专利名称：适于治疗皮肤衰老征兆的组合物的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于预防性和/或治疗性治疗皮肤衰老的征兆、包括维生素E、维生素C和茶提取物的组合物。在优选实施方案中，本发明涉及通过增强G1-抑制细胞的释放，由此使细胞更快地再生来利用维生素E、维生素C和茶提取物或包括它们的组合物减轻皮肤衰老的征兆。
人类的皮肤是表皮和真皮的复合材料。表皮的最顶端部分是角质层。该层是皮肤的刚性层，并且是受周围环境影响最大的一层。在角质层之下是表皮的内部部分。在表皮之下，真皮的最顶端层是乳突真皮，其由相对疏松的结缔组织组成。在乳突真皮之下排列的网状真皮是紧密的结缔组织，其在空间上组织在一起。网状真皮也与粗的皱纹有关。在真皮的底部有皮下层。
皮肤的主要功能包括保护、排泄、分泌、吸收、温度调节、色素生成、蓄积、感官知觉和免疫过程的调节。这些功能受由于衰老和过量的阳光曝晒而引起的皮肤结构变化的不利影响。例如，与皮肤衰老相关的生理变化包括屏障功能的损伤和表皮细胞代谢的降低。[Cerimele，D等，Br.J.Dermatol.，122 Suppl.35，p.13-20(1990年4月)]。
皮肤的机械性能，例如弹性，由其中的胶原和弹性纤维组织的网络的密度和几何结构所控制。胶原和弹性蛋白的损伤使其失去可收缩性质，导致皮肤的皱纹和皮肤表面的粗糙。当皮肤衰老或变得不健康时，产生了松弛、萎缩纹、肿块、瘀伤或皱纹，变粗糙，而且合成维生素D的能力也降低了。衰老的皮肤也变得更薄，并由于胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖的改变而具有平的真皮表皮界面。[Fenske，N.A.，and Lober，C.W.，J.Am.Acad.Dermatol.，15571-585(1986年10月)；Montagna，W.and Carlisle，K.，Journal of Investigative Dermatol.，73(1)47-53(1979年)]。
将各种维生素和矿物质施与个体来治疗某些当病人维生素和矿物质缺乏时发生的皮肤病或其它病症。例如，维生素A参与痤疮的治疗并促进伤口愈合；维生素C(抗坏血酸)参与皮肤损伤和伤口愈合的预防；维生素E是一种抗氧化剂；铜参与弹性组织缺乏的治疗。[Neldner，K.H.，Amer.Acad.Derm.Annl.Mtg.，Wash D.C.，Dec.6，1993]。维生素C的局部使用也被认为能够避免阳光损伤、减少结缔组织的破坏，并可能促进胶原蛋白的合成。[Dial，W.，Medical World News，p.12，March1991]。为了促进皮肤保湿、对细胞进行紫外线防护、延缓早期的皮肤衰老，维生素E常常作为消炎剂来局部使用。
基于儿茶素的制剂，包括proanthanol和原花色素是非常有效的自然存在的抗氧化剂。例如，这些化合物是在花、植物叶子和葡萄籽中发现的。[Lubell，A.，Cosmetic Dermatol.9(7)58&60(July 1996)]。营养素对于衰老过程的潜在重要性已经成为几十年来人们所关注的问题，其不仅包括饮食对于细胞衰老和死亡的作用，也包括营养素在降低免疫活性、骨胳完整性、激素平衡及其它常常与衰老的生物体相联系的身体机能上所起的作用。一些营养素，包括维生素和必需矿物质，已经与这些疾病有益地联系在一起了。
衰老与人的生理特征的变化和许多生理机能的衰退相关联。虽然已知衰老的现象，但衰老的基本性质还未被很好地认识。在衰老的一些理论中，首先由Harman在1956年提出的衰老的自由基理论(J.Gerontol.1956，11，198-300)在最近几十年内受到越来越多的关注。该理论假设自由基反应是单个通用的过程，其可能决定了衰老并且密切地参与许多与衰老相关的疾病。该理论的现代概念得到了近年来积累的数据的支持，阐明了在有利于氧化胁迫的抗氧化剂/氧化强化剂的平衡基于时间的变化，所述氧化胁迫可能导致细胞机能的协调异常和衰老。
存在于大多数好气菌中的复杂的内在抗氧化剂防御机制清除了自由基，并减低了氧化胁迫。自由基和氧化胁迫将导致细胞毒性，并促进衰老过程。在最大寿命和潜在的抗氧化剂能力之间强的正相关性已经在若干氧化防御机制中得以确认(Cutler，R.G.，1991，Am.J.Clin.Nutr.，53，373S-379S)。此外，已经阐明了特定抗氧化剂的组织浓度与哺乳动物的固有寿命之间的正相关性。
由天然存在的物质包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽、β-胡萝卜素和histadine提供了抗氧化剂的活性。而且，细胞内酶诸如超氧物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶和过氧化氢酶，也提供了对于活化氧自由基的保护。光老化的不同临床模式是已知的，并已被文献所报道。老化相关的主要皮肤变化包括干燥、皱纹、松弛和各种良性肿瘤的发展。内在老化和长期暴露于紫外线和其它潜在的外在危险所产生的最终结果是皱纹、发黄、松驰、干燥和革状的皮肤。此外，由于反复的太阳辐射导致了前癌以及癌病变。
抗氧化剂维生素E和C以及β-胡萝卜素都以其在退行性疾病，例如癌和心血管疾病的预防中的潜在作用受到相当的关注。
已知维生素C作为抗氧化剂和自由基清除剂，在正常的细胞代谢中直接与产生的过氧化物、羟基和单线态氧反应。氧是生命所必需的。氧也以一些自由基的形式存在，其与致癌过程的开始和开始后阶段以及侵入和转移过程都有联系。
除了它的抗氧化剂性质以外，对于维生素C的抗癌性质没有一个普遍接受的和经过验证的解释。很可能包含各种途径，其包括(1)通过促进淋巴细胞的产生来强化免疫系统；(2)补救细胞自由基损伤；(3)抑制透明质酸酶，维持肿瘤周围的底物的完整和防止转移；(4)通过吞噬细胞活性的增强来杀死肿瘤病毒；(5)校正通常存在于癌症患者中的抗坏血酸缺乏；(6)刺激肿瘤“坚壁起来(walling off)”所需的胶原蛋白形成和稳定；以及(7)中和致癌毒素。
作为强烈的免疫反应所需要的关键营养素和重要的脂溶性抗氧化剂，已经证明了维生素E的癌症预防作用。为了减轻癌症，利用维生素E作为预防营养剂来防止进一步的氧化胁迫是所有减轻癌症的营养方案的基础。
