积10μL。连接反应(混合物)在16℃进行16小时，然后转化入DH5α细胞(Invitrogen Corp.，Carlsbad，California)中。如上所述选出菌落并培养，测序并分析所选出的核酸(得到质粒pET 24b myc-多肽-His)。
也可从含有该病毒的细胞培养上清液制备编码类似于ORF 5 5’和ORF 53’的多肽的MN30100 PRRS病毒序列的核酸构建物(Bierk等，Vet.Rec.，148687-690，(2001))。采用标准方法从培养物中获得病毒RNA。利用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen)分离病毒RNA并保存于-80℃。利用GeneAmp RNAPCR试剂盒(Applied Biosystems，Roche Molecular Systems，Branchburg，NJ)和随机六聚物将纯化的RNA转变为cDNA。简言之，将1μL 50μM的随机六聚物溶液与3.0μg总RNA混合，总体积为4μL。溶液加热至68℃，10分钟，然后在冰上快速冷却。加入16μL主混合物溶液至含有10×Buffer II(最终为1×浓度)；5mM MgCl2；1.0mM各dATP、dCTP、dGTP和dTTP；20U/μLRNA酶抑制剂与25U/μL逆转录酶的终浓度。此溶液立即在25℃培育10分钟；42℃30分钟；99℃5分钟；然后是4℃5分钟。将得到的cDNA保存在-20℃，用于PCR扩增。
蛋白质表达 将质粒pET 24b myc-多肽-His转化入含有精氨酸和脯氨酸的真核tRNA与氯霉素(cam)抗性的BL21TM(DE3)-RP细胞(Stratagene，River Creek，TX)中。将转化细胞包被在(含有)卡那霉素30μg/mL(kan 30)、氯霉素35μg/mL(cam35)的LB板上，利用pET 24b质粒的T7、T7末端引物通过菌落PCR筛选。将10个阳性菌落30℃在2ml 2xYT培养基(kan 30，cam 35)中培养过夜。将200μL各种过夜培养液接种于10份温度平衡(30℃)的10mL 2xYT(kan 30)等份培养基中。这些培养物于30℃生长至ODλ＝600为0.3；取200μL用于SDS-PAGE分析；加入IPTG至终浓度为1.0mM。诱导的样品在30℃生长4小时，然后取200μL用于SDS-PAGE分析。SDS-PAGE凝胶(电泳)表明所有菌落以高水平(＞2mg/升培养液)表达预计大小的多肽。以相同方式将总共1升培养液按比例放大100倍进行大规模表达。
多肽纯化 可利用变性的His作标记蛋白(Qiagen，Valencia，CA)的改良QiagenNi-NTA琼脂糖亲和分离方法纯化多肽。简言之，4℃以4000g沉淀1升含有诱导质粒的培养液20分钟，倾弃上清液。离心后立即将沉淀物重悬在30mL含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、8M尿素，pH 8.0的溶液中。然后4℃以10,000×g离心得到的混悬液30分钟沉淀细胞碎片。上清液含有高水平的变性多肽，将其倾入6mL 50％Ni-NTA浆液中，4℃轻柔搅拌1小时。然后将上清液-Ni-NTA混合物倾倒入1.5cm ID×30cm长的柱上，使之流出。用20mL含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、8M尿素，pH 6.3的溶液洗涤该柱两次。然后用3mL含有100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、8M尿素，pH5.9的等份洗脱缓冲液洗脱多肽4次。如上所述进行SDS凝胶分析与蛋白质浓度测定(图17)。
多肽重折叠 利用其它文献所述方法的变化形式(Buchner等，Anal.Biochem.，205263-270，(1992)与Clark，Curr.Opin.Biotechnol.，9157-163，(1998))进行变性重组多肽的重折叠。首先，合并含有纯多肽的变性多肽溶液，4℃用500mL0.1M Tris，pH 8.0，6M胍-HCl和2mM EDTA透析4小时(Spectra/Por MWCO6-8,000，Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA)。然后用新鲜的缓冲液再透析4小时。将多肽浓度调整为3mg/ml(用Bio-Rad RC DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)测定浓度)后，加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度300mM DTT。此溶液(5mL)在室温搅拌2小时，然后用0.45μm滤膜(注射器滤膜，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)过滤。4℃将还原的多肽溶液快速加入(适当搅动)到500mL重折叠缓冲液(100mM Tris HCl，pH 8.0，0.5M L-精氨酸，8mM氧化的谷胱甘肽，2mM EDTA，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM亮抑肽酶和1mM PMSF)中，相当于最终作了1∶100稀释。然后用0.22μm膜(Steritop，Millipore，Bedford MA)过滤得到的溶液除去颗粒物，搅拌过夜。利用切向流过滤盒(Pellicon XL Ultracel PLC 5kd，Millipore，Bedford MA)将纯化的多肽浓缩至10mL体积，然后用20mM Tris HCl，pH 8.0透析(Spectra/Por MWCO6-8,000，Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA)。利用Bio-Rad RC DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)、定量SDS凝胶与Agilent 2100生物分析仪(Protein LabChip试剂盒，Agilent Technologies，Palo Alto，加利福尼亚)测定多肽的浓度。将纯化的多肽溶液保藏于-80℃。由于重折叠不影响ELISA反应性，多肽ORF 5 5’、ORF 5 3’与ORF 5总肽不作常规重折叠。
ELISA 用100μL碳酸缓冲液(15mM Na2CO3和35mM NaHCO3，pH 9.6)将多肽稀释至浓度1μg/mL。然后用100μL合适的多肽碳酸溶液包被ELISA板(COSTAR 3590，96孔EIA/RIA板，Corning Inc.，Corning，NY)各孔(每孔100ng多肽)，4℃培育过夜。各样品以一式两份进行。留下一组孔不包被用于测定血清与第二抗体对背景的作用(发现吸光度单位小于0.005)。然后室温用PBS-吐温20(0.1％)洗涤各板6次(EL-404 Microplate Washer，Bio-Tek Instruments Inc.Winooski，VT)。室温用含有3％脱脂奶(NFDM)的300μL/孔PBS-吐温(0.1％)封闭非特异性结合位点2小时。然后如上述洗涤各板。用含3％NFDM的PBS-吐温(0.1％)按1∶2000稀释血清样品，然后在相应的孔中加入100μL，各板在室温平衡2小时。利用所示连续稀释液的滴度值，1∶2000血清稀释液显示了相似的数据倾向(在误差内)。然后如所述洗涤各孔。用含有3％NFDM的PBS-吐温(0.1％)按1∶5000稀释第二检测抗体(过氧化物酶标记的山羊抗-猪IgG(H+L)，Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.(KPL)Gaithersburg，MD)，将100μL稀释抗体溶液加入各孔。室温培育1小时后，再次洗涤各板。利用四甲基联苯胺(TMB目录号50-76-00 Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.(KPL)Gaithersburg，MD)进行比色分析。混合等体积的TMB过氧化物酶(溶液A)与过氧化物酶(溶液B)，将100μL加入各孔。溶液在室温显色15分钟(蓝色)。然后加入100μL 1M磷酸猝灭反应(黄色)。在450nm对板读数(Thermo Max微板读数计，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。
