专利名称：一种治疗慢性宫颈炎的栓剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗慢性宫颈炎的药物，更具体涉及一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，该栓剂为一种含有角质细胞生长因子-2(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)的阴道栓剂。
背景技术：
角质细胞生长因子-2(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)又称成纤维细胞生长因子-10(fibroblast growth factor-10，FGF-10)，是FGF家族成员之一。它由成纤维细胞及其它间质细胞分泌，特异性靶细胞为各种上皮细胞，特异性受体为酪氨酸激酶受体FGFR2 IIIb(KGFR)和FGFR1 IIIb，主要承担间质细胞-上皮细胞之间的信号传递，是调节间质-上皮相互作用的细胞因子。KGF-2特异性促进上皮细胞的增殖分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。能刺激伤口周围上皮细胞的再生、分化和迁移，但对成纤维细胞和内皮细胞则无直接作用。KGF-2在临床上可以用于治疗多种表皮损伤相关疾病，对多种组织、器官，包括皮肤、角膜、肺、呼吸道、胃肠道、头发毛囊、膀胱等的上皮/基质损伤的预防及修复有重要作用，对烧伤、溃疡、切割伤的修复、再生比其它生长因子具有更显著的作用，而且能减少瘢痕的形成，安全性研究也表明它专一作用于人正常上皮，在体内外对人KGFR(+)上皮样肿瘤均无刺激增殖效应。美国人类基因组公司开发的KGF-2注射剂repifermin已进入II期临床试验，开展的项目有静脉溃疡、因癌症治疗诱发的黏膜炎和溃疡性大肠炎，部分实验结果展示了良好的应用前景。目前，KGF-2以其突出的优点越来越受到人们的关注，但KGF-2对慢性宫颈炎的治疗作用尚未见相关的研究报道。
慢性宫颈炎(宫颈糜烂)是子宫颈的慢性炎性损伤性疾病。其致病因素较多，有病毒和细菌的感染、化学物质刺激和机械性损伤等。宫颈糜烂可为真性糜烂、假性糜烂。在慢性子宫颈炎中，宫颈糜烂与宫颈愈复过程反复进行，使得慢性子宫颈炎成为一种难愈性炎症，其机制尚不清楚。目前临床上常采用各种物理治疗，如冷冻、电熨、激光、红外线等，是破坏宫颈糜烂面的柱状上皮，使其坏死脱落，由新生的鳞状上皮覆盖，但存在术后出血、感染、愈合时间长、颈管狭窄形成不育的可能，以及存在对经阴道分娩的影响不良反应多等问题，而且对患者的日常生活也带来了居多不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗慢性宫颈炎的栓剂。一种以KGF-2为有效成份制备的阴道栓剂。配方合理，使用方便，对慢性宫颈炎有很好的抗炎、促进宫颈上皮修复的作用，效果良好，无毒副作用的优点。
本发明是一种以KGF-2为有效成份治疗慢性宫颈炎的阴道栓剂，其具体特征为所述栓剂含有角质细胞生长因子-2(KGF-2)0.01-2％与基质84-94％、稳定剂1-8％、缓冲剂1-4％、保护剂0.5-2％组成。
其中KGF-2重组人角质细胞生长因子-2或人角质细胞生长因子-2∶0.01-2％基质甘油明胶甘油、明胶、水按70∶20∶10比例配置84-94％稳定剂蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖或其他药学上可接受的稳定剂的其中一种或其中混合物1-8％缓冲剂磷酸盐、乌头酸、柠檬酸、戊二酸、乙酸盐、枸橼酸盐其中一种1-4％保护剂人血白蛋白、牛血白蛋白其中一种0.5-2％本发明采用热熔法制备栓剂，其制备方法如下先配置甘油明胶基质，即称取出一定量的明胶，放入等量的纯水中，待其充分溶胀后，置37-40℃水浴中加热溶解，按比例加入甘油，搅拌，蒸去多余的水分，加入稳定剂、缓冲剂、保护剂，搅匀，保持温度在37-40℃，将KGF-2加入，搅匀趁热灌入已灭菌涂有润滑剂的阴道栓模中，冷却，削去模口溢出部分，脱模，密封，得KGF-2栓剂成品。其中甘油明胶基质对KGF-2生物活性有保护作用，基质中甘油、明胶、水的比例是70∶20∶10，必要时可调整其比例。