美国专利5,648,377描述了亲脂性和亲水性的抗氧化剂的制剂和组合，及其在治疗、食品、营养品和化妆品领域的应用。这些制剂是基于类胡萝卜素、前类胡萝卜素及其具有儿茶酚结构的多元酚的衍生物的应用。这些制剂可被用于预防至少部分与自由基产生过剩相关的生理病理状况，特别是老化、动脉粥样硬化和癌症。因此，意外地发现亲水性抗氧化剂与亲脂性抗氧化剂的组合发挥远大于在相等浓度下测定的单个化合物的总和的抗氧化活性。具体公开的抗氧化剂或其原料是从葡萄中提取的procyanidol低聚物、番茄烯、维生素E和原花青素A2。
美国专利US5,156,852公开了一种用于清除与眼病相关的自由基及其它氧化剂的组合物，其包括维生素E和C、醋酸锌、铜、硒、锰以及L-半胱氨酸、吡哆醇和核黄素这三者中的至少一种。维生素C和E起抗氧化剂的作用，而醋酸锌、铜、硒和锰作为金属酶的辅因子来清除氧化剂。其余的三种化合物能增加谷胱甘肽的浓度。
抗氧化剂是体内抵御氧化胁迫的重要成分，并且已知具有普遍的抗老化特性和特定疾病防护的功能。在这方面重要的抗氧化剂例如为维生素E、维生素C和胡萝卜素，其组合提供了协同的细胞保护(Boehm，F.，Edge，R.，McGarvey，D J，FEBS Lett.436，387-389，1998)。此外，其它来源于食物而没有维生素功能的抗氧化剂，例如类黄酮、多酚或番茄红素也具有非常重要的抗氧化功能。
一般已知某些维生素和矿物质、抗氧化剂和植物提取物具有有益的健康效果。例如，许多年前就已知了抗氧化剂的一些有益的方面。抗氧化剂是与自由基，例如羟基基团反应的化学制剂，来保护某些生物学系统。已经表明从体内除去自由基能延长人类寿命；特别地，已经表明抗氧化剂包括类胡萝卜素、维生素E和尿酸的存在与哺乳动物中抗组织的天然自氧化和对DNA的氧化破坏正相关(Cutler，R.，Am.J.Clin.Nutr.53373S-9S(1991))。如使用例如A、E和C的维生素以及硒(US 5,149,321)来复苏大脑的方法所示，已知抗氧化剂也限制了依靠自由基来医治脑组织所造成的破坏。
除了其抗氧化剂活性之外，已知维生素A、C和E具有其它有益的健康效果。例如，已知维生素E有助于保持正常的血糖水平。作为另一个例子，已知维生素C在体内的结缔组织和结构组织的完整性上起必要的作用。已知维生素A在好的视觉和生长发育中起作用。因此，这些维生素的足量供应对于维持最佳健康状态是必需的。已经表明当与某些活性肽联合使用时，维生素A、E、C和硒的应用可用来作为抑制或阻止人类皮肤的胶原交联的手段(WO 90/06102)。
US 5,648,377涉及表现协同抗氧化剂活性的番茄红素与葡萄提取物(葡萄籽提取物)的组合物。US 6,627,231教导了令人惊奇的发现，即，葡萄籽提取物、番茄红素、维生素C、维生素E和β-胡萝卜素的组合给药以协同作用的方式显著增强了细胞保护。依据这种发现，上述物质的细胞保护作用在统计学上要大于葡萄籽提取物和番茄红素或维生素C和番茄红素的组合物的作用。
WO 01/78674公开了特别以胶囊和片剂的形式来用于治疗皮肤老化的组合物。这些组合物包括有效组分番茄红素、葡萄籽提取物、维生素C和维生素E。
WO 99/483 86公开了一种食品添加剂，其包括碧萝芷(pycnogenol)、番茄红素、维生素C和维生素E。
US 5,895,652涉及最佳化体内固有生化途径来由此限制在自然老化过程中的缺陷所引起的损伤的口服补充方案。这些补充的单个组合物列在一个很长的目录中，其延续了若干页，并包括番茄红素、维生素C、维生素E和葡萄籽提取物。
WO 98/33494公开了用于抗血管和毛细管疾病的营养素和治疗剂组合物，并组合了不同的抗氧化剂或具有抗氧化作用的组分，包括番茄红素、葡萄籽提取物、维生素E和茶多酚。
WO 01/51088公开了用于降低心血管疾病患病风险的组合物，并包括番茄红素、维生素E、维生素C和葡萄籽提取物。
WO 02/071874公开了用于防止或修复哺乳动物老化相关功能的缺乏，并包括维生素C、维生素E、番茄红素、洋甘菊(chamomille)干提取物、葡萄籽提取物和茶叶儿茶酸。
因此，现有技术教导了至少维生素C、维生素E、番茄红素和葡萄籽提取物降低对细胞的氧化损害，从而预防各种与老化相关的症状的组合作用。
抗氧化剂的基本功能是保护细胞不受活性氧(ROS)或其它自由基的氧化。ROS是高效中间体，其携带未成对电子，并容易影响人体组织中的其它分子，导致氧化反应。ROS作为线粒体呼吸的正常副产物而产生，并对正常细胞功能是必不可少的。但是，ROS也可以由氧化胁迫引起，由外部因素诱发，并已经与许多疾病过程相联系。一般地，在体内存在的抗氧化剂清除了这些非必需的ROS，并通过电子转移将其转化为稳定的化合物。抗氧化剂的这个活性防止了ROS对于细胞组分的氧化损伤。但是，当氧化胁迫过度时，体内的抗氧化剂可被耗尽，导致细胞损伤。过度的氧化胁迫可能是由一些抗肿瘤剂(其产生ROS)所诱发的，也可能是由癌症本身所诱发的。因此，已经进行了研究来确定抗氧化剂对于癌细胞和抗肿瘤剂活性的作用。
在氧化胁迫期间，过量的ROS导致脂类过氧化物酶的大量产生。随后，脂类过氧化物酶通过延长G1期或使细胞进入G0期来影响细胞周期。
在增殖细胞中，细胞周期包括四个阶段。Gap1(G1)是在有丝分裂和DNA复制之间的时期，以细胞生长为特征。在G1的限制点(R)发生的转变使细胞进入增殖循环。DNA的复制发生在合成(S)期，其后有第二个Gap期(G2)，其间进行生长以及细胞分裂的准备。在M期进行有丝分裂，并产生两个子细胞。
通过细胞周期的四个时期的传代是由细胞周期蛋白家庭所调节的，其作为细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)的调节亚基。调节通过细胞周期G1-S-G2期的进行的各种细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活性是由在细胞周期的特定时期的适当的细胞周期蛋白的合成所控制的。然后，细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物由主要位于cdk亚基上的复合物的关键残基的连续磷酸化与脱磷酸化作用来活化。