实施例3-同源野生型病毒反复攻击后的PRRS病毒抗体应答 血清学是兽医疾病监测与控制的基石。血清中存在特异性抗体表明以前接触过疾病，也证实该动物拥有保护性免疫力。目前可用的PRRS病毒ELISA抗体检测发现可能对受感染的动物，特别是反复感染的动物的所有可能情况不敏感。许多动物在初次感染后4-6个月内恢复为血清反应阴性状态(Yoon等，J.Vet.Diagn.Invest.，7305-312，(1995))。此外，有报道说用修饰的活PRRS病毒疫苗多次反复接种期间动物恢复和维持ELISA抗体阴性(Baker等，Proc.Allen D.Leman Swine Conference，第26卷(增刊)，第31页，(1999))。如果反复频繁接触同一野生型PRRS病毒后发生ELISA抗体应答丧失，兽医在监测畜群的连续病毒周期时可能会以另一种方式向客户解释PRRS病毒ELISA检测的结果。
进行了以下试验来(1)测定用野生型病毒多次低剂量免疫能否诱导PRRS病毒ELISA血清阴性的动物(产生抗体)，与(2)特征鉴定PRRS病毒血清的中和抗体与抗各重组ORF多肽的抗体的表达时间。
大约6/60型方案，给68只PRRS病毒阴性的6月龄公猪(barrow)注射每剂量102.5野生毒株SD 28983 PRRS病毒两次，间隔一个月，然后每隔一个月一次，总共免疫6次。每次免疫后3个星期对动物采血，测试样品的PRRS病毒ELISA与血清中和抗体。最后一次免疫4个月后(首次接触的12个月后)，用SD 28983再次攻击动物。
通过荧光聚焦中和检测血样的血清中和抗体(毒株23983病毒作为试验接种物)，并检测如本文所述获得的重组PRRS病毒多肽的抗体。简言之，通过将所需的cDNA核酸片段插入大肠杆菌中表达产生PRRS病毒rORF多肽。所产生的多肽包括核衣壳(ORF 7多肽)与含有ORF 5被膜多肽与ORF 6基质多肽(二者共定位于病毒被膜内)的胞外结构域的嵌合型多肽片段。用各多肽包被ELISA板，采用有限稀释法测试血清样品。以结果记录为抗体滴度而不是光密度比值。也可用购得的PRRS病毒ELISA(2XR PRRS病毒抗体检测试剂盒；IDEXXLaboratories)检测血样。
初次的血清(抗体)转阳后，PRRS病毒2XR ELISA抗体水平急剧降低，即使用PRRS病毒毒性28983毒株反复注射。一开始，几乎所有动物均产生了实质性的阳性抗体应答。然而，用活病毒第6次注射4个月后，75％的这些动物恢复血清-阴性。这与用MLV PRRS病毒疫苗多次接种母猪后所观察到的相似(Baker等，Proc.Allen D.Leman Swine Conference，第26卷(增刊)，第31页，(1999))。相反，血清中和测试检测到首次注射后产生了抗体，在该实验结束时所有动物维持血清中和抗体阳性。
rORF ELISA显示了暂时性抗体曲线。利用重组核衣壳多肽的试验得到密切类似于IDEXX 2XR ELISA应答曲线的曲线，在第4个月降至低水平。相反，被膜嵌合型ORF 5和ORF 6多肽ELISA曲线的暂时模式几乎与PRRS血清中和抗体应答曲线相同。因此，看来这些猪起初产生了主要针对抗核衣壳多肽的强烈抗体应答，但随时间推移该抗体应答重新针对被膜多肽。看来抗PRRS病毒的免疫应答缓慢转换为免疫保护性血清中和抗体。
这些结果证明有效的诊断试剂盒可装有ORF 5多肽与ORF 6多肽。由于IDEXX PRRS病毒ELISA试剂盒显示只限于检测能与PRRS病毒核衣壳多肽相结合的抗体，这些结果也证明疫苗接种或反复接触后的弱IDEXX PRRS病毒ELISA抗体应答可能自相矛盾地表明该动物具有抗该疫苗或病毒的保护性免疫应答。
实施例4-抗PRRS病毒的毒性和减毒毒株的抗体应答比较 进行了以下实验来(1)特征鉴定猪对各PRRS病毒多肽的抗体应答，(2)测定对毒力不同的病毒分离物的抗体应答，和(3)测定对攻击的抗体应答与保护力之间的相关性。
将100只PRRS-阴性的3-4周龄幼猪分组。每组10只猪鼻内接种特征为高度或中等毒性(SDSU73、MN 184、JA 142和17198-6)、低毒性(VR2332和ABST-1)或无毒性(Ingelvac PRRS和Ingelvac ATP)的2×103TCID50PRRS病毒株。10只猪的一组接种含等量的所有病毒的混合物，10只对照猪不接种病毒。动物完全从急性感染中恢复后，用MN 184攻击。记录整个实验期间的临床症状，攻击14天后进行尸检。动物每周采血，采用ELISA测定通过将所需cDNA片段插入用于表达和纯化的大肠杆菌中而产生的纯化的非结构与结构多肽的抗体水平。这些多肽包括VR2332 PRRS病毒ORF 7多肽(核衣壳多肽)、VR2332 PRRS病毒NSP 1多肽、VR2332 PRRS病毒NSP 2P多肽、VR2332 PRRS病毒NSP 4多肽、VR2332 ORF 5 5’胞外结构域1多肽、MN30100VR2332 ORF 5 5’胞外结构域1多肽、VR2332 ORF 5 3’胞外结构域多肽、MN30100 ORF 5 3’胞外结构域多肽、VR2332 ORF 5 5’胞外结构域1和2多肽与VR2332 ORF 5/ORF 6嵌合型多肽(ORF 5 5’胞外结构域1和2加上ORF 6 5’胞外结构域1和2；也称为GP5-M嵌合型胞外结构域多肽)。用各多肽包被ELISA板，血清样品以1/2000稀释度检测。以背景校正的光密度值表示特异性抗体水平。
在给予无毒性或低毒性毒株的动物中观察到抗PRRS病毒接种的临床应答为无或最低程度作用到约50％给予MN 184的动物死亡。接种了高度和中等毒性毒株的动物的抗体应答明显。抗体一般在感染后第21天首次出现，第28天达到峰值。第28天后抗核衣壳抗体水平急剧降低，而对其它病毒多肽的抗体应答倾向于维持在高水平直至实验结束。抗非结构多肽NSP 1和NSP 2的抗体应答与抗核衣壳的应答一样高或更高，但抗编码病毒蛋白酶的NSP 4的应答总是低。
虽然在所有治疗组中抗所给予病毒的体液应答是IDEXX阳性，但显然抗体应答的强度有明显差异。与中等或高毒性毒株相比，无毒与低毒毒株引发的实质性抗体应答较低。在测试的所有抗原中均存在这些差异。然而，所有治疗组中对攻击的应答相似。
总之，观察到对不同的结构与非结构PRRS病毒多肽的抗体应答有差异。此外，与减毒病毒相比，对PRRS病毒毒性毒株的抗体应答观察到有差异。然而，抗体应答的差异与对用异源高毒性攻击毒株反复感染的保护力无关。这些发现首次就整个急性感染与随后的毒性攻击期间对各PRRS病毒多肽的抗体应答作了特征鉴定。
