专利名称：截短的lhrh制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含截短形式的LHRH与T辅助细胞表位的肽。这些制剂可用于在动物体内增加针对LHRH的抗体。
背景技术：
任何能诱导有效抗体应答的肽必须含有被免疫系统识别的特定氨基酸序列，称为表位。尤其是在抗体应答时，表位需要被B淋巴细胞表面的特异免疫球蛋白(Ig)受体所识别。这些细胞最终分化为浆细胞，其能够产生特异于该表位的抗体。除这些B细胞表位以外，免疫原还必须含有被抗原呈递细胞(APC)呈递给辅助性T淋巴细胞上存在的特异受体的表位，辅助T细胞对于提供B细胞分化为抗体生成细胞所需的信号是必需的。
病毒感染及多种癌症的情况下，抗体对于机体恢复的作用有限，此时免疫系统以杀伤性T细胞(CTL)进行应答，CTL能杀死病毒感染细胞或癌细胞。与辅助性T细胞相似，CTL首先通过与表面上携带特异性肽表位的APC相互作用而被激活，此时CTL与MHC I类分子而不是MHC II类分子相结合。CTL一旦被激活即可结合带有相同肽/I类复合物的靶细胞，导致其裂解。显然，辅助性T细胞在此过程中发挥了作用；APC激活CTL前必须首先从辅助性T细胞接受信号，以上调所需共刺激分子的表达。
辅助性T细胞表位与APC表面存在的、由主要组织相容性复合物(MHC)的II类基因编码的分子相结合。II类分子与肽表位的复合物随后被T辅助淋巴细胞表面的特异性T细胞受体(TCR)所识别。这样，通过MHC分子中的抗原表位呈递，激活了T细胞，提供了B淋巴细胞分化所需信号。传统上，肽免疫原的辅助性T细胞表位的来源是肽共价偶联的载体蛋白，但这种偶联过程可能引入其它问题，如偶联过程中抗原决定簇的修饰和诱导产生针对载体的抗体而减少针对肽的抗体(Schutze，M.P.，Leclerc，C.Jolivet，M.Audibert，F.Chedid，L.Carrier-induced epitopic suppression，a major issue for future syntheticvaccines.J Immunol.1985，135，23 19-2322；Dijohn，D.，Torresi，J.R.Murillo，J.Herrington，D.A.et al.Effect of priming with carrier onresponse to conjugate vaccine.The Lancet.1989，2，1415-1416)。此外，在制备过程中使用无关蛋白会引入质量控制的问题。选择适当的载体蛋白对于肽疫苗的设计非常重要，这一选择受到如毒性和大规模生产可行性等因素限制。这种方法的其它限制因素还包括可被偶联的肽负载(peptide load)的大小及可以安全施用的载体剂量(Audibert，F.a.C，L.1984.Modern approaches to vaccines.Molecular and chemical basisof virus virulence and immunogenicity.，Cold Spring Harbor Laboratory，New York.)。尽管载体分子可以诱导强烈的免疫应答，但同样会导致不良反应，例如抗肽抗体应答的抑制(Herzenberg，L.A.and Tokuhisa，T.1980.Carrier-priming leads to hapten-specific suppression.Nature 285664；Schutze，M.P.，Leclerc，C，JOLIVET，M.，Audibert，F.，and Chedid，L.1985.Carrier-induced epitopic suppression，a major issue for futuresynthetic vaccines.J Immunol 1352319；Etlinger，H.Mv Felix，A.M.，Gillessen，D.，Heimer，E.P.，JUST，M.，Pink，J.R.，Sinigaglia，F.，Sturchler，D.，Takacs，B.，Trzeciak，A.，1988.Assessment in humans of asynthetic peptide-based vaccine against the sporozoite stage of the humanmalaria parasite，Plasmodium falciparum.J Immunol 140626)。