质量控制所得栓剂为鸭嘴形白色或淡黄色栓剂。
鉴别根据《中国药典》2005年版三部附录VIIIA项用免疫印迹法测定为阳性。
重量差异依照《中国药典》2005年版三部附录IB项下检查，符合规定。
融变时限依照《中国药典》2005年版三部附录VD项下检查，符合规定。
微生物限度依照《中国药典》2005年版三部附录XIIG项下检查，符合规定。
含量测定用HPLC测定KGF-2的含量，色谱条件色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Hypersil C18柱(5μm，4.6mm×20mm，不锈钢柱)；流动相A相三氟乙酸-水溶液取1.0ml三氟乙酸加入超纯水999ml充分混匀，B相三氟乙酸-乙腈溶液取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈999ml，充分混匀；柱温30℃；检测波长280nm；进样量10μL。所有溶剂经0.45μm膜过滤。精密配置KGF-2不同浓度的溶液并制定标准曲线和回归方程，按实施例处方模拟配制KGF-2栓剂，取10枚置水浴微温熔化，混匀，冷至室温，精密称取适量置100ml量瓶，50％乙醇溶解并定容，过滤，取续滤液10μL进样，根据回归方程得KGF-2含量。
回收率试验模拟处方比例，精确制备样品和栓剂，按含量测定项下方法，以外标法测定含量，计算回收率。KGF-2平均回收率为98.3％，RSD 1.51％。
阴道刺激性试验实验方法1.分组取健康、阴道无损家兔8只，按体重随机分为2组，每组4只，分别为KGF-2阴道栓剂组和基质对照组。
2.给药2.1用法用量阴道给药，每日1次，每次一粒。
2.2给药试验时取KGF-2阴道栓和基质各1粒，橄榄油润滑，分别置入供试验组和基质组家兔阴道内。给药后持续观察4小时，发现药物脱落，及时送回。
2.3给药频率每日1次，12天连续给药。
3.观察指标3.1一般观察每天进行一般状况观察，每次给药前观察家兔用药局部红肿、充血症状，给药后4小时持续观察。
3.2病理学检查末次用药后48小时，空气栓塞法处死家兔，将卵巢、子宫连同阴道一并取出。肉眼观察用药局部充血、红肿、渗出、变性等现象，4％中性甲醛固定，常规组织切片，进行病理组织学检查。
结果1.一般观察试验期间未见药物脱落现象。末次给药后48小时，取材组织肉眼未见明显刺激反应症状。
2.显微镜检2.1阴道组织结构正常，宫颈上皮由单层纤毛上皮形成，无炎细胞浸润，试验各组与基质组比较未见明显病理形态变化。
2.2子宫内膜完整光滑，内膜下血管无充血、扩张，亦无明显炎细胞浸润，试验各组与基质组比较无明显差异。
2.3卵巢皮质、髓质清晰，中间质发达，多分布在基质中，试验各组与基质组比较无明显差异。
结果表明本试验条件下，KGF-2阴道栓对家兔阴道粘膜无明显刺激作用。
药效学试验一、KGF-2对白介素1β(IL-1β)诱导大鼠宫颈鳞状上皮细胞炎症的影响实验方法1.细胞分离和培养大鼠宫颈鳞状上皮细胞(RCEC)细胞分离和培养处死大鼠，取宫颈部位的组织剪成1～2mm3的小块，用无菌Hank’s平衡液(含15mmol·L-1HEPES，青霉素100kU·L-1，链霉素100mg·L-1，二性霉素0.25mg·L-1，pH 7.4)洗涤3次，0.1％胶原酶(189kU·L-1)在37℃消化50分钟，然后用0.2％胰蛋白酶37℃消化20分钟，Hank’s平衡液洗涤两次，用生长培养基悬浮，将来自两个动物宫颈的组织接种于60mm培养皿中，在34℃，5％CO2培养箱中培养。生长培养基为A与B(1∶1)两部分组成，A与B成分如下(A)24小时条件培养基DMEM培养基(含10％FBS)培养Swiss 3T3细胞24小时后的培养基；(B)宫颈上皮细胞培养基(cervical epithelial growthmedium，CEGM)由HamF12和RPMI-1640(1∶1)组成，再添加7.5％猪血清、胰岛素(10μg·L-1)、转铁蛋白(10mg·L-1)、氢化可的松(6.5mg·L-1)、霍乱毒素(0.1nmol·L-1)、牛脑提取物(150mg·L-1)。