实施例5-采用各PRRS病毒多肽与购得的ELISA试剂盒检测抗PRRS病毒抗体 进行以下实验测定具体的多肽ELISA能否检测多次接触和长期接触条件下的PRRS病毒阳性样品，此期间IDEXX ELISA从阳性转变为阴性。先给PRRS-阴性的6月龄公猪注射PRRS病毒野生毒株SD 28983的102.5组织培养物感染剂量(TCID50)，然后在第一、第二、第四、第六和第八个月(注射)，总共接种6次。每次接种前对动物采血，收集血清。利用(1)购得的PRRS病毒ELISA(2XR PRRS病毒抗体检测试剂盒；IDEXX Laboratories)，或(2)含有具体PRRS病毒多肽的ELISA来检测血样。按照生产商的指导对作1/40稀释的血清样品进行IDEXX 2XR HerdChekELISA。数据表示为各组所有样品的平均值和标准偏差。组的大小为每组23只猪19-23个样品不等。
发现利用IDEXX试剂盒分析的约一半动物在第353天时间点时为阴性(表3和图10)。S/P比值高于0.4表明该样品是PRRS病毒抗体阳性，而S/P比值低于0.4表明该样品是PRRS病毒抗体阴性。
表3.利用IDEXX试剂盒分析样品 在ELISA中利用重组GP5胞内结构域(endodomain)多肽或重组GP5-M嵌合型多肽分析了相同的样品。简言之，以每孔100ng多肽(pH 9.6的碳酸液配制)包被各板过夜。血清作1/1000稀释，一式两份测试。就GP5胞内结构域多肽ELISA而言，数据表示为各组所有样品的未调整OD值的样品/阳性比值与平均值大于(阳性)或小于0.21(阴性)的样品数量。就GP5-M嵌合型多肽ELISA而言，数据表示为各组所有样品的未调整OD值的样品/阳性比值与平均值大于(阳性)或小于0.5(阴性)的样品数量。样品/阳性比值测定为(样品OD减去不含抗原的对照孔OD)/(阳性对照OD减去不含抗原的对照孔OD)。
在353天时间点发现两份样品为所测试的PRRS病毒GP5胞内结构域多肽抗体阴性(表4和图11)。当利用GP5-M嵌合型多肽时，在353天时间点发现所有测试样品均是阳性(表5和图12)。这些结果证明利用GP5多肽的试验可检测到用购得的IDEXX试剂盒不能检测到的抗-PRRS病毒抗体。
表4.在ELISA中利用GP5胞内结构域多肽分析样品 表5.在ELISA中利用GP5-M嵌合型多肽分析样品 实施例6-用PRRS病毒多肽混合物与购得的ELISA试剂盒检测抗PRRS病毒抗体 每组10只断奶的猪各鼻内接种2mL含有3.0 Log10 TCID50/mL表6所列病毒分离物的组织培养液。合并物是该8种分离物各等份的混合物。
表6.PRRS病毒分离物 *减毒的PRRS病毒分离物 **含有所有8种分离物的混合物 为比较IDEXX ELISA试剂盒与重组多肽ELISA，用盲法选择接种后第7天每组5只猪的血清。在第14天也检测5份样品中的4份。就IDEXX ELISA试剂盒而言，S/P比值≥0.4表明该样品是阳性，而S/P比值＜0.4表明该样品是阴性。利用IDEXX ELISA试剂盒与重组多肽ELISA分析相同的样品。
就重组多肽ELISA而言，如本文所述表达与纯化了以下多肽ORF 7多肽、ORF 5+6嵌合型胞内结构域多肽、NSP 2P多肽与ORF 53’胞内结构域多肽。用OD280吸光度、Agilent生物分析仪分析、SDS PAGE与RC DC Lowry蛋白质测定纯化的多肽浓度相同。用150ng各多肽(总共600ng)(100μL碳酸包被缓冲液(pH 9.6)配制)包被微滴定板。将血清样品作1/500稀释进行ELISA。用IDEXX ELISA分析的第7天和第14天样品是同一样品。此外，在第50天分析了每组7只动物(MN 184和合并组中的5只)。对照动物所有时间均是阴性。第10组中的7只猪在所有测试日均为阴性。
当用IDEXX试剂盒分析时，第7天收集的测试样品中只有1份阳性(表7)。此外，第14天收集的13份样品是PRRS病毒抗体阴性。第14天收集的36份样品中的23份是PRRS病毒抗体阳性。
表7.利用IDEXX ELISA试剂盒的结果 与之相比，当利用含有PRRS病毒多肽的混合物的ELISA分析时，第7天收集的45份测试样品中的14份是阳性(表8)。此外，第14天收集的36份样品中只有8份是PRRS病毒抗体阴性。第14天收集的36份样品中的28份是PRRS病毒抗体阳性。此外，第50天收集的59份样品中的54份是PRRS病毒抗体阳性(表8)。
表8.利用含有PRRS病毒多肽的混合物的ELISA结果 这些结果证明PRRS病毒多肽的混合物可用于检测接触PRRS病毒动物各时间点的PRRS病毒抗体，不仅是接触PRRS的早期也是晚期各时间点。例如，接触PRRS病毒后第7、14和50天检测到阳性样品。
也采用如本文所述获得的各PRRS病毒多肽进行ELISA检测了各组样品(图18)。
实施例7-区分接触PRRS病毒疫苗或野生毒株的动物 用Ingelvac MLV(也称为RespPRRS；GenBank登录号AF066183)疫苗接种28天后，从5只猪取得血清样品，作1/300稀释，在包被了200ng以下多肽的ELISA板上进行一式两份分析PRRS病毒株VR2332的5’胞外结构域ORF 5多肽、PRRS病毒分离物MN30100的5’胞外结构域ORF 5多肽、PRRS病毒株VR2332的3’胞内结构域ORF 5多肽或PRRS病毒分离物MN30100的3’胞内结构域ORF 5多肽。用PRRS病毒分离物MN30100接种28天后，从5只猪取得血清样品，以同样方式分析。PRRS病毒ORF 5多肽的5’胞外结构域含有各PRRS病毒分离物中不同的氨基酸序列，而PRRS病毒ORF 5多肽的3’胞内结构域含有各PRRS病毒分离物中保守的氨基酸序列。
含有3’胞内结构域ORF 5多肽(VR2332的3’胞内结构域ORF 5多肽或MN30100的3’胞内结构域ORF 5多肽)的ELISA检测接触过PRRS病毒疫苗毒株(Ingelvac MLV)或野生分离物(MN30100)的动物样品中的PRRS病毒抗体(表19和图13)。这些结果证明局限于PRRS病毒中保守性PRRS病毒序列的多肽可用于检测接触过类型PRRS病毒(例如，PRRS病毒疫苗或野生型)的动物，而无论该序列是来自PRRS病毒的疫苗形式还是野生型形式。
表9.取自接触过PRRS病毒Ingelvac MLV或MN30100的猪的血清样品与PRRS病毒Ingelvac MLV或MN30100的多肽片段反应的ELISA结果 *数据是扣除背景后的特异性OD值 含有VR2332的5’胞外结构域ORF 5多肽的ELISA检测到取自接触过疫苗毒株(Ingelvac MLV)的动物样品中有PRRS病毒抗体，而在取自接触过PRRS病毒的野生分离物(MN30100)的动物样品中未检测到PRRS病毒抗体(表9和图13)。类似地，含有MN30100的5’胞外结构域ORF 5多肽的ELISA检测到取自接触过PRRS病毒的野生分离物(MN30100)的动物样品中有PRRS病毒抗体，而在取自接触过疫苗毒株(Ingelvac MLV)的动物样品中未检测到PRRS病毒抗体(表9)。这些结果证明与接触过PRRS病毒野生型的动物相反，局限于PRRS病毒疫苗形式的PRRS病毒序列的多肽只可用于鉴定接触过该PRRS病毒的疫苗形式的动物，所述序列在PRRS病毒中不同。
实施例8-制备疫苗毒株与野生分离物的其它重组PRRS病毒多肽 制备了以下多肽PRRS病毒ORF 7多肽(图26)、PRRS病毒NSP 2HP多肽(图27)、PRRS病毒NSP 2 S1 HP多肽(图28)、PRRS病毒NSP 2 S2 HP多肽(图29)、PRRS病毒第一和第二N-末端胞外结构域ORF 6多肽(ORF 6 5’总肽；图30)和PRRS病毒胞内结构域ORF 6多肽(ORF 6 3’；图31)。在各种情况中，这些多肽依次含有myc序列、PRRS病毒序列与聚组氨酸序列。编码这些多肽的PRRS病毒序列的核酸是PRRS病毒VR-2332毒株(GenBank登录号PRU87392)的核苷酸序列。此外，制备了myc-ORF 7-His多肽、myc-ORF 53’-His多肽、myc-ORF 63’-His多肽与myc-NSP 2-His多肽。编码这些多肽的PRRS病毒序列的核酸是PRRS病毒Lelystad病毒(LV)毒株(GenBank登录号M96292)的核苷酸序列。也制备了myc-NSP 2HP-His多肽。编码这些多肽的PRRS病毒序列的核酸是Boehringer Ingelheim疫苗毒株ATP的核苷酸序列。因为PRRS病毒株JA142是Boehringer Ingelheim疫苗毒株ATP的亲代病毒株，可利用PRRS病毒株JA142(GenBank登录号AY424271)得到此ATP序列。
