专利名称：沙眼衣原体e型dna疫苗及制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是涉及一种沙眼衣原体E型DNA疫苗及其制备方法与用途。
背景技术：
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，C.t)曾引起世界范围沙眼的广泛流行，造成严重危害，迄今仍是一些发展中国家致盲的首要原因。80年代中期，又成为性传播感染的主要病原菌，发病率居性传播感染的首位。近年来由沙眼衣原体引起的性传播感染的发病率正迅速上升。更为严重的是C.t感染常常症状轻微甚至没有症状，不能引起人们的足够注意，不能及时地被诊断和治疗，持续存在数月甚至数年，最终引起盆腔炎、不孕症、异位妊娠、附睾炎等一系列比较严重的并发症和后遗症，还可以造成垂直传播，引起新生儿围产期感染。此外耐药C.t株的报道不断出现，相当一部分C.t感染对治疗不敏感，治疗后容易复发，同时还存在着相当高的C.t再感染率，因此预防C.t感染尤为重要，控制C.t传播和流行的根本措施就在于预防。人们一直在孜孜不倦的寻求一种有效的疫苗希望能够从根本上预防和控制C.t的感染。
C.t疫苗分为蛋白或多肽疫苗和核酸疫苗两类。前一种疫苗曾为全菌疫苗、亚单位疫苗和合成的多肽疫苗，由于这类疫苗所激发的机体特异性免疫反应较弱而短暂，因而不足以预防C.t的再感染；近年来新兴的核酸疫苗所表现出来的其他类疫苗不可比拟的优越性为C.t的预防开拓了一个最有希望的领域。
C.t种共有三个生物变种，分别是沙眼生物变种、LGV生物变种和鼠生物变种。沙眼生物变种中的A～C型引起沙眼，D～K型引起泌尿生殖道感染；性病性淋巴肉芽肿生物变种的L1～L3型导致性病性淋巴肉芽肿；鼠生物变种中的鼠肺炎株主要引起鼠的感染，不侵袭人类。
C.t DNA疫苗的研究已有十余年时间，绝大多数是选择C.t种中的鼠肺炎株(MoPn)去感染小鼠呼吸道的动物模型来研究DNA疫苗的免疫效果，而引起人类非淋菌性尿道炎的C.t型的DNA疫苗研究只见到一篇报道。该文章构建了C.t D型DNA疫苗，免疫小鼠后通过血清抗体检测、脾淋巴细胞增殖试验和脾细胞培养上清液中γ-干扰素的水平来评价DNA疫苗的免疫效果，结果证实能刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。但很多资料显示，泌尿生殖道感染的C.t以E型最多，即E型是感染的优势型，由于C.t感染产生的保护作用是“型特异性”的，因此C.t D型的DNA疫苗对C.t E型感染的保护作用不强。
发明内容本发明的目的旨在为克服现有技术的缺陷，选择C.t E型这个优势型作为研究对象，提供一种沙眼衣原体E型DNA疫苗及其制备方法与用途。本发明通过实验研究证实，所构建的C.t E型DNA疫苗切实的免疫效果和保护作用，为C.t DNA疫苗的深入研究和应用奠定基础，具有重要的科研和临床价值。
为实现本发明的目的，本发明公开了一种沙眼衣原体E型DNA疫苗，其特征在于包括沙眼衣原体E型ompl基因和真核表达载体，ompl基因编码产物是沙眼衣原体主要外膜蛋白，所说的ompl基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所说的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。
本发明还公开了一种制备所述沙眼衣原体E型DNA疫苗的方法，其特征在于从沙眼衣原体E型BOUR株中提取染色体DNA，PCR扩增出编码主要外膜蛋白的ompl基因，克隆到pcDNA3.1(+)载体质粒中构建成沙眼衣原体DNA疫苗。其目的基因的5′端从BamHI位点插入，目的基因的3′端从NotI位点插入。
本发明所述沙眼衣原体E型DNA疫苗，用于制备预防和治疗泌尿生殖道沙眼衣原体感染性疾病的疫苗。
本发明基于现有技术的研究基础，选择C.t E型这个优势型作为研究对象，构建沙眼衣原体E型DNA疫苗，通过一系列动物实验证实该DNA疫苗能够刺激动物机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，对沙眼衣原体E型的生殖道感染具有保护作用。通过肌肉注射的方式免疫，能够有效激发体液免疫和细胞免疫，具有免疫过程简单、接种安全、效果明显、可重复性强等优点。
图1C.t E型DNA疫苗结构模式2C.t E型完整ompl基因的扩增；图3ompl基因的双酶切；图4pcDNA3.1(+)质粒的双酶切；图5ompl-pcDNA3.1(+)重组质粒双酶切电泳鉴定；图6ompl-pcDNA3.1(+)重组质粒PCR扩增鉴定。
具体实施方式本发明从沙眼衣原体E型BOUR株染色体基因中克隆出编码主要外膜蛋白的ompl基因，并将它定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建出DNA疫苗插入的外源沙眼衣原体E型ompl基因结构描述如下(1)序列特征长度1182bp类型核酸链数双链几何结构线性(2)分子类型DNA(3)沙眼衣原体E型BOUR株(Trachoma type E strain BOUR)，购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，商品编号VR-348BTM。