G1早期的细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物是与细胞周期蛋白D同种型相结合的cdk2、cdk4或cdk6。存在一些可以在G1期抑制细胞周期的蛋白。如果发生了DNA损伤，p53在细胞中积累，并诱发细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶的p21介导的抑制。Mdm2，通过促进p53的核释放/失活，成为失活p21介导的G1停滞的抑制反馈环路的一部分。类似地，TGF-b受体的活化诱导p15对细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制，而cAMP通过p27抑制细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物。如果细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物被抑制，则成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)处于低磷酸化状态，并与转录因子E2F紧密结合，抑制其活性。
经过限制点并转换到S期的途径是由细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活化所触发的，其使Rb磷酸化。磷酸化Rb与E2F分离，然后E2F得以自由启始DNA复制。在G期晚期，细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶2积累，并触发进入S期。在S期，整个基因组被复制。细胞周期蛋白B/细胞周期蛋白依赖性激酶2的合成与积累也在S期开始，但该复合物在Thr14-Tyr15处磷酸化，并失活。细胞周期蛋白A/细胞周期蛋白依赖性激酶2在S期积累，其活化触发向G2的转变，G2期以细胞周期蛋白B/细胞周期蛋白依赖性激酶2的积累、DNA复制的抑制、细胞生长和新蛋白质的合成为特征。
简单地说，在DNA的重新合成(在S期)和在有丝分裂(M期)的细胞分裂以前，每个细胞都具有非常精细的机制来修复DNA损伤。作为DNA损伤的反应，增加某些细胞周期调节剂例如p16和p53，通过抑制特异性细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk4和cdk2)来抑制细胞周期的进行。这使细胞能够在DNA在所谓的G1/S关卡重新合成之前修复DNA损伤，来防止细胞从G1进入S期(
图1)。在紫外线诱导损伤之后，如皮肤活组织检查所示在皮肤中p53增加，而恢复到基础水平是测量皮肤的修复状况的尺度。在细胞衰老阶段p16升高。
在早期研究中(Emri等人，J Invest Dermatol 115435-440，2000)在紫外线照射4天后，在G2/M期发现了成纤维细胞的剂量依赖性增加。
将G1停滞细胞释放到S阶段取决于DNA的损伤程度。因为DNA的损伤程度直接与细胞的氧化水平相关，可以预期氧化水平的最有效减少又将导致G1停滞细胞最快速地释放进入S阶段。根据现有技术，这意味着至少维生素C、维生素E、番茄红素和葡萄籽提取物的联合作用。
Abid-Essefi等人(TOXICOLOGY，192(2-3)237-248，2003年11月5日)描述了维生素E可能在DNA修复发生的时候起维持延长的细胞周期停滞的作用。
Galli等人(ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS，423(1)97-102，2004年3月1日)描述了维生素E对细胞周期蛋白D1的表达有抑制作用，同时减慢细胞的生长。
Gysin等人(FASEB JOURNAL，16(12)，2002年10月)描述了维生素E通过降低细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的水平来抑制细胞周期的进行。
Panaro等人(British Journal of Cancer(1999)80，1905-1911)显示细胞周期可被各种抗氧化剂，包括维生素C和很多的类黄酮所阻断。
因此，现有技术说明抗氧化剂的给药导致细胞周期阻断的延长。
已经显示了，紫外线(UVB和UVA)辐射引起皮肤各种形式的损伤。UVB辐射(波长280-315nm)连续地诱导我们皮肤的上层的(DNA)损伤。UVA辐射(315-400nm)更深地进入较下的皮肤层，真皮，但幸运的是这类辐射比高能的UVB辐射的损伤要小得多。
DNA损伤大概是紫外辐射所引起的最严重的损伤，因为其直接影响细胞的遗传潜能。UVB诱导的DNA损伤导致细胞周期调节剂的诱导，其后在DNA修复可以发生时细胞周期停滞。细胞的UVA照射可能通过间接的机制包括形成氧自由基来损伤DNA。迄今为止还没有完全阐明UVA如何诱导损伤影响细胞周期的控制，以及氧化损伤的抑制是否必然影响细胞周期的进行。
令人惊讶的是，申请人发现维生素C和维生素E的协同作用，优选连同白茶提取物，导致细胞从G1停滞快速的释放。
由此可见，细胞的氧化水平和相关的DNA损伤不能直接地与需要再生细胞并进入S期的时间有相互关系。用于处理皮肤衰老表征的有效方案无疑取决于在发生氧化损伤之后细胞继续生长的能力。
发明概述本发明的一个方面是用于预防性和/或治疗性处理患皮肤衰老的征兆的个体的包含维生素E、维生素C和白茶提取物的口服给药的组合物。特别地，当组合物作用于成纤维细胞时，老化的征兆减少。
根据本发明，在皮肤老化(例如皱纹)的反向确定临床特征中，获得了包含维生素C、E和白茶提取物以及各种植物提取物、氨基葡糖和矿物的口服营养补充剂的潜在好处。根据定义，营养剂是具有健康好处的物质，其包括疾病的预防和治疗。
以前已经证明了一些矿物质在对来自内在和外在因素的细胞保护中的作用。硒、硅、铜、锌和锰是可包括在根据本发明的制剂内的矿物质。锌作为超氧化物歧化酶(SOD)的辅助因子，其依次与铜SOD、线粒体锰SOD、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶同时起作用，作为主要的细胞抗氧化剂。锰，一种过渡金属，结合胶原纤维，并抑制弹性蛋白酶，所述弹性蛋白酶分解胶原和弹性组织。锰也在胶原和糖蛋白合成中起关键作用，并作为催化葡糖胺转换为透明质酸的辅因子。另外，已经显示了锰保护培养的人皮肤成纤维细胞不受UVA和过氧化氢的氧化损伤。
该组合物可包含更多已知抑制老化过程的组分。特别地，植物提取物例如白茶提取物、葡萄籽提取物、具有高含量番茄红素的番茄提取物、大豆提取物、琉璃苣籽油、亚麻籽油、洋甘菊干提取物和特定的分馏椰子油都与本发明相关。此外，例如列于各种组织包括软骨的提取物中的成分，可包括在该组合物中。
本发明的组合物可配制成任何适合的形式。优选配制本发明的组合物，用于口服给药。为了口服给药，本发明的组合物可以任何适当的形式提供，特别是以口服液、片剂、胶囊、营养食品或营养补充剂的形式。这样的组合物进一步包含至少一种合适的赋形剂和/或适于口服的助剂。