如实施例2所述构建含有VR-2332的PRRS序列的多肽。就含有PRRS病毒株LV或ATP序列的质粒而言，通过蔗糖垫(cushion)离心从细胞培养裂解物中分离病毒。利用Qiagen试剂盒提取病毒RNA。引物可设计为能扩增所需序列，含有必需的限制性位点。用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化(clean up)PCR产物，连接入pGEM-T载体。在大肠杆菌中扩增、纯化质粒，用BamHI和Xho1消化。纯化插入片段，克隆入pET 24b myc His载体。
BL21(DE3)-RP细胞中的质粒表达了重组多肽。转化后，将细胞包被在含有卡那霉素(30μg/mL)与氯霉素(35μg/mL)的LB琼脂板上，37℃培育过夜。选出单菌落，在含有上述卡那霉素与氯霉素的20mL 2xYT培养基中以225rpm振荡培养过夜。将20mL培养液转移至1升含有抗生素的2xYT培养基中，30℃振荡(培养)直至OD600达到0.3。加入IPTG至1mM，30℃搅拌摇瓶4-5小时。取200μL培养液用于凝胶分析。
4℃以4000×g离心剩余的培养液20分钟得到细菌沉淀物。将沉淀物重悬在30mL 100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl、8M尿素，pH 8.0中。加入PMSF至1mM，室温轻柔摇动混合物2小时。4℃以10,000×g离心混合物30分钟沉淀细胞碎片。向含有变性蛋白质的上清液中加入6mL 50％的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Valencia CA)浆液，室温轻柔摇动1小时。然后将混合物置于1.5cmID×40cm的玻璃柱中，使之流出。用20mL 100mM NaH2PO4、10mM TrisHCl、8M尿素，pH 6.3洗涤该柱两次。用3-4份4-mL的100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl、8M尿素，pH 5.5-5.7洗脱重组蛋白质。蛋白质保存于-20℃直至重折叠。
向合并的蛋白质溶液中加入231.3mg二硫苏糖醇并轻柔搅拌2小时使蛋白质重折叠。然后将溶液快速稀释到500mL重折叠缓冲液中(100mM TrisHCl，pH 8.0，0.5M L-精氨酸，8mM氧化谷胱甘肽，2mM EDTA，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM亮抑肽酶和1mM PMSF)，4℃轻柔搅拌过夜。利用切流过滤(Pellicon XL Ultracel PLC 5kD，Millipore，Bedford MA)再次浓缩蛋白质，4℃用10mM磷酸钠，pH 8.0透析(Spectra/Por MWCO 3,000，SpectrumLaboratories，Rancho Dominguez，CA)过夜。如果需要，将溶液4℃以3,800离心30分钟浓缩(Centriprep，Millipore)。将蛋白质分成等份保存在-80℃。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估蛋白质浓度与纯度。
实施例9-利用一种或两种基因型的PRRS病毒多肽混合物检测抗北美和欧洲基因型PRRS病毒抗体 进行以下实验来确定(1)利用北美型PRRS病毒(例如VR-2332)多肽作ELISA是否能检测接种了欧洲型PRRS病毒(例如，Lelystad病毒)的猪的PRRS病毒阳性样品，和(2)利用欧洲型PRRS病毒(例如，Lelystad病毒)多肽作ELISA能否检测接种了北美型PRRS病毒(例如VR-2332)的猪的PRRS病毒阳性样品。也进行了以下实验来确定利用北美和欧洲型病毒多肽的混合物作ELISA能否检测感染了二类型病毒之一的猪的PRRS病毒阳性样品。
利用以15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.6配制的以下多肽来包被ELISA板(COSTAR 3590，96孔EIA/RIA板，Corning NY)myc-ORF 7-His(VR-2332)、myc-ORF 6 3’-His(VR-2332)、myc-ORF 5 3’-His(VR-2332)、myc-ORF 7-His(LV)、myc-ORF 6 3’-His(LV)和myc-ORF 5 3’-His(LV)。含有全部或部分ORF 7(N)、ORF 6(M)或ORF 5(GP5)的各质粒表达这些多肽。用各含100ng三种VR-2332多肽/100μL、各100ng三种LV多肽/100μL或各50ng六种多肽/100μL的溶液包被这些孔。因此，所有的孔含有300ng多肽。
板与包被溶液在4℃培育过夜。用PBS、0.05％吐温20，pH 7.3-7.5洗涤板孔一次，用300μL PBS、0.05％吐温20配制的5％脱脂奶，pH 9.4-9.6封闭各孔二小时。用PBS、0.05％吐温20，pH 7.3-7.5洗涤各板5次，向一式两份的孔中加入100μL用PBS、0.05％吐温20、5％脱脂奶作1/500稀释的测试血清，(培育)1小时。板洗涤5次，加入100μL用PBS、0.05％吐温20、5％脱脂奶作1/5000稀释，过氧化物酶标记的亲和纯化抗猪IgG(H+L)抗体(KPL，Gaithersburg MD)，(培育)1小时。板洗涤5次，加入酶底物，(培育)5分钟。酶底物由混合在一起的100μL每孔等份TMB过氧化物酶底物溶液A与过氧化物酶H2O2底物溶液B(TMB过氧化物酶底物系统，KPL，Gaithersburg MD)构成。用100μL 2M磷酸终止反应，用Thermo Max微板读数计(Molecular Devices，Sunnyvale CA)读取450nm结果。
血清样品取自未受感染(阴性血清A与阴性血清B)，受欧洲型PRRS病毒(n＝9)与两种北美PRRS病毒株之一，MN 184或DSU 73(Johnson等，Vet.Immunol.Immunopathol.，102233-247，(2004))(n各为1)感染的猪。在感染后约第0、7、14、21、28、35和49天取样。用VR-2332多肽的混合物可在感染后第14天及其后所有时间点在接触MN184或SDSU 37的猪血清中检测到抗-PRRS病毒抗体(图32；A图)。VR-2332多肽不能检测到受欧洲PRRS病毒感染的猪血清中的抗-PRRS病毒抗体。
用LV多肽混合物可在感染后第7天及其后所有时间点在接触欧洲基因型PRRS病毒的猪血清中检测到高水平抗体(图32；B图)。LV多肽也可在第14天及其后在接触北美PRRS病毒的猪中检测到抗体(图32；B图)。类似于单用LV多肽，用LV与VR-2332多肽的混合物可在接触(病毒)的猪血清中检测到抗-PRRS病毒抗体，除了接触MN184的动物(的抗体检测)值可能较高外(图32；C图)。
这些结果证明用LV多肽，例如ORF 5 3’、ORF 6 3’和ORF 7多肽混合物可在感染后第7天早期检测接触欧洲与北美基因型PRRS病毒的猪的抗体应答。VR-2332多肽能特异性识别接触北美型PRRS病毒的猪血清，不能识别接触欧洲型病毒的猪血清。因此，利用这些多肽的合适混合物可检测对所有PRRS病毒的血清学应答，可区分针对欧洲与北美类型的应答。