(4)ompl基因的核苷酸序列描述如下atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg60caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg120gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg180cgtatgggtt actatggtga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaacaga tgtgaataaa240
gaattccaaa tgggtgacaa gcctacaagt actacaggca atgctacagc tccaaccact300cttacagcaa gagagaatcc tgcttacggc cgacatatgc aggatgctga gatgtttaca360aatgccgctt gcatggcatt gaatatttgg gatcgctttg atgtattctg tacactagga420gcctctagcg gataccttaa aggaaactct gcttctttca atttagttgg attgtttgga480gataatgaaa atcaaagcac ggtcaaaacg aattctgtac caaatatgag cttagatcaa540tctgttgttg aactttacac agatactgcc ttctcttgga gcgtgggcgc tcgagcagct600ttgtgggagt gcggatgtgc gactttaggg gcttctttcc aatacgctca atctaaacct660aaagtcgaag aattaaacgt tctctgtaac gcagctgagt ttactatcaa taagcctaaa720ggatatgtag ggcaagaatt ccctcttgca ctcatagcag gaactgatgc agcgacgggc780actaaagatg cctctattga ttaccatgag tggcaagcaa gtttagctct ctcttacaga840ttgaatatgt tcactcccta cattggagtt aaatggtctc gagcaagttt tgatgccgat900acgattcgta tagcccagcc aaaatcagct acagctatct ttgatactac cacgcttaac960ccaactattg ctggagctgg cgatgtgaaa gctagcgcag agggtcagct cggagatacc1020atgcaaatcg tctccttgca attgaacaag atgaaatcta gaaaatcttg cggtattgca1080gtaggaacga ctattgtaga tgcagacaaa tacgcagtta cagttgagac tcgcttgatc1140gatgagagag ctgctcacgt aaatgcacaa ttccgcttct aa 1182一、沙眼衣原体E型DNA疫苗的制备和鉴定1.沙眼衣原体E型DNA疫苗的制备①取C.t E型标准株培养阳性并收集的细胞培养物100μl，12000rpm，离心20min，弃上清；沉淀中加入50μl裂解液(含200mg/L蛋白酶K)，振荡混匀后，放入55℃水浴中保温1h；煮沸15min，-20℃储存备用。
②设计ompl基因的扩增引物P1 5’cgggatccatgaaaaaactcttgaaatcgg3’；P2 5’atttgcggccgcttagaagcggaattgtgcat 3’。P1、P2引物扩增的基因片段全长1202碱基对(base pair，bp)，其中包括C.t E型完整的ompl基因1182bp，两个限制性核酸内切酶识别位点共14bp，保护性碱基6bp，PCR反应体系见表1。PCR扩增条件94℃预变性5min；94℃变性50s；62℃退火60s；72℃延伸130s；35个循环后，72℃后延伸10min，使反应完全。取10μl PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳后与Marker对照，在1202bp位置出现清晰特异性条带，与要扩增的目的基因片段大小一致，提示PCR成功，结果见图1，(1、2、7、8道在1202bp处有扩增产物，3、4、5没有扩增产物，6为阴性对照，MDNA Marker IV)。
表1ompl基因PCR扩增体系