优选实施方式现在已经发现了减少皱纹和改善其它的皮肤状况，例如增加皮肤弹性和皮肤柔软度的制剂。此外，对于不健康的皮肤，例如老化的皮肤或日光照射过度的皮肤的预防或治疗，可有益地通过用本发明的组合物对需要治疗的人给药来实现。该组合物包括许多不同组分的组合，所述不同组分相互作用来提供所想要的对皮肤的改善。
本发明有益的药物组合物通过利用足够使皮肤细胞解除G1停滞量的维生素E和维生素C来预防和改善皮肤状况。该组合物的更多的有益组分可包含从例如葡萄籽和番茄中提取出来的天然存在的抗氧化剂、包含糖胺聚糖的提取物、具有结合胶原和弹性纤维并使皮肤变厚的有效量的过渡金属组分、以及抑制在皮肤中存在的抗胶原酶的足够量的基于儿茶素的组分。
较厚的真皮如愿地减少当皮肤区域变薄时出现的皱纹。除了解除细胞周期足短的令人惊奇的效果之外，抗氧化剂，例如维生素C，抑制了分解胶原和弹性组织的酶，胶原酶和弹性蛋白酶。这些抗氧化剂参与预防增加的皱纹，并促进皮肤组织的愈合。最终，包含过渡金属组分来结合胶原纤维，并抑制弹性蛋白酶，该酶也分解胶原和弹性组织。
包括主要抗氧化剂的组合物，其典型的是维生素C源，并优选是抗坏血酸，或其药学上可接受的盐或酯，更优选是棕榈酸抗坏血酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸钠或抗坏血酸盐，例如抗坏血酸钠、钾或钙或其混合物。当使用该组合物的口服制剂时，优选使用维生素C的非酸形式来降低当使用酸性形式时所出现的胃刺激。
术语“包含氨基葡糖的提取物”是指包括软骨、可从中提取的组分以及其衍生物，包括可从软骨和合成制备的衍生物中提取的组分的合成形式。这样的组合物也可在其它包含结缔组织的组织中，例如皮肤中得到，并可从中提取。软骨可选自海洋动物软骨、鱼类软骨、软体动物软骨和陆地居住哺乳动物软骨。海洋动物可选自由鲸、海豚和海豹；鱼可选自由鲨鱼、鲑鱼、金枪鱼、鳕鱼及其它已知的鱼类；软体动物可为鱿鱼；陆地居住哺乳动物可选自由牛、猪、鸡、鸭和火鸡。
软骨或其提取物优选选自牛软骨、猪软骨、鲨鱼软骨、鱿鱼软骨、鸡软骨和鲑鱼软骨。软骨本身可被使用。其可典型地以无水干燥形式使用，例如冻干、粉末状软骨。上述类型的软骨或其它含有合适的组分的组织的有用提取物可典型地通过熟组织的局部酶的蛋白水解，之后过滤并干燥水解产物，例如通过喷雾干燥或冷冻干燥进行制备。软骨提取物典型地包含从软骨中提取的一种或多种化合物，并优选包含糖胺聚糖，选择性地与肽相结合。
软骨的提取物优选包含软骨素硫酸盐、角质素硫酸盐、透明质酸或皮肤素硫酸盐或其混合物。术语软骨提取物指包括可从软骨中获得的化合物，但其事实上可通过其它来源获得这些化合物。
术语软骨提取物可涉及从软骨或其衍生物中提取的化合物。如上所述，软骨提取物可来自其它的天然来源，但可来自合成来源，即合成或半合成制备的来源。
软骨提取物优选包含选自由软骨素酯、角质素酯、透明质酸或其酯、皮肤素酯、肝素和乙酰肝素酯所组成的组的糖胺聚糖。这些可与蛋白质或肽结合或作为软骨素酯、角质素酯、透明质酸或其酯、皮肤素酯、肝素、乙酰肝素酯，优选软骨素硫酸盐、角质素硫酸盐、透明质酸或其酯、皮肤素硫酸盐、肝素、乙酰肝素硫酸盐的差向异构体或多聚体。糖胺聚糖可选自由软骨素硫酸盐和角质素硫酸盐所组成的组，其每个可选择性地与肽相结合。最优选地，本发明的组合物包含5％软骨提取物，其包含选择性地与肽结合的软骨素硫酸盐。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包含小于1％重量/重量的胶原，优选小于0.5％，特别优选小于0.1％胶原蛋白。使用典型的方式来制备胶原提取物，其不包含任何可见量的胶原。优选通过酶的蛋白水解而将胶原蛋白消化为肽来制备提取物。优选不将胶原或其来源进一步加到本发明的组合物中。在最优选的实施方案中，该组合物基本上是不含胶原的。
本发明的制剂可同时包括一或多种氨基酸以增加真皮的密度。优选联合使用两或多种氨基酸。L-或D-型氨基酸都可接受。赖氨酸和脯氨酸是最优选的氨基酸，并有利于组合使用。如果需要，也可以使用半胱氨酸、甲硫氨酸或其它氨基酸。氨基酸可包含在可溶形式例如氢氯化物，即L-赖氨酸氢氯化物中。氨基酸各存在大约2到25重量％，优选各存在大约4到20重量％，更优选各存在大约6到15重量％。在药物组合物中，每种氨基酸的单位剂量一般地是各大约35mg到200mg，优选各大约50mg到150mg，更优选各大约70mg到120mg。氨基酸另外的有用形式包括下列半胱氨酸源，优选N-乙酰半胱氨酸，可以组合物的大约1到10的重量％存在，优选大约2到8的重量％，更优选大约3到6的重量％。甲硫氨酸源，优选L-硒代甲硫氨酸，可以组合物的大约0.1到5的重量％存在，优选0.2到3的重量％，更优选0.3到1的重量％，其中硒组分占甲硫氨酸源的大约0.1到3的重量％。
包含有效量的一种或多种过渡金属组分结合胶原和弹性组织来复原皮肤。某些过渡金属组合物通过抑制弹性蛋白酶来抑制胶原和弹性组织的分解。优选过渡金属包括锌、锰和铜。
可加入锌组分来参与结合胶原和弹性纤维，两者都参与皱纹的预防和皱纹皮肤的复原。同时，已知锌是整个集合的金属酶的重要辅因子，并且并不限于清除潜在的氧化剂过氧化物的超氧化物歧化酶。
锌组分可为任何锌化合物或其在药学上可接受的盐，优选葡萄糖酸锌，其中锌一般以组合物的大约1到10的重量％存在，更优选大约2到7的重量％，最优选大约3到5的重量％。
本发明组合物中的抗氧化剂可以来自自然或合成来源。在典型的实施方案中，天然源选自由松树皮、葡萄、茶(Camelia sinensis)、欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)、银杏(Gingo biloba)、Cardusmarianum)、Vaccinium myrifilus、水飞蓟(Silybum marianum)所组成的组。
在适当的实施方案中，一个或多个天然抗氧化剂是从葡萄籽中提取出来的。
天然源的一个或多个抗氧化剂一般包含达到25％重量/重量的儿茶素、表儿茶精和没食子酸；达到90％重量/重量的表儿茶精二聚物、三聚物和/或其没食子酸盐，以及达到10％重量/重量的表儿茶精五聚物、六聚物和/或七聚物，和/或其没食子酸盐。
一个或多个天然抗氧化剂可选自多酚及其酯；抗坏血酸(维生素C)及其酯；以及其药学上可接受的盐。多酚一般地为儿茶素、无色花色素和黄烷酮；黄烷、异黄酮和花色素、黄酮醇、黄酮木脂素及其寡聚物。