实施例10-利用非结构蛋白质多肽来区分接触PRRS病毒疫苗或野生毒株的动物 实施例4证明猪抗PRRS病毒抗体应答是对非结构蛋白强于对结构蛋白(例如N)的。由于检测NSP可能需要更灵敏的试验，进行了以下实验来确定用以下多肽作ELISA能否区分接种Ingelvac MLV或Ingelvac ATP毒株的猪与接触PRRS病毒野生毒株的猪所述多肽衍生自PRRS病毒的VR-2332或IngelvacATP疫苗毒株的非结构蛋白。制备含有NSP 2部分的各种多肽(图33)。
在第一个实验中，将接触野生病毒或Ingelvac MLV疫苗病毒28天的猪血清样品与包被了myc-NSP 2P-His(VR-2332)或myc-NSP 2HP-His(VR-2332)多肽的微滴定板培育。接种衍生自VR-2332毒株的MLV疫苗的猪血清与myc-NSP 2P-His和myc-NSP 2HP-His多肽强烈反应。7只猪1/1000稀释的血清样品抗NSP 2P阳性信号为0.8-3.6OD单位，抗NSP 2HP阳性信号为0.7-3.1。扣除背景后的相对差异百分比(1-(ODNSP 2HP/ODNSP 2P))是9.9-23.2％。与此相比，接种了5种不同野生型病毒之一的猪血清与myc-NSP 2P-His多肽的反应比与myc-NSP 2HP-His多肽的更强烈。接触5种不同病毒的35只猪抗NSP 2P阳性信号为0.54-3.3OD单位，抗NSP 2HP阳性信号为0.22-1.9OD单位。相对差异百分比为36.6-85.1％。
这些结果表明NSP 2HP(VR-2332)多肽不同于PRRS病毒其它NSP 2P多肽，因而从其获得的疫苗病毒MLV能在猪中引发与NSP 2HP(VR-2332)多肽选择性反应的抗体。此外，接触野生病毒的猪血清样品与NSP 2P(VR-2332)反应明显表明此多肽能用作诊断多肽。NSP 2HP对MLV疫苗的相对特异性表明比较测试血清与VR-2332 NSP 2P和NSP 2HP的相对血清学反应性的检测可区分接种过Ingelvac MLV疫苗的猪与接触野生病毒的猪。
在第二个实验中，评估了GenBank的PRRS病毒序列中显示氨基酸序列不同的NSP 2多肽(VR-2332)的其它部分与接触过上述实验的Ingelvac MLV疫苗和野生病毒的猪血清的特异反应性。用myc-NSP 2P-His(VR-2332)多肽或myc-NSP 2 S1 HP-His(VR-2332)或myc-NSP 2 S2 HP-His(VR-2332)多肽包被ELISA板。
如上述实验一样，所有接种疫苗与接触野生病毒的1/1000稀释(n＝42)的猪血清与NSP 2P反应的OD值高。然而，这些血清与NSP 2 S1 HP和NSP 2 S2 HP反应弱。90％以上样品的OD值低于0.1。这些结果表明约30-40个氨基酸的多肽可能不具有足够的免疫反应性来区分对病毒感染的不同血清学反应性，即使此类多肽中氨基酸序列的变异性高。
在第三个实验中，如实施例9所述用myc-NSP 2HP-His(ATP)或myc-NSP2P-His(VR-2332)多肽包被微滴定板。如实施例4所述用接触疫苗与野生病毒的猪血清样品进行ELISA测定。除了血清样品作1/1000稀释与3分钟后终止显色反应外，均如实施例9所述进行此测定。如本文所示，接触野生病毒或MLV疫苗的猪血清样品与NSP 2P(VR-2332)呈阳性反应(图34)。接触Abst-1或疫苗毒株ATP的猪血清样品无阳性反应，因为所用的剂量只引发了低的或可忽略的免疫应答。NSP 2HP(ATP)多肽与接触过JA142(此疫苗的亲代病毒)的猪血清强烈反应，也与接触过野生病毒SDSU73与17198-6的猪血清强烈反应。这些结果证明利用不同PRRS病毒株，例如Ingelvac ATP和VR-2332的非结构多肽，例如NSP 2HP与NSP 2P未得到对接触过某特定毒株或分离物的猪特异的血清学测试结果。NSP 2HP(ATP)多肽可能不是唯一不同于其它PRRS病毒NSP 2HP多肽，而NSP 2HP(VR-2332)是。 实施例11-提高封闭步骤中的pH可降低背景信号 ELISA测试中的高度非特异性背景是猪血清学中常见的问题，特别是利用低稀释度与老年动物(例如6个月以上)的血清时。用pH 7.4或9.6封闭ELISA板后测定阳性与阴性猪血清的特异性与非特异性反应水平。用0-300ng/孔的等量N、ORF 5、ORF 6胞外结构域与ORF 5胞内结构域多肽(均来自VR-2332)包被各孔。加入1/40-1/4000稀释的阳性或阴性血清。阳性血清样品得自接触VR-2332三周后的7周龄猪。阴性血清样品得自6月龄猪。用PBS，0.05％吐温20，pH 7.4或9.6配制的5％脱脂奶封闭。
PRRS病毒阳性血清在pH 7.4时观察到血清浓度依赖性显色，但PRRS病毒阴性血清孔有非特异性显色，甚至高于用中等与低水平抗原包被板的特异性反应(图35)。pH值为9.6封闭时，非特异性反应几乎完全消失。特异性反应降低约50％，但总的信噪比大幅增加(图35)。
这些结果表明在ELISA板中加入中性pH施加于的封闭液(例如，蛋白质溶液)不能完全中和蛋白质结合能力，从而导致猪免疫球蛋白的非特异性结合与高OD值。低稀释度血清增加了试验灵敏度但加剧了此问题。将封闭液的pH提高至7.4以上(例如，9以上)可以降低或消除各种抗原包被用量与血清稀释度的非特异性反应。
实施例12-制备重组PRRS病毒多肽 采用类似于实施例2所述的方法与材料制备以下多肽PRRS病毒(Lelystad毒株)ORF 7多肽(图36)、PRRS病毒(Lelystad毒株)NSP 2P多肽(Figure 37)、PRRS病毒(JA 142毒株)NSP 2P多肽(图38)、PRRS病毒(ATP毒株)NSP 2HP多肽(图39)、PRRS病毒(Lelystad毒株)胞内结构域ORF 5多肽(ORF 53’；图40)和PRRS病毒(Lelystad毒株)胞内结构域ORF 6(ORF63’；图41)多肽。
实施例13-在包被缓冲液中加入溶菌酶可提高对核衣壳的反应性 在用重组多肽包被的各孔中加入溶菌酶作为对照物。简言之，只用100ng多肽(例如，重折叠的myc-ORF 7-His多肽)或用100μL碳酸缓冲液配制的各种用量的鸡蛋溶菌酶(Sigma)包被ELISA孔。用PRRS病毒株VR2332感染21天后两只猪的血清样品或两只未感染的对照猪血清进行ELISA。
当在有不同浓度的溶菌酶存在或不存在时用各种重组多肽，包括myc-ORF 5-3’-His多肽和非重折叠myc-ORF 7-His多肽包被各板时未观察到颜色反应的强度有差异。类似地，未观察到只针对溶菌酶的反应。然而，重折叠的myc-ORF 7-His多肽反应性在有溶菌酶存在时显著升高。此外，升高程度与溶菌酶的加入量成比例(图42)。在包被步骤中加入溶菌酶(约200ng溶菌酶/孔)使PRRS病毒免疫血清的特异性反应以剂量依赖性方式升高至最大(图42)。
在所检测的所有血清稀释度中均观察到此作用，稀释度较低的血清观察到这种作用较高。以1/300稀释的血清在并没有溶菌酶存在时的平均特异性吸光度约为0.42，但在有164ng以上溶菌酶存在时为高于1.0。每孔用各种包被用量(包括20-500ng)的重折叠myc-ORF 7-His多肽作试验也观察到这种提高作用。每孔约100ng溶菌酶在包括以下的各种条件下提高了(检测)结果，例如测试血清稀释度为1∶40-1∶5000，测试血清与抗原的培育时间为45-90分钟，第二抗体偶联物的稀释度为1∶500-1∶5000，显色反应时间为2-20分钟。由于ORF 7多肽是PRRS病毒的主要抗原并广泛用于血清学试验中，发现利用溶菌酶能提高针对ORF 7多肽的特异性抗-PRRS血清学反应性。因为能提高阳性与阴性结果之间的差异，提高抗-ORF 7多肽抗体检测灵敏度的条件可提高早期感染或接触PRRS病毒诊断试验的灵敏度，增加接触或血清转变后的检测持续时间，能提供更加可靠的检测基础。