③使用限制性核酸内切酶BamHI和NotI切割扩增的ompl基因和pcDNA3.1(+)载体质粒，37℃保温6h。结果显示未酶切的和双酶切的ompl基因电泳速度基本一致，提示ompl基因中间没有BamHI和NotI的酶切位点，见图2(1未酶切ompl基因；2双酶切ompl基因；MDNA 200bp ladder)；双酶切载体后在约5400bp处有清晰的DNA条带，BamHI单酶切和双酶切的质粒电泳速度一致，提示酶切后质粒的环状结构断开成线状，片段与pcDNA3.1(+)载体的理论大小一致，见图3(1未酶切pcDNA3.1(+)质粒；2BamHI单酶切pcDNA3.1(+)质粒；3双酶切pcDNA3.1(+)质粒；MDNA MarkerIV)。将ompl基因和pcDNA3.1(+)载体的双酶切产物分别在1％琼脂糖凝胶中电泳后切下目的片段，按照琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒说明操作，回收双酶切片段，分别溶于20μl蒸馏水中。将上述酶切后回收的ompl基因与pcDNA3.1(+)质粒按大约4∶1的分子比率建立反应体系，16℃反应16～24h，在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应，构建成DNA疫苗。
④氯化钙法将DNA疫苗转化制备感受态E.coli DH5α，此步骤设立两个对照组阳性对照，取10μl(约40ng)pcDNA3.1(+)质粒转化感受态E.coli；阴性对照，不加质粒，代以10μl蒸馏水转化感受态E.coli。结果阳性对照平板与连接转化平板都有菌落生长，而且前者较后者菌落密集，阴性对照平板无菌落生长。
2.C.t E型DNA疫苗的鉴定①酶切鉴定碱裂解法小量提取转化到E.coli DH5α中的重组质粒，BamHI和NotI限制性核酸内切酶进行双酶切，37℃保温过夜，1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示双酶切后ompl-pcDNA3.1(+)重组质粒被切成1.2Kb和5.4Kb两个片段，证明ompl基因插入到了pcDNA3.1(+)质粒内，见图4(1-6重组质粒的双酶切；7pcDNA3.1(+)载体质粒的双酶切；MDNA Marker IV)。
②扩增鉴定以转化后提取的“重组质粒”为模板，用P1、P2引物PCR扩增重组质粒omp1-pcDNA3.1(+)中的ompl基因，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示在约1202bp位置有清晰的扩增产物，产物片段的长度与ompl基因相一致，证实重组质粒中有ompl基因片断插入，见图5(1-7重组质粒的扩增；MDNA Marker IV)。
③基因序列分析经过重组质粒的序列测定分析，结果与Genbank登陆的C.t E型BOUR标准株ompl基因全序列(登陆号X52557)相比较其相似性为99.92％，第489位A被G取代，是同义突变，故氨基酸序列同源性为100％。序列分析结果也显示插入位点处插入的方向和读码框均正确无误。
二、沙眼衣原体E型DNA疫苗的免疫效果1.C.t E型DNA疫苗诱发的免疫应答①BALB/C雌性小鼠随机分为三组pcDNA3.1(+)空质粒免疫组(阴性对照组)、DNA疫苗免疫组和灭活原体免疫组(阳性对照组)。分别于0、2、4周肌内注射pcDNA3.1(+)空质粒150μg/DNA疫苗150μg/灭活原体150μl。
最后一次免疫后2周，所有组的小鼠取静脉血、生殖道分泌物冲洗液、小鼠生殖道脱落上皮、小鼠脾淋巴细胞和小鼠子宫标本。
②Bradford法对纯化的C.t E型原体进行蛋白定量按照蛋白标准的处理方式，取待测样品即灭活后C.t EB液进行系列稀释。根据蛋白标准曲线图计算待测样品三种稀释比例下的蛋白浓度，推算出原液的蛋白浓度，取三者的平均值作为最终的C.t EB原液浓度。
③血清C.t主要外膜蛋白特异性IgG和IgM抗体ELISA检测用20μg/ml的C.t纯化主要外膜蛋白溶液0.1ml包被聚苯乙烯板的反应孔，加入1∶40比例稀释的待检血清0.1ml(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)，37℃温育60min，再加酶标抗体后TMB显色，2M硫酸终止反应，测得各孔的OD450nm值，结果显示DNA疫苗组产生的C.t E型特异性IgG抗体水平高于阴性对照组(p＜0.05)，且灭活原体免疫组的IgG抗体高于DNA疫苗免疫组(p＜0.001)。DNA疫苗组产生的C.t E型特异性IgM抗体水平高于阴性对照组(p＜0.001)，且灭活原体免疫组的IgM抗体水平高于DNA疫苗免疫组(p＜0.001)。