这样的多酚、黄酮木脂素或类黄酮，是在许多植物中天然存在的抗氧化剂。在本发明中，异黄酮提取自大豆，黄酮提取自紫草科、百里香或欧芹，儿茶素提取自茶叶(优选白茶)，前花色素提取自葡萄(优选葡萄籽)。
在优选的实施方案中，天然抗氧化剂是从由前花色素A2和低聚物前儿茶精(OPC)，最优选低聚物前儿茶精选择的儿茶素。黄酮木脂素一般地是水飞蓟素或其组分之一，例如水飞蓟素、水飞蓟宁、次水飞蓟素和异水飞蓟素。
如上所述，特别优选天然抗氧化剂是来自葡萄籽，即葡萄的种子的提取物，所述提取物一般地是通过使用有机溶剂，例如丙酮和/或乙酸乙酯等提取葡萄籽、蒸发溶剂、再溶解水中的残渣、过滤和干燥(例如通过喷雾干燥或冷冻干燥)滤液来获得的。在特别优选的实施方案中，该提取物一般包含达到25％重量/重量的儿茶素、表儿茶精和没食子酸；达到90％重量/重量的表儿茶精二聚物、三聚物和/或四聚物，和/或其没食子酸盐；以及达到10％重量/重量的表儿茶精五聚物、六聚物和/或七聚物，和/或其没食子酸盐。
另外，抗氧化剂一般是类胡萝卜素、前类胡萝卜素、5-生育酚、植物甾醇和泛醌。类胡萝卜素是特别重要的亲脂性的抗氧化剂，其可选自α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、隐黄质、叶黄素和xanthofyll。
本发明的组合物一般包含小于25重量％的β-胡萝卜素，优选小于10％的β-胡萝卜素，特别优选小于0.1重量％的β-胡萝卜素。因此，本发明的进一步的方面涉及所述在极少或基本上没有β-胡萝卜素的条件下，可以获得有益效果的组合物。
番茄提取物，包含番茄红素。优选，番茄提取物包含大约5到12重量％，一般大约10重量％的番茄红素(重量/重量)。番茄提取物可来自单个番茄或番茄混合物。
在典型的实施方案中，用于制备番茄提取物的番茄种类是Lycopersicum aesculentum。
在本发明的优选实施方式中，组合物包含0.1到5重量％的番茄红素(重量/重量)，优选0.2到4重量％的番茄红素，例如0.3到2重量％的番茄红素，最优选0.3到1重量％的番茄红素，特别是0.3到0.8重量％，例如0.3到0.6重量％的番茄红素。
在本发明的组合物的选择性定义中，组合物包含植物提取物和软骨提取物，其中植物提取物包含葡萄籽提取物和番茄红素，其重量/重量比大约是5∶1到15∶1，优选大约10∶1。
依据本发明的进一步的合适的组合物包含下列组分10-200mg，优选20-100mg，更优选30-80mg，更优选35-65mg，最优选45-55mg的软骨提取物；10-200mg，优选20-100mg，更优选30-80mg，更优选35-65mg，最优选45-55mg的植物提取物；1-50mg，优选3-40mg，更优选5-30mg，更优选8-25mg，最优选10-20mg的维生素C；0.1-30mg，优选0.5-20mg，更优选1-15mg，更优选2-10mg，最优选3-7mg的维生素E；1-50mg，优选3-40mg，更优选5-30mg，更优选8-25mg，最优选10-20mg的白茶提取物；以及1-40mg，优选2-30mg，更优选3-20mg，更优选5-15mg，最优选7-12mg的葡萄糖酸锌，其中植物提取物包含低聚物procyanidol和番茄红素，软骨提取物包含糖胺聚糖。
用于给药的单位剂量可在50到2000mg之间，优选在100到1500mg之间，更优选在150到900mg之间，更优选在200到700mg之间，最优选在250到600mg之间。
虽然可使用任何合适的给药途径来向病人提供有效剂量的依照本发明的组合物，但是优选口服方式。合适的途径包括，可使用例如口服的、直肠的、肠胃外的、静脉内的、局部的、透皮的、皮下的、肌肉内等的给药方式。
合适的剂型包括片剂、锭剂、消散剂、分散剂、液剂、胶囊剂、贴片、栓剂等，虽然优选口服剂型。用于本发明方法的药物组合物包括如上所述的活性成分，也可包括药学上可接受的载体、赋形剂等，以及选择性的其它治疗组分。
术语“药学上可接受的盐”指从药学上可接受的无毒的酸或碱，包括无机或有机酸所制备的盐。这种无机酸的实例是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、乙酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自，例如，来自有机酸的脂肪族、芳香族、羧基和磺酸基类，所述有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙二酸、葡萄糖醛酸、马来酸、糠酸、谷氨酸、安息香酸、氨茴酸、水杨酸、苯乙酸、扁桃酸、embonic(双羟萘酸)、甲基磺酸、乙基磺酸、泛酸、苯甲基磺酸、硬脂酸、磺胺酸，、algenic和半乳糖醛酸。用于与本发明的硫酸盐或磷酸盐化合物形成潜在的盐的这种无机碱的实例是，包括用铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制取的金属盐。合适的有机碱可选自，例如，N，N-二苄基乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。
用于本发明的组合物例如悬浮液、液剂和酏剂；气雾剂；例如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，的载体的组合物，在口服固体制剂(例如粉剂、胶囊剂和片剂)的情况下，口服固体制剂比口服液体制剂更优选。最优选的口服固体制剂是片剂。
由于其给药的便利，片剂和胶囊剂代表了最有益的口服单位剂型，此时使用固体药物载体。如果需要的话，可通过标准水成或非水成的技术来包被片剂。
例如，可通过挤压或模压选择性地与一或多辅助成分制备片剂。可通过在合适的设备上压缩自由流动形式的活性成分，例如粉末或颗粒，选择性地与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合，来制备挤压的片剂。可通过模压，在合适的设备上，用被惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备模压片剂。
实施例1抗氧化剂组分对细胞周期的影响在一系列实验中，使用FACS分析来测定紫外线对于培养的皮肤成纤维细胞的细胞周期分布的影响。发现UVB(1kJ/m2)和UVA(250kJ/m2)都引起细胞周期的抑制。同时对于UVA，在照射之后第一天发现G1细胞增加。研究了抗氧化剂治疗对于皮肤成纤维细胞的细胞周期的作用。