总之，免疫原除了被表面Ig或杀伤性T细胞受体所识别的表位外，还必须含有能被辅助性T细胞识别的表位。应认识到这些类型的表位可能千差万别。对于B细胞表位，由于B细胞受体直接结合天然免疫原，因此构象非常重要。相反，T细胞识别的表位则不依赖于表位的构象完整性，且对于CTL，所述表位由大约9个氨基酸的短序列组成，而对于辅助性T细胞，其由稍长的序列组成，对长度的限制较小。对这些表位的唯一要求是它们分别能被I类或II类分子的结合槽(binding cleft)容纳，并且复合物能与T细胞受体结合。II类分子的结合位点在两端是开放的，从而允许被结合的肽的长度变动较大(Brown，J.H.，T.S.Jardetzky，J.C.Gorga，L.J.Stern，R.G.Urban，J.L.Strominger and D.C.Wiley.1993.Three-dimensional structure of thehuman class II histocompatibility antigen HLA-DR1.Nature 36433)，据报道，表位可短至8个氨基酸残基(Fahrer，A.M.，Geysen，H.M.，White，D.O.，Jackson，D.C.and Brown，L.E.Analysis of the requirements forclass II-restricted T-cell recognition of a single determinant revealsconsiderable diversity in the T-cell response and degeneracy of peptidebinding to I-ED J.Immunol.1995.1552849-2857)。
LHRH(促黄体生成素释放激素)是一种10个氨基酸长的肽激素，其序列在哺乳动物中是保守的。其序列如下pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH1 2 34 5 6 7 8 9 10LHRH由下丘脑分泌，控制雄性和雌性的生殖生理。基于LHRH的免疫避孕疫苗开发原理以如下观测为依据，即在哺乳动物中，抗LHRH抗体可阻断所述激素对黄体生成素和促卵泡激素的垂体分泌的作用，导致性腺萎缩与不孕不育。
目前开发的大多数LHRH疫苗由化学缀合于蛋白质载体的LHRH组成，以提供给T细胞辅助产生抗LHRH抗体。已经示出经LHRH-蛋白质载体缀合物的重复接种后，由于已知的“载体诱导的表位抑制”现象，抗LHRH抗体滴度降低。
WO 88/05308是一个已公开的将LHRH及其片段与如血清白蛋白和卵清蛋白的大蛋白质载体连接的例子。
发明简述发明人发现特定的截短形式的LHRH即LHRH4-10(SYGLRPG)，其与包括T辅助细胞表位在内的相对较小的肽连接，对于产生抗LHRH应答特别有效。
第一方面，本发明提供了包括第一区域和第二区域的肽，第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成。
第二方面，本发明提供了包含肽和可接受载体的组合物，所述肽包含第一区域和第二区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成。
第三方面，本发明提供了脂肽，所述脂肽包含第一区域、第二区域和第三区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成，第三区域包含脂质部分，其中第二与第三区域共价偶联于第一区域。
第四方面，本发明提供了在动物中产生抗LHRH应答的方法，该方法包括给动物施用本发明第一方面的肽、第二方面的组合物或第三方面的脂肽。
第五方面，本发明提供了本发明第一方面的肽或第三方面的脂肽在制备用于诱导动物抗LHRH应答的药物中的应用。
附图简述
图1用LHRH(2-10)或LHRH(6-10)接种后，动物的抗LHRH抗体滴度。
图2用LHRH(2-10)或LHRH(6-10)接种后，犬的睾酮水平。
图3用LHRH(2-10)或LHRH(6-10)接种后，犬的孕酮水平。
图4不同初始免疫与加强免疫诱导的抗LHRH抗体滴度。
图5第1组睾酮水平LHRH(6-10)初始，LHRH(6-10)加强。
图6第1组孕酮水平LHRH(6-10)初始，LHRH(6-10)加强。
图7第2组睾酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(2-10)加强。