实施例14-提高重组病毒蛋白质ELISA的稳定性 与IDEXX 2XR ELISA作比较来评估商业养猪操作中重组多肽能否检测怀孕母猪以前接触过PRRS病毒。获得地方性感染畜群中32只怀孕母猪间隔35天的血清，通过IDEXX 2XR ELISA与ELISA检测其中对三种重组PRRS病毒多肽(ORF 7、ORF 5-3’和ORF 6-3’，均是毒株VR2332的)混合物，毒株VR2332的一种PRRS多肽(ORF 5+6胞外结构域嵌合多肽，NSP 1与NSP2P)或Lelystad病毒株的一种PRRS病毒多肽(NSP 2P；图37)起反应的抗-PRRS病毒抗体。简言之，将1/500稀释的血清样品在包被了以下多肽的ELISA板上按一式两份进行试验50ng ORF 5+6嵌合多肽，100ng ORF 7、ORF 5-3’和ORF 6-3’(各为33ng)的混合物，100ng NSP 1或100ng NSP 2P。也用IDEXX 2XR ELISA分析了血清样品。计算各ELISA测定的所有32只猪的平均吸光度值差异(第35天-第0天)，从正数到负数排序。计算各组数据组的假定线性回归方程与回归系数。将所有32只动物对各重组多肽制品的所得值从最高值到最低值排序(图43)。
得到了各种情况的从正(间隔35天的值高于间隔0天的值)到负(间隔35天的值低于0天的值)的排序值。动物抗体水平正与负的最大差异(残差的标准偏差＝0.55)发生在IDEXX 2XR ELISA测试中(图43)。在假定的回归分析中重组多肽ELISA显示更一致的结果，表明直线的斜率更接近0，并能降低最高与最低应答中的差异(图43)。如线性回归方程的斜率更接近0与各种情况中残差的标准偏差更小所表明的那样，这些结果的平均值比IDEXX 2XRELISA更一致。用Lelystad病毒的NSP 2P获得了最一致的结果。
35天期间的试验结果差异大可解释为动物丧失了免疫力而显示反应性大跌，而对反应性大增的情况可解释为易感动物发生新感染。该结果可能提高对各动物与商业猪群PRRS病毒状态的假阳性与假阴性解释。重组多肽ELISA测定显示动物应答差异较低，这与动物接触过PRRS病毒，而使动物中存在免疫应答与35天期间动物的抗体状态变化小相一致。这些结果表明重组多肽ELISA可更一致地评估接触过PRRS病毒的畜群，降低假阳性和假阴性解释的可能性。
实施例15-利用两种基因型之一的各PRRS病毒多肽检测抗北美与欧洲基因型PRRS病毒抗体 可利用实施例9所述的血清样品以及重组PRRS病毒ORF 7(来自Lelystad病毒，欧洲基因型；图36)多肽与NSP 2P(来自VR2332，北美基因型；或Lelystad病毒，图37)多肽检测各PRRS病毒多肽的反应特异性。接种过欧洲基因型PRRS病毒与北美基因型病毒MN184的猪血清样品与Lelystad病毒ORF 7多肽强烈反应，而接种过北美基因型毒株SDSU73、VR2332和Ingelvac MLV的反应弱(图44)。这些结果表明可利用Lelystad病毒的ORF 7多肽来区分抗北美PRRS病毒以及欧洲PRRS病毒株的亚组的血清学应答。接种过欧洲基因型PRRS病毒的猪血清样品只与LV NSP 2P多肽反应，根本不与VR2332 NSP 2P多肽反应(图44，B和C图)。VR2332 NSP 2P多肽与接触过VR2332的猪的血清反应强烈且为阳性，但与接触过IngelvacMLV和SDSU73的猪血清反应弱一些。似乎完全不与接触过MN184的猪血清反应。这些发现表明可用各PRRS病毒多肽来检测接触过PRRS病毒亚组的猪的血清学应答。其它实施方案 应该理解虽然结合本发明详述对其进行了描述，但以上描述是为说明而不是限制附加的权利要求书所定义的本发明范围。其它方面、优点与改进均应包括在以下权利要求书中。
权利要求
1.一种检测猪抗-PRRS病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒装有
(a)包含存在于选自NSP 2多肽和ORF 5多肽的PRRS病毒多肽中的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽含有所述猪抗-PRRS病毒抗体的表位；和
(b)抗-猪Ig抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽的长度至少为8个氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽含有至少长100个氨基酸的氨基酸序列，所述序列在所述长度上与SEQ ID NO5所示核酸序列所编码的氨基酸序列至少约80％相同。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽含有至少长100个氨基酸的氨基酸序列，所述序列在所述长度上与SEQ ID NO5所示核酸序列所编码的氨基酸序列至少约90％相同。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽含有至少长20个氨基酸的氨基酸序列，所述序列在所述长度上与SEQ ID NO22所示序列至少约80％相同。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽含有至少长20个氨基酸的氨基酸序列，所述序列在所述长度上与SEQ ID NO22所示序列至少约90％相同。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO11所示核酸序列编码的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO16、19、22、26、29、32、39、45、61或64所示氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽是用未受PRRS病毒感染的细胞制备的重组多肽。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-猪Ig抗体是抗-猪IgG或IgM抗体。
11.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-猪Ig抗体是山羊抗-猪Ig抗体。
12.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有包含存在于PRRS病毒NSP 2多肽中的氨基酸序列的多肽与包含存在于PRRS病毒ORF5多肽中的氨基酸序列的多肽。
13.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有包含存在于PRRS病毒ORF 7多肽中的氨基酸序列的多肽。
14.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有包含存在于PRRS病毒ORF 6多肽中的氨基酸序列的多肽。
15.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗-猪Ig抗体含有酶。
16.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有包含存在于PRRS病毒NSP 1多肽中的氨基酸序列的多肽。
17.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有包含猪抗-PRRS病毒抗体的对照样品。