材料和方法细胞培养和照射(更加详尽的资料参考de Leeuw SM，Smit NP，VanVeldhoven M，Pennings EM，Pavel S，Simons JW，Schothorst AAMelanincontent of cultured human melanocytes and UV-induced cytotoxicity.J.Photochem.Photobiol.B 2001，61106-113)将来自人皮肤的成纤维细胞在补充有2.5％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)以及100IU/l青霉素和100g/l链霉素的Dulbecco氏修饰Eagle培养基中，在37℃、低于5％二氧化碳浓度下培养。为了继代培养，将细胞在0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液(Gibco)中分离，水解为1∶5，在90mm Greiner Petri盘中对照培养基中进行维持。在三天之后，将细胞在不同的培养基中孵育对照；以及维生素E和C(7和10μM)加上白茶(5μgram/ml)。三天后除去培养基，用4ml PBS冲洗细胞，在带盖的盘中在5ml Hank氏平衡盐溶液中照射。使用2.001型紫外源Sellas Sunlight灯(Sellas，Gevelsberg，Germany)以250KJ/m2剂量的UVA进行照射。UVASUN蓝板和UVASUN蓝薄膜滤波器将波长低于320nm的光滤掉2。用使用WBS320#801传感器的IL700A测定辐射计(International Light Inc.，Newburyport，MA，USA)来监控剂量。
通过FACS分析测定细胞周期分布在UVA处理之后，将细胞在对照培养基中保存过夜。在收获细胞一小时之前，加入100μM BrdU(5-溴代-2-脱氧尿苷，Sigma，B5002)来掺入到DNA中。通过胰蛋白酶处理来收获细胞，并在用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗之后同定于70％乙醇中。
在除去过量乙醇之后，将细胞在含0.1％胃蛋白酶的0.9ml的2MHCl中孵育35分钟。加入1M Tris(2.1ml)，用(PBS-Tween 0.5％)冲洗细胞两次。然后将细胞在用含有5％初生小牛血清的PBS-Tween以1∶50稀释的100μl小鼠-α BrdU抗体(DAKO，Bu20A)中室温孵育1小时。在冲洗两次之后，将细胞在含有以1∶100稀释在PBS-Tween-NBCS稀的100μl山羊抗小鼠IgG1-FITC(Pharmingen，no 553443)中黑暗中4℃孵育1小时。在冲洗两次之后，加入400μl溶于PBS的20μg/ml碘化吡啶，0.1％核糖核酸酶(RNase，Sigma)，通过使用FACS-Caliburl(Beckton Dickinson)的FACS分析来测定细胞。以F1-1来测定BrdU的FITC标记，记录FL-3和10000事件中的P1，并用细胞测定软件(Beckton Dickinson)来进行分析。
结果图1显示了与伪照射成纤维细胞培养物(灰色)相比，在UVA照射一天之后(黑色)细胞在G1和G2期的分布状态。
结果确定地表现了与对照细胞相比，在用维生素E+维生素C+白茶处理的细胞中存在于G1和G2期的细胞的百分数的差异。UVA照射引起对照细胞中处于G1期的细胞(G1停滞)的增加。在用维生素E+维生素C+白茶处理的细胞中存在于G1阶段的细胞的百分数相当低，表明与对照培养物相比，较少细胞在G1阶段被抑制。因此，与对照细胞相比，在用维生素E+维生素C+白茶处理的细胞中存在于G2期的细胞的数目更多。
重建的皮肤等效物实施例2组合物对使用离体培养的皮肤等效物的真皮细胞外基质和表皮的发育和构建的影响试验的目的在于使用3-D体外重建的皮肤等效物(SE)的技术来测定根据发明的特定组合物的效果(以下简称高浓度组合物和低浓度组合物、或一般浓度组合物)。
用较低和较高浓度的组合物(高浓度组合物和低浓度组合物)来处理来自19或49年供体的细胞所制备的SE，或对其不作处理和培养35，42或60天。此后检查培养物的表皮和真皮层结构和组织。此外，使用Q RT-PCR和免疫荧光法来确定主要细胞外基质(ECM)组分例如肌原纤维蛋白、弹性蛋白和I型胶原的合成。
材料和方法细胞培养角质细胞和成纤维细胞的原始培养物是由整形外科的手术获得的残余材料(residus operatoire)所提供的人。成纤维细胞在补充有10％牛血清(Hyclone，Logan，Utah，USA)、20μg/ml庆大霉素(Panpharma，Fougeres，France)、100IU/ml青霉素(Sarbach，Suresnes，France)以及1μg/ml的两性霉素B(Bristol Myers Squibb，Puteaux，France)的Dulbecco氏修饰Eagle培养基(DMEM with Glutamax-1，LifeTechnologies，Cergy Pontoise，France)中生长。对于SE而言，角质细胞在分别补充有10％小牛血清(FCS)(HyClone)、10ng/ml表皮生长因子(EGF)(Austral Biologic，San Ramon，California，USA)0.12IU/ml胰岛素(Lilly，Saint-Cloud，France)、0.4μg/ml氢化可的松(UpJohn，St Quentin enYvelines，France)、5g/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(Sigma，St QuentinFallavier，France)、24.3μg/ml腺嘌呤(Sigma)和抗生素的DMEM和Ham′sF12(Life Technologies)的3∶1混合物中生长。为了制取角质细胞单细胞层，在铺满生长后5天内在补充有12 mMCaCl2的限制K-SFM培养基(Life Technologies)中生长。
皮肤等效物和真皮等效物使用通用的人工实验室技术，在实验室中制备3-D体外重建的皮肤等效物(SE)。SE在形态上和生物化学上与具有完全发育的真皮、和角质层的天然人类皮肤非常相似(Saintigny G，Bonnard M，Damour O，Collombel C.Acta.Derm.Venereol，1993，73175-180；Sahuc F，Nakazawa K，Bethod F，Collombel C，Damour O.Wound RepReg，1996，493-102)。