图8第2组孕酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(2-10)加强。
图9第3组睾酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(6-10)加强。
图10第3组孕酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(6-10)加强。
图11LHRH(6-10)与LHRH(4-10)诱导的抗LHRH抗体滴度。
图12用LHRH(6-10)接种后的睾酮水平。
图13用LHRH(6-10)接种后的孕酮水平。
图14用LHRH(4-10)接种后的睾酮水平。
图15用LHRH(4-10)接种后的孕酮水平。
图16用LHRH(4-10)与LHRH(6-10)接种后的睾丸体积。
图17用LHRH(4-10)和LHRH(6-10)接种后的睾丸体积。
图18通过噬菌体淘选实验得到的含LHRH相关基序的肽序列。
发明详述发明人发现特定的截短形式的LHRH即LHRH4-10，其与包括T辅助细胞表位在内的相对较小的肽连接，对于产生抗LHRH应答特别有效。
第一方面，本发明提供了包含第一区域和第二区域的肽，第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成。
第二方面，本发明提供了包含肽和可接受载体的组合物，所述肽包含第一区域和第二区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成。
第三方面，本发明提供了脂肽，所述脂肽包含第一区域、第二区域和第三区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成，第三区域包含脂质部分，其中第二与第三区域共价偶联于第一区域。
第四方面，本发明提供了在动物中产生抗LHRH应答的方法，该方法包括给动物施用本发明第一方面的肽、第二方面的组合物或第三方面的脂肽。
第五方面，本发明提供了本发明第一方面的肽或第三方面的脂肽在制备用于诱导动物抗LHRH应答的药物中的应用。
在一个优选实施方案中，第一区域的C端由少于40个氨基酸、优选少于20个氨基酸组成。
在另一优选实施方案中，第一区域包含1个、2个或3个T辅助细胞表位，优选一个T辅助细胞表位。
在另一优选实施方案中，第一区域的C端残基与第二区域的N端残基连接。
在进一步的优选实施方案中，每个T辅助细胞表位选自如下一组SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA；GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其组合。
在另一优选实施方案中，所述肽含有选自如下一种的序列QPSTELEETRTSRARHSSYGLRPG，TRSRKQTSHRLKNIPVHSYGLRPG，SHQYLVIKLIPNASLIESYGLRPG，KLIPNASLIENCTKAELSYGLRPG，AELGEYEKLLNSVLEPISYGLRPG，TAAQITAGIALHQSNLNSYGLRPG及PRYIATNGYLISNFDESSYGLRPG。
本发明可能用到的T辅助细胞表位的进一步信息见WO00/46390，其内容以交叉引用的方式并入本文中。
如前所述，本发明第二方面的组合物包含可接受的载体。优选该载体是佐剂。
可接受的载体或稀释剂在适于口服、直肠、鼻饲、局部(包括口腔与舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内及硬膜外)给药的组合物中所用的那些。其在使用的剂量与浓度下对于受者是无毒的。
药学上可接受的载体或稀释剂的代表例子包括但不限于水、优选在生理pH值且具有缓冲能力的等渗溶液(例如磷酸盐缓冲生理盐水或Tris缓冲生理盐水)，该等渗溶液还可含有甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、乙醇或多肽(例如人血清白蛋白)中的一种或多种。组合物能够方便地制成单位剂量形式，并且可以采用制药领域中的任何熟知方法进行制备。