④细胞因子IFN-γ、IL-4检测细胞因子的检测包括小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ和IL-4含量的检测。结果显示，DNA疫苗组血清IFN-γ水平高于阴性对照组(p＜0.05)，且灭活原体免疫组血清IFN-γ水平高于DNA疫苗免疫组(p＜0.001)。DNA疫苗组脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平高于阴性对照组(p＜0.05)，灭活原体免疫组脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平与DNA疫苗免疫组和阴性对照组差异无显著性(p＜0.001)。灭活原体免疫组的血清IL-4水平高于DNA疫苗组和阴性对照组(p＜0.05)，除了DNA疫苗免疫组之外，另两组没有检测到脾淋巴细胞培养上清液中有IL-4的存在。
⑤抗体中和试验用纯化并稀释的C.t E型EB与稀释的血清充分混合，37℃保温1h，用上述混合物感染已长成致密单层的McCoy细胞，48～72h培养后计数形成的包涵体数量。结果显示DNA疫苗组和灭活原体免疫组血清中和C.t EB的能力高于阴性对照组(p＜0.001)。
⑥迟发型超敏反应每组的一半小鼠进行此部分实验。用PBS液将纯化的C.t E型EB稀释后，56℃灭活30min，在小鼠的左后足垫注射25μl稀释的C.t E型EB，右后足垫注射25μl 2SP液做对照，48h测量每只小鼠左右后足垫的厚度，结果显示DNA疫苗组和灭活原体免疫组产生的迟发型超敏反应强于阴性对照组(p＜0.05)。
⑦脾淋巴细胞增殖试验观察DTH反应后，杀鼠取脾，得到浓度2～4×106个/ml小鼠脾淋巴细胞悬液。用2SP液将纯化的C.t E型EB稀释至蛋白浓度为200～300μg/ml，56℃灭活30min。按每孔50μl将脾细胞悬液加入96孔板中，每孔加入细胞培养液200μl，每只小鼠的脾细胞悬液设3个复孔，第一孔加入ConA作阳性对照孔，第二孔加入C.t E型EB液，第三孔不加其他物质作为阴性对照。培养68h，MTT法检测各孔在波长570nm的吸光度，并计算淋巴细胞刺激指数，结果显示DNA疫苗组和灭活原体免疫组的脾淋巴细胞增殖多于阴性对照组(p＜0.001)。
2.C.t E型DNA疫苗免疫同型C.t生殖道攻击的保护作用每组的另一半小鼠进行此部分实验观察。
①C.t E型EB的生殖道攻击约6.6×105IFU C.t E型EB从生殖道感染小鼠，C.t攻击后第6天采集小鼠生殖道脱落细胞，攻击后2周采集小鼠静脉血、生殖道分泌物冲洗液、脾淋巴细胞和小鼠完整子宫标本。
②C.t E型主要外膜蛋白特异性IgG、sIgA抗体检测方法同上，结果显示DNA疫苗组和灭活原体免疫组产生的血清C.t E特异性IgG抗体水平和生殖道局部C.t E特异性sIgA抗体水平均高于阴性对照组(p＜0.001)。
③脾淋巴细胞增殖试验C.t E型EB攻击小鼠生殖道后2周，杀鼠取脾进行脾淋巴细胞增殖试验。结果显示DNA疫苗组的淋巴细胞增殖比ConA刺激孔和阴性对照孔更为显著；灭活原体组和空质粒组各孔的细胞增殖情况较攻击前变化不明显。
④小鼠生殖道C.t培养和计数小鼠生殖道脱落上皮细胞破碎后接种致密单层McCoy细胞，37℃、5％CO2孵箱培养48～72h后，计数各孔中形成的包涵体数量。结果空质粒组小鼠生殖道脱落上皮接种的细胞孔中分别计数到64、18、41、54、38、41个包涵体外，其他各组没有发现包涵体形成，证实DNA疫苗组和灭活原体组三组小鼠下生殖道的C.t均已被清除或者均已经失去感染活性。
⑤子宫组织病理观察采用常规石蜡切片，H-E染色方法。结果取空质粒组小鼠生殖道组织作病理切片，可见在阴道复层鳞状上皮和子宫内膜单层柱状上皮交界处(相当于子宫颈处)的组织部分上皮细胞被破坏，上皮水肿，以中性粒细胞为主的炎症细胞侵入上皮细胞中形成小脓疡，固有层中可见一些中性粒细胞、组织细胞和淋巴细胞浸润，证实C.t的生殖道攻击导致该组小鼠局部组织出现明显的损害。
取DNA疫苗组和灭活原体组小鼠生殖道组织的病理切片，可见在阴道复层鳞状上皮和子宫内膜单层柱状上皮交界处(相当于子宫颈处)的组织完整，没有破坏，固有层中炎性细胞浸润轻微。
应用构建的沙眼衣原体E型DNA疫苗进行了一系列动物实验，结果证实1.实验动物针对C.t ompl基因所编码的主要外膜蛋白产生的抗体是保护性抗体，具有中和能力。
2.构建的C.t E型DNA疫苗免疫小鼠能够诱导产生一定的C.t特异性细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫水平更显著，以Th1反应占优势，对C.tE型生殖道的攻击具有良好的保护作用，发挥了疫苗的效果。