如Duplan-Perrat等人，2000所描述的方法来制备皮肤等效物(SE)。简要地说，通过在胶原-糖胺聚糖-脱乙酰壳多糖多孔spongemimedisk@(Coletica，Lyon)上加入2×105成纤维细胞/cm2的悬浮液来制备真皮等效物(SE)。在包含1mM抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)的成纤维细胞培养基中培养全部的等效物21天。每天对真皮等效物补料(DE)。在第14天，以250,000细胞/cm2的密度在真皮等效物上接种角质细胞。在角质细胞培养基中深层培养7天之后，将SE放到气液交界面上，在包含补充有10％小牛血清、10ng/ml EGF 0.12IU/ml胰岛素、0.4μg/ml氢化可的松和抗生素的DMEM的简化角质细胞培养基中培养。培养基补充以50μg/ml L-抗坏血酸，并每天替换。总共培养SE35，42或60天。
补充组合物在SE发育的初期(从培养基首次更换开始)，将测试的组合物以两种浓度加入(为了确定剂量反应关系)到培养基中。将成纤维细胞在Mimedisk上接种之后从培养基首次更换开始，直到试验的最后，将组合物加入到培养基中。同时，用仅包含能溶解活性组合物化合物的的溶剂，四氢呋喃(THF)来制备对照皮肤等效物。
以两种浓度加入组合物
样品分析在培养35，42或60天之后，收集SE，并进行分析。将每个SE条件的三种样品固定于福尔马林中，并包埋到石蜡中。五μm切片用苏木精-根皮红-番红花色素染色，在光学显微镜下观察来鉴定真皮和表皮的结构。进一步地，为了进行免疫荧光法测定将三个样品归入组织-tek，为了进行定量RT-PCR将三个样品在-80℃下冷冻。
免疫组织学和免疫荧光法将皮肤等效物的样品包埋到OCTTissue-Tek(Miles，Immunotech，Marseille，France)中。用Frigocut 2800 cryotome(Reichert-Jung，Paris，France)获得六个微米的冷冻切片，自然干燥，在包含1％(wt/vol)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭。用于该研究的抗体列于下表。
用于皮肤等效物的抗体
特异于人胶原的I型胶原抗体不与用于制备真皮基质的牛胶原交叉反应(Noblesse等人，J Invest Dermatol.，2004；122(3)621-30)。
第二抗体，标记有FITC的山羊抗兔IgG(1∶50稀释，SanofiDiagnostic Pasteur，France)或山羊抗小鼠IgG(1∶50稀释，Cedarlane，Canada)，混合了0.1％的伊文思蓝来减少海绵网的非特异性染色(Kieny和Mauger，1984)。对于对照，省略了第一抗体。处理每个样品的多个切片来保证代表的样品。
定量RT-PCR为了在第42天和第60天产生弹性蛋白、肌原纤维蛋白1和I型胶原的mRNA，我们使用定量RT-PCR。使用来自Promega的“SV 96总RNA分离系统”提取皮肤等效物的总RNA。对于每个样品，获得100μl纯化的总RNA，用分光光度计(spectramax190；Devices)在260nm下定量，并在使用前在-80℃下保持冷藏。
为了进行定量RT-PCR，我们设计了特异于每个基因的引物。我们使用“QuantiTect SYBR Green RT-PCR”试剂盒(Qiagen)，利用特异的引物来进行一步的定量RT-PCR。反应混合物包括SYBR绿色缓冲液1X；0.5μM的两种特异引物；1μl的酶混合物；50ng的总样品RNA；50μl的无RNase的qsp溶液。反应在OPTICON热循环仪(MJ Research)上进行。在反应进行之后，将样品在2％琼脂糖凝胶中电泳来保证PCR产品是纯的。
结果组合物对于来自19岁供体的真皮成纤维细胞的皮肤等效物重建的效果无论浓度如何，组合物延缓了表皮的老化。图2显示高浓度和低浓度组合物对于来自19岁供体的真皮成纤维细胞重建的皮肤等效物的效果。苏木精-根皮红-番红花色素染色。放大倍数25x。
在培养的42天里，对照样品中的表皮显示了具有若干层有活力的表皮细胞和角质层的典型结构(图2，对照，42天)。通过延长培养时间(对照，60天)，表皮变得相当薄，完全分化，并显示出长时间持续培养中SE退化的一些典型特征(表皮衰老)。用组合物的处理导致衰老的延迟，其由厚的、多层的和更新的表皮的形成显示。(图2，高和低浓度的组合物，60天)。对真皮的影响不明显。
组合物对于从49岁供体的真皮成纤维细胞重建的皮肤等效物的效果影响图3显示该高浓度和低浓度的组合物对于由49岁供体的真皮成纤维细胞重建的皮肤等效物的效果。苏木精-根皮红-番红花色素染色。放大倍数40x。
组合物延缓表皮衰老，刺激致密真皮结构的形成，并延迟来自49岁供体SE中真皮的衰老。低浓度的组合物显示更好的效果(图3)。
用来自19岁和49岁供体的成纤维细胞所制备的对照SE之间具有显著差异。来自49岁供体的对照样品在培养期间显示了与来自19岁的细胞的对照样品相比，表皮和真皮结构更快的退化(比较图2和3中的第42天和第60天的对照)。在第42天和第60天，来自49岁供体的SE的对照样品与相应的来自19岁供体的SE的对照样品相比，显得更加加剧的退化，并显示角质表皮残基的分化。通过用组合物进行治疗，减少了这个效果。低浓度的组合物与高浓度的组合物相比，提供了更多有益的结果。产生的SE良好生长成致密的真皮和厚的、分层良好的表皮。在图3中比较了第60天的对照物与低浓度的组合物。
结果证明用该组合物处理皮肤等效物确实对于表皮和真皮的结构、质量和保养都具有积极的效果。组合物通过刺激表皮角质细胞的生长来延缓表皮衰老，无论细胞供体的年龄，其都导致厚的、具有优良结构的和更新的表皮。其对于致密真皮结构的形成和对来自49岁供体的SE中真皮的衰老的延缓，也有明显的效果。
因此，组合物的治疗，即用依照本发明的组合物的治疗，对于表皮具有很积极的效果其无论细胞的年龄都降低了表皮衰老，并刺激了角质细胞生长和更新，即使对于来自老化细胞的SE具有更明显的效果。与在培养42天之后显示表皮厚度减少和无单元更新的未处理样品相比，组合物的治疗导致厚的更新表皮的保持。在真皮中，组合物刺激ECM(细胞外基质)组分的产生和沉积。