如前所述，优选组合物包括佐剂。“佐剂”是一种组合物，其包含一或多种能够加强疫苗组合物的免疫原性和效力的物质。适当的佐剂的非限制性例子包括角鲨烷和角鲨烯(或其它动物源性油)；嵌段共聚物；去污剂，如Tween-80等；QUILA，矿物油，如Drakeol或Marcol，植物油，如花生油；棒状杆菌衍生(Corynebacterium-derived)佐剂，如小棒杆菌(Corynebacterium parvum)等；丙酸杆菌衍生(Propionibacterium-derived)的佐剂，如疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)等；牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(卡介苗，BCG)；白细胞介素，如白细胞介素2和白细胞介素12；单核因子，如白细胞介素1；肿瘤坏死因子；干扰素，如γ-干扰素；如皂苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝等组合；脂质体；ISCOM佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成糖肽，如胞壁酰二肽或其它衍生物；阿夫立定(Avridine)；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或其与磷酸铝；羧聚乙烯，如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳液，如NeocrylA640(例如美国专利号5,047,238)；牛痘或动物痘病毒蛋白；亚病毒颗粒佐剂，如霍乱毒素，或上述物质的混合物。
可通过多种方式制备本发明的肽，但优选采用本领域熟知方法合成生产。例如，可采用溶液合成或固相合成法合成肽，例如BlackwellScientific Publications出版、Nicholson编辑的“Peptide Synthesis”中Atherton和Sheppard的第9章“Peptide Synthesis”中所述。优选采用固相支持物，其可以是聚苯乙烯凝胶珠，其中聚苯乙烯与少量二乙烯基苯(例如1％)交联，然后被亲脂性溶剂如二氯甲烷或更极性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)等溶胀。可采用氯甲基或氨甲基基团对聚苯乙烯进行功能化。或者，使用交联的和功能化的聚二甲基-丙烯酰胺凝胶，该凝胶可被DMF及其它双极性非质子溶剂高度溶剂化与溶胀。也可以使用其它基于聚乙二醇的支持物，聚乙二醇常接枝或以其它方式附着于惰性聚苯乙烯珠的表面。在一个优选形式中，可使用商购的固相支持物或选自PAL-PEG-PS、PAC-PEG-PS、KA、KR或TGR的树脂。
固相合成时，使用具有双重功能的可逆性保护基团，它们既能阻断α-氨基、羧基或侧链功能基团的非所需的反应性，又能破坏氨基酸和肽的双极性特征，使其失活。这种功能性基团可选自具有RCO-OCMe3结构的叔丁酯。也可使用具有RCO-OCH2-C6H5结构的相应苄酯和具有已知为苄氧羰基或Z-衍生物的C6H5CH2OCO-NHR结构的氨基甲酸酯以及已知为叔丁氧羰基或Boc衍生物的任何Me3-COCO-NHR。还可使用芴甲醇特别是芴甲氧羰基或Fmoc基团的衍生物。这些类型的保护基团的每一种在存在另一种时都可以独立地被裂解，因此常采用例如BOC-苄基与Fmoc-叔丁基保护策略。
连接被保护氨基酸或肽的氨基或羧基还可能用到缩合剂。这可通过活化羧基实现，使其自发与游离伯胺或仲胺反应。为此，可以使用活化的酯，如衍生自对硝基苯酚与五氟苯酚的那些。加入催化剂如1-羟基苯并三唑可增加其反应性。也可使用三嗪DHBT的酯类(前述Nicholson参考文献215-216页对此进行了讨论)。用缩合剂处理羧酸(即N端α-保护的氨基酸或肽)可在原位形成其它酰化组分(acylatingspecies)，并立即与氨基成分(羧基或C端保护的氨基酸或肽)反应。常用的缩合剂是二环己基碳二亚胺、BOP试剂(见Nicholson参考文献216页)、O’苯并三唑-N，N，N′N′-四甲基脲六氟磷酸酯(O’Benzotriazole-N，N，N′，N′-tetra methyl-uronium hexafluorophosphate，HBTU)及其类似物四氟硼酸酯。
以任何适当方式利用BOC-氨基酸可进行起始氨基酸与固相支持物的附着。一个方法中，通过对树脂和三乙铵盐进行加温可将BOC氨基酸附着于氯甲基树脂。以相似方式，还可将Fmoc-氨基酸偶联于对烷氧苄醇树脂。或者，使用多种连接剂或“支臂(handle)”将初识氨基酸结合于树脂。在这方面，可以使用与氨甲基聚苯乙烯连接的对羟甲基苯乙酸。
如第三方面所述，本发明提供了脂肽。所述脂肽优选是“分枝”结构，其它关于脂肽的详细信息可见于WO 04/014956和WO04/014957，其内容以交叉引用的方式并入本文中。或者，可将脂质部分简单地附着到肽的N端。