18.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有含有缺乏猪抗-PRRS病毒抗体的猪血清对照样品。
19.一种测定样品是否含有猪抗-PRRS病毒抗体的方法，其中所述方法包括
(a)在所述多肽能与所述样品中如果存在的抗体形成多肽猪抗-PRRS病毒抗体复合物的条件下使所述多肽与样品接触，其中所述多肽含有存在于选自NSP 2多肽和ORF 5多肽的PRRS病毒多肽中的氨基酸序列，其中所述多肽含有所述猪抗-PRRS病毒抗体的表位；和
(b)检测是否存在所述复合物，其中存在所述复合物表明所述样品含有所述猪抗-PRRS病毒抗体。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述样品是猪血清样品。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽的长度至少为8个氨基酸。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽含有至少长100个氨基酸的氨基酸序列，所述序列在所述长度上与SEQ ID NO5所示核酸序列所编码的氨基酸序列至少约80％相同。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽含有至少长20个氨基酸的氨基酸序列，所述序列在所述长度上与SEQ ID NO22所示序列至少约80％相同。
24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO11所示核酸序列编码的氨基酸序列。
25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO16、19、22、26、29、32、39、45、61或64所示氨基酸序列。
26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽是用未受PRRS病毒感染的细胞制备的重组多肽。
27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)包括使所述复合物与抗-猪Ig抗体接触。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述抗-猪Ig抗体含有酶。
29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)包括使所述样品与试剂盒中的多肽接触，其中所述试剂盒装有包含存在于PRRS病毒NSP 2多肽中的氨基酸序列的多肽与包含存在于PRRS病毒ORF 5多肽中的氨基酸序列的多肽。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述试剂盒装有包含存在于PRRS病毒ORF 7多肽中的氨基酸序列的多肽、包含存在于PRRS病毒ORF6多肽中的氨基酸序列的多肽与包含存在于PRRS病毒NSP 1多肽中的氨基酸序列的多肽。
31.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法包括使所述样品与其它多肽接触形成多肽猪抗-PRRS病毒抗体复合物，其中所述其它多肽含有存在于PRRS病毒ORF 7多肽、PRRS病毒ORF 6多肽和PRRS病毒NSP 1多肽中的氨基酸序列。
32.一种测定动物是否接种过病毒的疫苗形式或受该病毒的天然产生形式感染的试剂盒，所述试剂盒装有
(a)第一多肽，其所具有的氨基酸序列使得所制备的抗所述病毒的所述疫苗形式的抗体与所述第一多肽结合，所制备的抗所述病毒的所述天然产生形式的抗体与所述第一多肽结合，和
(b)第二多肽，其所具有的氨基酸序列使得所制备的抗所述病毒的所述疫苗形式的抗体与所述第二多肽结合，所制备的抗所述病毒的所述天然产生形式的抗体不与所述第二多肽结合。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述动物是脊椎动物。
34.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述动物是猪。
35.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒是PRRS病毒。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述疫苗形式是减毒的PRRS病毒。
37.如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述疫苗形式是RespPRRS疫苗。
38.如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述第一多肽含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽C-末端部分中的氨基酸序列。
39.如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述第二多肽含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽N-末端一半中的氨基酸序列。
40.一种测定动物对病毒的免疫状态的方法，其中所述免疫状态是(1)所述动物接受过所述病毒的疫苗形式，(2)所述动物受所述病毒的天然产生形式感染，或(3)所述动物在免疫学上对所述病毒是原初状态，其中所述方法包括
(a)在第一多肽与第一样品中如果存在的抗体形成第一多肽抗体复合物的条件下使所述动物的第一样品与所述第一多肽接触，其中所述第一多肽含有的氨基酸序列使所制备的抗所述病毒的所述疫苗形式的抗体与所述第一多肽结合，所制备的抗所述病毒的所述天然产生形式的抗体与所述第一多肽结合；
(b)在第二多肽与第二样品中如果存在的抗体形成第二多肽抗体复合物的条件下使所述动物的第二样品与所述第二多肽接触，其中所述第二多肽含有的氨基酸序列使所制备的抗所述病毒的所述疫苗形式的抗体与所述第二多肽结合，所制备的抗所述病毒的所述天然产生形式的抗体不与所述第二多肽结合；和
(c)检测是否存在所述第一多肽抗体复合物以及是否存在所述第二多肽抗体复合物，其中存在所述第一多肽抗体复合物并存在所述第二多肽抗体复合物表明所述动物接种过所述病毒的所述疫苗形式，其中存在所述第一多肽抗体复合物并且不存在所述第二多肽抗体复合物表明所述动物受所述病毒的所述天然产生形式感染，其中不存在所述第一多肽抗体复合物并且不存在所述第二多肽抗体复合物表明所述动物在免疫学上对所述病毒是原初状态。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述动物是脊椎动物。
42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述动物是猪。
43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述病毒是PRRS病毒。
44.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述疫苗形式是减毒的PRRS病毒。
45.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述疫苗形式是RespPRRS疫苗。
46.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第一多肽含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽C-末端一半中的氨基酸序列。