免疫组织化学和定量RT-PCR对于用组合物(低浓度和高浓度)处理的来自49岁供体的成纤维细胞制备的SE在培养的60天之后显示I型胶原的mRNA，合成肌原纤维蛋白和弹性蛋白的明显增加。来自19岁供体的成纤维细胞不存在这种效果。这个效果得到I型胶原，弹性蛋白和肌原纤维蛋白的免疫组化染色的证实。此外，对于用该组合物处理的成纤维细胞，在60天之后表达增殖标记Ki67的细胞的数目比对照高4倍；其适合于来自19岁和49岁供体的成纤维细胞。
实验3体内实验片剂依照下列组分的列表用常规程序来制备片剂。
片剂1·抗坏血酸钠·d-α-生育抗坏血酸·白茶提取物·大豆提取物·软骨提取物·葡萄籽提取物·番茄提取物·葡萄糖酸锌·药用赋形剂片剂2·抗坏血酸钠·d-α-生育抗坏血酸·白茶提取物·大豆提取物·软骨提取物·洋甘菊提取物·葡萄籽提取物·番茄提取物·葡萄糖酸锌·药用赋形剂产物的检测对测试的50个雌性对象施用片剂(早晨片剂I，晚上片剂II)来确定对于皮肤的真皮密度、硬度和网纹、皱纹存在的作用。试验在6个月后完成。不在对照组的试验对象每日随着饮食消耗安慰剂片剂，消耗片剂1的试验材料的两个(2)片剂和片剂2的试验材料的两个(2)片剂。总共38个对象完成了用有活性的片剂进行的研究，43个对象完成了用安慰剂片剂进行的研究。
以下包含施用的标准(i)45-65岁(绝经后一到五年-70％的对象不使用HRT，30％的对象最少在研究开始以前3个月使用HRT)，(ii)皮肤类型I-III(Fitzpatrick；FitzpatrickII-III和GlogauII-III)，(iii)中等到严重的衰老征兆(GlogauII-III)，(iv)在手背上的光致损伤。
临床分级的结果检查测定了受试者在脸的右边或左边、右手背或左手背和décolletage(胸)上的特定部位的以下皮肤衰老参数脸-皱纹(前额)-细皱纹(眼周围的区域)-能触知的粗糙/干燥-细皱纹(口周围的区域/嘴唇区域)-色斑着色过度-松弛(用手指皮肤的竖直提升来评价)-下垂(口周围区域皮肤的可见下垂)-眼下黑圈-毛细血管扩张-整个脸部外观手-绉-变薄-色斑着色过度胸-绉-色斑着色过度
-整个外观使用如下范围记录临床分级的结果0＜3轻微的3＜6中等的6＜9严重的将有活性的片剂与安慰剂进行比较。用星号表示的参数指示有活性的片剂明显比安慰剂有效(p＜0.05)。值的减少(任意单位)指示了改善。
临床分级结果
超声皮肤密度将超声用于临床和实践医疗已经超过20年了。它是一种测定真皮密度的可靠的、非侵入性的方式。超声波由皮肤的结构成分所反射，其显示为在超声图象上的色斑。色斑越多，皮肤组织越致密。
使用DUBplus(Taberna，Pro Medicum，AG)超声装置来测定右或左眼角区域的B-扫描图像(通过分类选择)。使用具有标准20MHz传感器的DUBplus超声装置，其焦距12mm，分辨度40dB。在测试的位点处，28db的增益调整产生整个皮肤厚度的最好的整体形象。用眼角区域中垂直于躯干轴方向的探头来进行测量。或者，可在前额的眉间区域进行测定。密度值的增加显示表皮和皮组织变厚，并能被用作改善真皮结构的指征。与安慰剂组相比，有活性的片剂补充组在使用6个月之后，真皮的密度有明显改善(p＜0.05)。
结果的概述
权利要求
1.用于预防和治疗哺乳动物的皮肤病症的口服给药组合物，其包括维生素E、维生素C和白茶提取物。
2.权利要求1的组合物，进一步包含·提取自葡萄籽、番茄、大豆和/或洋甘菊的天然存在的抗氧化剂；·包含糖胺聚糖的提取物；·至少一种过渡金属组分。
3.权利要求2的组合物，其中包括糖胺聚糖的提取物是软骨提取物。
4.权利要求3的组合物，其中的软骨提取物包含软骨素硫酸盐、角质素硫酸盐、透明质酸或皮肤素硫酸盐或其混合物。
5.权利要求1到4任一项的组合物，其中的过渡金属组分是锌。
6.权利要求5的组合物，其中的锌是以葡萄糖酸锌的形式存在。
7.权利要求6的组合物，进一步包含药用赋形剂。
8.包含如下成分的组合物在制备适于预防性和/或治疗性处理具有皮肤衰老征兆的个体的口服给药的制剂中的应用·维生素E、·维生素C、·白茶提取物。
9.根据权利要求8的组合物的应用，其中的组合物进一步包含软骨提取物。
10.根据权利要求8或9的组合物的应用，其中组合物进一步包含独立地选自葡萄籽提取物、葡萄糖酸锌和番茄提取物的组分。
11.根据权利要求8-10任一项的组合物的应用，其中组合物包含浆剂、片剂、胶囊剂或营养食品或补充剂。
12.一种组合物，基于该组合物的总重量其包含·0.1到60重量％的维生素E·0.2到90重量％的维生素C·0.2到90重量％的白茶提取物。
13.权利要求12的组合物，基于组合物的总重量进一步包含5到95重量％的提取自葡萄籽、番茄和/或洋甘菊的天然存在的抗氧化剂。
14.权利要求12或13的组合物，基于该组合物的总重量进一步包含5到95重量％的大豆提取物。
15.权利要求12到14任一项的组合物，其中维生素E占该组合物的总重量的0.5到20重量％。
16.权利要求12到15任一项的组合物，其中维生素C占该组合物的总重量的1到30重量％。
17.权利要求12到16任一项的组合物，其中维生素E占该组合物的总重量的1到10重量％。
18.权利要求12到17任一项的组合物，其中维生素C占该组合物的总重量的1到15重量％。
19.可由权利要求12到18任一项的组合物获得的药物组合物。
20.包含权利要求19的药物组合物连同药用赋形剂的片剂。
21.片剂制剂，包含·维生素C，·维生素E，·白茶提取物，·大豆提取物，·软骨提取物，·葡萄籽提取物，·番茄提取物，·葡萄糖酸锌和·药用赋形剂。
22.权利要求21的片剂制剂，进一步包含洋甘菊提取物。
全文摘要
本申请公开了用于治疗皮肤衰老的征兆、包括维生素E、维生素C和白茶提取物的组合物。该组合物减轻了皱纹的征兆，并改善了其它皮肤状况，例如提高了皮肤的弹性和皮肤柔软度。此外，不健康的皮肤，例如老化的皮肤或阳光曝晒过度的皮肤的预防或治疗可以通过本发明的组合物的给药实现。该组合物包括许多不同组分的混合物，其相互作用来提供想要的对皮肤的改善。该组合物的进一步有益的组分可包含从例如葡萄籽和番茄中提取的天然存在的抗氧化剂、包含糖胺聚糖的提取物、能结合胶原蛋白和弹性纤维并使皮肤变厚的有效量的过渡金属组分、以及足以抑制皮肤中抗胶原酶的存在量的基于儿茶素的组分。
文档编号A61K36/82GK101026965SQ200580028276
公开日2007年8月29日 申请日期2005年6月24日 优先权日2004年6月25日
发明者安妮贝丝·希欧·延森, 安内特·斯特拉乌普·克里斯滕森, 亨里克·恩胡森·波尔森, 亚娜·维卡诺瓦, 尼科·斯米特 申请人:费诺森股份有限公司