第三方面，本发明提供了脂肽，所述脂肽包含第一区域、第二区域和第三区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，第二区域由SYGLRPG序列组成，第三区域含有脂质部分，其中第二与第三区域共价偶联于第一区域。
在一个优选实施方案中，所述第一区域由少于40个、优选少于20个氨基酸组成。在另一优选实施方案中，所述第一区域包含1个、2个或3个T辅助细胞表位，优选包含一个T辅助细胞表位。
在另一优选实施方案中，所述脂质部分与第一区域的C端偶联。另外，优选第一区域的C端残基与所述第二区域的N端残基连接。
在另一优选实施方案中，所述第一区域的C端残基是赖氨酸或其类似物，脂质部分与ε-氨基连接，第二区域与羧基连接。或者，可将赖氨酸或其类似物通过其ε-氨基与第一区域的其余部分连接，脂质部分与α-氨基连接，第二区域与羧基连接。
赖氨酸类似物的例子包括鸟氨酸、二氨基丙酸和二氨基丁酸。
在另一优选实施方案中，T辅助细胞表位选自以下一组SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA；GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其组合。
优选脂肽第一区域的序列选自如下一组QPSTELEETRTSRARHSK，TRSRKQTSHRLKNIPVHK，SHQYLVIKLIPNASLIEK，KLIPNASLIENCTKAELK，AELGEYEKLLNSVLEPIK，TAAQITAGIALHQSNLNK及PRYIATNGYLISNFDESK。
优选脂质部分是脂氨基酸部分，并且优选选自如下一组Pam2Cys，Pam3CyS，Ste2Cys，Lau2CyS，Oct2Cys，Pam2Asp，Pam3Asp，Ste2Asp，Lau2Asp，及Oct2Asp，最优选Pam2CyS或Pam3Cys。
对于本领域技术人士已知Pam3Cys也已知为N-棕榈酰-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸；Pam2CyS也已知为二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸；Ste2Cys也已知为S-[2，3-二(硬脂酰基氧基)丙基]半胱氨酸或二硬脂酰-S-甘油基-半胱氨酸；Lau2CyS也已知为S-[2，3-二(月桂酰基氧基)丙基]半胱氨酸或二月桂酰-S-甘油基-半胱氨酸；Oct2Cys也已知为S-[2，3-二(辛酰基氧基)丙基]半胱氨酸或二辛酰基-S-甘油基-半胱氨酸。
在优选实施方案中，脂质部分通过间隔区与第一区域连接。间隔区优选包含精氨酸或丝氨酸二聚体、三聚体或四聚体等。或者，可采用6-氨基己酸间隔区。
本说明书中术语“包含”应理解为包括所述元件、整数、步骤或者元件组、整数组或步骤组，但并不排除任何其它元件、整数、步骤或者元件组、整数组或步骤组。
本说明书中提到的所有出版物均并入本文中。关于本说明书所包括的文件、法条、材料、设备、文献等的任何讨论仅用于提供本发明背景资料的目的。应理解并不表示承认这些内容中的全部或任意部分形成了部分现有技术基础，也不表示它们是与本发明相关领域中的普遍技术知识，因为其在本申请每项权利要求的优先权日期之前存在于澳大利亚或其他地方。
本领域专业人士了解在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可对如具体实施例所示的本发明进行多种改变和/或修改。因此，本发明实施方案在所有方面都应被认为是说明性的，而不是限制性的。
为了使本发明的性质可以被更清楚的理解，将参照以下实施例对其优选形式进行描述。
实施例肽整合了不同LHRH片段和T辅助细胞表位的肽采用标准技术合成。
这些肽的每一种都包括了一个WO 00/46390中所揭示的T辅助细胞表位。这些T辅助细胞表位的序列如下
实施例1各组犬接受总共5n摩尔由偶联于LHRH(2-10)的P25、P35和P62组成的混合肽作为第一剂。作为第二剂和第三剂，一组犬接受相同的疫苗，而第二组接受仅由偶联于LHRH(6-10)的P25组成的疫苗。犬在0、4、14周接受三剂疫苗。
疫苗制备称取每种肽1至1.5mg，分别溶于100ul的4M尿素中。将相当于1.7n摩尔的每种肽的溶液混合并用等渗生理盐水稀释至用于注射的规定剂量体积(每剂1ml)。向每剂中加入150ug的Iscomatrix·(CSL，Melbourne，Australia)作为佐剂。将疫苗给予犬的颈背部。