沙眼衣原体E型DNA疫苗ompl基因核苷酸序列表<110>天津医科大学总医院<120>沙眼衣原体E型DNA疫苗及制备方法与用途<160>1<210>1<211>1182<212>DNA<213>沙眼衣原体种(Chlamydia trachomatis)<400>1atgaaaaaac tcttgaaatc ggtattagta tttgccgctt tgagttctgc ttcctccttg60caagctctgc ctgtggggaa tcctgctgaa ccaagcctta tgatcgacgg aattctgtgg120gaaggtttcg gcggagatcc ttgcgatcct tgcaccactt ggtgtgacgc tatcagcatg180cgtatgggtt actatggtga ctttgttttc gaccgtgttt tgaaaacaga tgtgaataaa240gaattccaaa tgggtgacaa gcctacaagt actacaggca atgctacagc tccaaccact300cttacagcaa gagagaatcc tgcttacggc cgacatatgc aggatgctga gatgtttaca360aatgccgctt gcatggcatt gaatatttgg gatcgctttg atgtattctg tacactagga420gcctctagcg gataccttaa aggaaactct gcttctttca atttagttgg attgtttgga480gataatgaaa atcaaagcac ggtcaaaacg aattctgtac caaatatgag cttagatcaa540tctgttgttg aactttacac agatactgcc ttctcttgga gcgtgggcgc tcgagcagct600ttgtgggagt gcggatgtgc gactttaggg gcttctttcc aatacgctca atctaaacct660aaagtcgaag aattaaacgt tctctgtaac gcagctgagt ttactatcaa taagcctaaa720ggatatgtag ggcaagaatt ccctcttgca ctcatagcag gaactgatgc agcgacgggc780actaaagatg cctctattga ttaccatgag tggcaagcaa gtttagctct ctcttacaga840ttgaatatgt tcactcccta cattggagtt aaatggtctc gagcaagttt tgatgccgat900acgattcgta tagcccagcc aaaatcagct acagctatct ttgatactac cacgcttaac960ccaactattg ctggagctgg cgatgtgaaa gctagcgcag agggtcagct cggagatacc1020atgcaaatcg tctccttgca attgaacaag atgaaatcta gaaaatcttg cggtattgca1080gtaggaacga ctattgtaga tgcagacaaa tacgcagtta cagttgagac tcgcttgatc1140gatgagagag ctgctcacgt aaatgcacaa ttccgcttct aa 118权利要求
1.一种沙眼衣原体E型DNA疫苗，其特征在于包括沙眼衣原体E型omp1基因和真核表达载体，omp1基因编码产物是沙眼衣原体主要外膜蛋白。
2.按照权利要求1所述的沙眼衣原体E型DNA疫苗，其特征在于所说的omp1基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.按照权利要求1所述的沙眼衣原体E型DNA疫苗，其特征在于所说的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。
4.一种按照权利要求1所述沙眼衣原体E型DNA疫苗的制备方法，其特征在于从沙眼衣原体E型BOUR株提取染色体DNA，PCR扩增出编码主要外膜蛋白的omp1基因，克隆到pcDNA3.1(+)载体质粒中构建成沙眼衣原体DNA疫苗。
5.按照权利要求4所述的沙眼衣原体E型DNA疫苗的制备方法，其特征在于目的基因的5′端从BamHI位点插入，目的基因的3′端从NotI位点插入。
6.一种按照权利要求1所述沙眼衣原体E型DNA疫苗，用于制备预防和治疗泌尿生殖道沙眼衣原体感染性疾病的疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种沙眼衣原体E型DNA疫苗及制备方法与用途。本发明应用分子克隆等基因工程技术，从沙眼衣原体E型染色体基因中PCR克隆出主要外膜蛋白基因(omp1基因)，与真核表达质粒pcDNA3.1(+)定向连接构建成DNA疫苗。通过动物实验证实，构建的沙眼衣原体E型DNA疫苗免疫小鼠能够诱导小鼠产生一定的沙眼衣原体特异性细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫水平更显著，以Th1反应占优势，对沙眼衣原体E型生殖道的攻击具有保护作用。该疫苗有望改善沙眼衣原体泌尿生殖道感染发病率高、迁延难治、易于复发和耗资巨大的现状。
文档编号A61P15/00GK1943788SQ200610016248
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者刘全忠, 齐蔓莉, 王敬, 陈锦英 申请人:天津医科大学总医院