47.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第二多肽含有存在于VR2332或RespPRRS PRRS病毒ORF 5多肽N-末端一半中的氨基酸序列。
48.一种具有PRRS病毒NSP 1多肽或所述PRRS病毒NSP 1多肽片段的氨基酸序列的基本上纯的多肽，其中所述片段长20个氨基酸残基以上。
49.一种具有PRRS病毒NSP 2多肽或所述PRRS病毒NSP 2多肽片段的氨基酸序列的基本上纯的多肽，其中所述片段长20个氨基酸残基以上。
50.一种具有PRRS病毒NSP 4多肽或所述PRRS病毒NSP 4多肽片段的氨基酸序列的基本上纯的多肽，其中所述片段长20个氨基酸残基以上。
51.一种表达PRRS病毒NSP 1、NSP 2或NSP 4多肽的宿主细胞。
52.如权利要求51所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是原核细胞。
53.如权利要求51所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是细菌细胞。
54.一种测定猪对PRRS病毒的免疫状态的方法，其中所述免疫状态是(1)所述猪接受过所述PRRS病毒的疫苗形式，(2)所述猪受所述PRRS病毒的天然产生形式感染，或(3)所述猪在免疫学上对所述PRRS病毒是原初状态，其中所述方法包括
(a)在第一多肽与所述猪的第一样品中如果存在的抗体形成第一多肽抗体复合物的条件下使所述猪的第一样品与所述第一多肽接触，其中所述第一多肽含有的氨基酸序列使所制备的抗所述PRRS病毒的所述疫苗形式的抗体与所述第一多肽结合，所制备的抗所述PRRS病毒的所述天然产生形式的抗体与所述第一多肽结合；
(b)在第二多肽与所述猪的第二样品中如果存在的抗体形成第二多肽抗体复合物的条件下使所述猪的第二样品与所述第二多肽接触，其中所述第二多肽含有的氨基酸序列使所制备的抗所述PRRS病毒的所述疫苗形式的抗体与所述第二多肽结合，所制备的抗所述PRRS病毒的所述天然产生形式的抗体不与所述第二多肽结合；和
(c)检测是否存在所述第一多肽抗体复合物以及是否存在所述第二多肽抗体复合物，其中存在所述第一多肽抗体复合物并存在所述第二多肽抗体复合物表明所述猪接种过所述PRRS病毒的所述疫苗形式，其中存在所述第一多肽抗体复合物并且不存在所述第二多肽抗体复合物表明所述猪受所述PRRS病毒的所述天然产生形式感染，其中不存在所述第一多肽抗体复合物并且不存在所述第二多肽抗体复合物表明所述猪在免疫学上对所述PRRS病毒是原初状态。
55.一种降低能检测猪样品中PRRS病毒抗体的试验中背景信号的方法，其中所述试验包括使含有PRRS病毒多肽的固体支持物与所述猪样品接触，所述方法包括用pH值大于8.0的封闭液处理所述固体支持物。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述pH值大于8.5。
57.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述pH值大于9.0。
58.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述pH值大于9.5。
59.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述pH值大于10.0。
60.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述封闭液是牛奶。
61.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述封闭液是PBS配制的脱脂奶。
62.一种含有PRRS病毒多肽的固体支持物，其中所述固体支持物用pH值大于8.0的封闭液处理。
63.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述pH大于8.5。
64.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述pH大于9.0。
65.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述pH大于9.5。
66.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述pH大于10.0。
67.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述封闭液是牛奶。
68.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述封闭液是PBS配制的脱脂奶。
69.如权利要求62所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物是塑料板。
70.一种提高附着于固体支持物的多肽与和所述多肽相结合抗体的反应能力的方法，所述方法包括使所述固体支持物与所述多肽和溶菌酶接触。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述多肽是PRRS病毒多肽。
72.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述多肽是PRRS病毒ORF7多肽。
73.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述多肽是未受PRRS病毒感染的细胞产生的重组多肽。
74.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述抗体是抗-PRRS病毒多肽抗体。
75.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶的鸡蛋溶菌酶。
76.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述多肽和所述溶菌酶以每1ng所述溶菌酶至少4ng所述多肽的比例与所述固体支持物相接触。
77.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶和所述多肽以每1ng所述多肽至少1ng所述溶菌酶的比例与所述固体支持物相接触。
78.一种含有PRRS病毒多肽的固体支持物，其中所述固体支持物与PRRS病毒多肽和溶菌酶接触过。
79.如权利要求78所述的固体支持物，其特征在于，所述多肽是PRRS病毒ORF 7多肽。
80.如权利要求78所述的固体支持物，其特征在于，所述多肽是未受PRRS病毒感染的细胞产生的重组多肽。
81.如权利要求78所述的固体支持物，其特征在于，所述溶菌酶的鸡卵溶菌酶。
82.如权利要求78所述的固体支持物，其特征在于，所述多肽和所述溶菌酶以每1ng所述溶菌酶至少4ng所述多肽的比例与所述固体支持物相接触。
83.如权利要求78所述的固体支持物，其特征在于，所述溶菌酶和所述多肽以每1ng所述多肽至少1ng所述溶菌酶的比例与所述固体支持物相接触。
全文摘要
本发明提供涉及评估生物中是否存在抗－病毒抗体的方法与材料。例如，此文件提供用于测定某生物(例如，猪类成员，如猪)是否含有抗－PRRS病毒抗体的方法与材料。在其它实施方案中，本发明提供用于测定某具体生物是否接种过某病毒的疫苗形式，受该病毒的天然产生形式感染，还是对该病毒是原初状态的方法与材料。
文档编号A61K39/12GK101039693SQ20058002641
公开日2007年9月19日 申请日期2005年6月17日 优先权日2004年6月18日
发明者C·R·约翰逊, M·P·穆尔塔赫 申请人:明尼苏达大学董事会