测得的抗体滴度见图1。同时睾酮和孕酮水平分别见图2和图3。
实施例2接种方案将比格犬(Beagle)/猎狐犬(foxhound)分成三组。一组(12只犬)接受三剂5n摩尔的总肽，总肽由偶联于LHRH(6-10)的p25、p35和p62肽的混合物组成。
第二组(6只犬)接受三剂5n摩尔的总肽，总肽由偶联于LHRH(2-10)的p25、p35和p62肽的混合物组成。
第三组(6只犬)接受三剂5n摩尔的总肽，总肽由偶联于LHRH(2-10)的p25、p35和p62肽的混合物组成，作为第一剂。第二剂和第三剂，疫苗由与LHRH(6-10)偶联的相同肽的混合物组成。
犬分别在0、4、14周接受三剂疫苗。
疫苗制备称取每种肽1至1.5mg，分别溶于100ul的4M尿素中。将相当于1.7n摩尔的每种肽的溶液混合并用等渗生理盐水稀释至用于注射的规定剂量体积(每剂1ml)。向每剂中加入150ug的Iscomatrix·(CSL，Melbourne，Australia)作为佐剂。将疫苗给予犬颈背部实验结果见图4至图10。
第二剂疫苗之后，无论是由LHRH(2-10)还是由LHRH(6-10)所引发的抗体，其滴度几乎没有显著差别。接种方案看上去也没有产生差别，即无论其施用顺序是LHRH(2-10)[初始剂量]，继而LHRH(2-10)[加强]；还是LHRH(2-10)[初始]，继而LHRH(6-10)[加强]；还是LHRH(6-10)[初始]，继而LHRH(6-10)[加强]。而初次抗体应答的滴度出现了差别，以LHRH(2-10)-LHRH(6-10)示出最低的滴度。对于睾酮和孕酮，接种两剂LHRH(6-10)的较大部分动物中观察到了某些差别，显示较低水平的睾酮和孕酮。
实施例3接种方案将比格犬/猎狐犬分成两组。第一组(15只犬)接受三剂35n摩尔的总肽，总肽由偶联于LHRH(6-10)的p4、p10、p24、p25、p27、p35和p62肽的混合物组成。
第二组(15只犬)接受三剂35n摩尔的总肽，总肽由偶联于LHRH(4-10)的p4、p10、p24、p25、p27、p35和p62肽的混合物组成。
犬分别在0、4、14周接受三剂疫苗。
疫苗制备称取每种肽1至1.5mg，分别溶于100ul的4M尿素中。将相当于5n摩尔每种肽的溶液混合并用等渗生理盐水稀释至用于注射的规定剂量体积(每剂1ml)。向每剂中加入150ug的Iscomatrix·(CSL，Melbourne，Australia)作为佐剂。将疫苗给予犬颈背部。
实验结果见图11至图17。
接种LHRH(4-10)的动物具有更高的抗体滴度。而且LHRH(4-10)似乎诱导对睾酮和孕酮水平具有更显著作用的抗体；与接种LHRH(6-10)动物不同，接种LHRH(4-10)时动物均未表现出激素突破点(hormone breakthrough)。
实施例4通过噬菌体淘选实验得到的含LHRH-相关基序的肽序列。
使用抗P25-LHRH(2-10)抗体和酸洗脱夜，淘选获得如图18所示的肽序列。在三轮淘选的每一轮后、没有进行ELISA筛选前，随机挑取总共20个噬菌体克隆进行序列分析。高亮的氨基酸残基为与P25-LHRH(2-10)序列相同的氨基酸残基。PCR/测序成功的克隆总数中的相关序列基序总数显示在阴影框内，括号内为百分比。例如“4/20(20％)”表示在20个成功测序的克隆中有4个克隆含有LHRH-相关基序，占第一次淘选后所分析克隆的20％。
上述结果显示，使用较大的LHRH片段倾向于产生针对所述序列C末端的抗体应答。
本领域技术人士了解在不偏离本发明所述的精神或范围的前提下，可对特异实施方案所示的本发明进行多种变化和/或修饰。因此，本发明实施方案在所有方面都应被认为是说明性的，而不是限制性的。
权利要求
1.一种肽，其包含第一和第二区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包括至少一个T辅助细胞表位，所述第二区域由SYGLRPG序列组成。
2.权利要求1的肽，其中所述第一区域由少于40个、优选少于20个的氨基酸组成。
3.权利要求1的肽，其中所述第一区域包含1个、2个、或3个T辅助细胞表位，优选包含1个T辅助细胞表位。
4.权利要求1至3中任一项的肽，其中所述第一区域的C末端残基与所述第二区域的N末端残基连接。
5.权利要求1至4中任一项的肽，其中T辅助细胞表位选自如下一组SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA； GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其组合。
6.权利要求1至5中任一项的肽，其中所述肽具有选自如下一组的序列QPSTELEETRTSRARHSSYGLRPG，TRSRKQTSHRLKNIPVHSYGLRPG，SHQYLVIKLIPNASLIESYGLRPG，KLIPNASLIENCTKAELSYGLRPG，AELGEYEKLLNSVLEPISYGLRPG，TAAQITAGIALHQSNLNSYGLRPG及PRYIATNGYLISNFDESSYGLRPG。
7.一种组合物，其包含权利要求1至7中任一项的肽和可接受的载体。
8.权利要求7的组合物，其中所述载体是佐剂。
9.一种脂肽，所述脂肽包含第一区域、第二区域和第三区域，所述第一区域由少于60个氨基酸的序列组成，其包含至少一个T辅助细胞表位，所述第二区域由SYGLRPG序列组成，所述第三区域包含脂质部分，其中第二与第三区域共价偶联于第一区域。
10.权利要求9的脂肽，其中所述第一区域由少于40个、优选少于20个的氨基酸组成。
11.权利要求9的脂肽，其中所述第一区域包含1个、2个或3个T辅助细胞表位，优选包含1个T辅助细胞表位。
12.权利要求9到11中任一项的脂肽，其中所述第一区域的C末端残基与所述第二区域的N末端残基连接。
13.权利要求9到12中任一项的脂肽，其中所述脂质部分与所述第一区域的C末端残基偶联。
14.权利要求9到13中任一项的脂肽，其中所述第一区域的C末端残基为赖氨酸或其类似物，所述脂质部分与ε-氨基连接，所述第二区域与羧基连接。
15.权利要求9到13中任一项的脂肽，其中所述第一区域的C末端残基为赖氨酸或者其类似物，并且该赖氨酸或者其类似物通过其ε-氨基与所述第一区域的其余部分连接，所述脂质部分与α-氨基连接，所述第二区域与羧基连接。
16.权利要求14到15的脂肽，其中所述赖氨酸类似物是鸟氨酸、二氨基丙酸或二氨基丁酸。
17.权利要求9到11中任一项的脂肽，其中所述脂质部分与所述第一区域的N末端残基偶联。
18.权利要求9到17中任一项的脂肽，其中T辅助细胞表位选自如下一组SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA； GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其组合。
19.权利要求9到18中任一项的脂肽，其中所述第一区域的序列选自如下一组QPSTELEETRTSRARHSK，TRSRKQTSHRLKNIPVHK，SHQYLVIKLIPNASLIEK，KLIPNASLIENCTKAELK，AELGEYEKLLNSVLEPIK，TAAQITAGIALHQSNLNK及PRYIATNGYLISNFDESK。
20.权利要求9到19中任一项的脂肽，其中所述脂质部分是脂氨基酸部分。
21.权利要求20的脂肽，其中所述脂氨基酸部分选自如下一组Pam2CyS，Pam3CyS，Ste2Cys，Lau2CyS，Oct2Cys，Pam2Asp，Pam3Asp，Ste2Asp，Lau2Asp及Oct2Asp。
22.权利要求21的脂肽，其中所述脂质部分为Pam2Cys或Pam3Cys。
23.权利要求9到22中任一项的脂肽，其中所述脂质部分通过间隔区与所述第一区域连接。
24.权利要求21的脂肽，其中所述间隔区包含精氨酸或丝氨酸二聚体、三聚体或四聚体。
25.权利要求21的脂肽，其中所述间隔区包含6-氨基己酸。
26.诱导动物产生抗LHRH应答的方法，该方法包括给动物施用权利要求1到6中任一项所述的肽、权利要求7或8的组合物或者权利要求9到25中任一项所述的脂肽。
27.权利要求1到6中任一项所述的肽或者权利要求9到25中任一项所述的脂肽在制备用于诱导动物抗LHRH应答的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了用于提高动物抗LHRH应答的肽。所述肽包含第一和第二区域，所述第一区域由包含至少一个T辅助细胞表位的少于60个氨基酸的序列组成，所述第二区域由序列SYGLRPG组成。
文档编号A61P15/18GK101084239SQ200580038373
公开日2007年12月5日 申请日期2005年9月12日 优先权日2004年9月10日
发明者戴维·查尔斯·杰克逊, 约翰·沃克, 曾伟光 申请人:昆士兰医学研究所理事会(Qimr)