3天后，弃去培养基，用D-Hanks轻轻漂洗除去组织碎片。然后加入CEGM培养，当细胞达到融合后，先用D-Hanks漂洗1小时，然后加入0.025％胰蛋白酶与0.5mmol·L-1EDTA(1∶1)消化，用CEGM重新悬浮，然后接种到预先铺有胶原凝胶的100mm培养皿上。此二代培养物可以传代，先添加0.1％胶原酶0.005L在34℃孵育直到胶原完全液化(约1小时)，用D-Hanks洗涤细胞悬液，再用0.025％胰蛋白酶与0.5mmol·L-1EDTA(1∶1)在37℃消化10分钟，细胞悬液经洗涤后重新悬浮在CEGM中，接种于预先铺有胶原凝胶的培养板，实验用第2～3代细胞。台盼蓝检测细胞活率大于95％，细胞纯度鉴定采用免疫组化SABC法，将生长有细胞的盖玻片从培养板中取出，丙酮固定，以小鼠抗大鼠细胞角蛋白多抗为一抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，胞浆被染成棕黄色者为阳性，实验同时设立阴性对照。显微镜下观察显色结果，细胞阳性率达95％以上。
2.细胞分组和处理将细胞悬液调到1×109·L-1，接种于24孔培养板中，培养液不含小牛血清。以每个细胞培养孔为一样本个体，随机分为正常对照组、炎症对照组，KGF-20.1，1.0，10和100ng·ml-1组，每种处理设3个复孔。KGF-2组分别加入KGF-2至终浓度0.1，1.0，10和100ng·ml-1，正常对照组和炎症对照组添加培养液，置34℃，5％CO2培养箱中培养24小时后，炎症对照组和KGF-2组加入终浓度为5ng·ml-1的IL-1β，置34℃，5％CO2培养箱中培养6小时。分别收集每组上清液用放射免疫分析法分别测定IL-8和PGE2含量。此试验重复2次。
实验结果与炎症对照组比较，KGF-2 0.1，1.0，10和100ng·ml-1组IL-8和PGE2含量明显降低，以100ng·ml-1组作用最强。结果见表1。
表1。KGF-2对大鼠宫颈鳞状上皮细胞分泌IL-8和PGE2的作用(x±s，pg/ml)
与正常对照组比较**P＜0.01；与炎症对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。x±s，n＝6结果表明，与炎症对照组比较，KGF-2各组都能显著降低大鼠宫颈鳞状上皮细胞分泌IL-8和PGE2，说明KGF-2能抑制、减轻大鼠宫颈细胞炎症，而且其作用呈浓度依赖性，以100ng·ml-1组作用最强。
二、KGF-2阴道栓对实验性大鼠子宫颈炎的治疗作用实验方法1.大鼠子宫颈炎模型的建立制备大鼠子宫颈炎模型用阿拉伯树胶将苯酚混悬制备25％苯酚胶浆，向造模大鼠阴道深部注入0.4ml，三天一次，共三次。
2.分组及处理将大鼠随机分为6组正常对照组15只，阴性对照组15只，阳性对照组15只和KGF-2三个剂量组(各15只)。造模后第三天，开始阴道局部给药，1粒/天，连续12天。KGF-2治疗组分别给KGF-2 40、80和160μg·kg-1·d-1。阳性对照组给聚甲酚磺醛5000μg·kg-1·d-1，阴性对照组给空白基质栓剂。
3.大鼠一般状况观察观察大鼠阴道口是否干燥，阴道有无流液(血)等。
4.子宫颈组织病理形态学观察末次给药后24天处死动物，解剖取材阴道至子宫角处组织，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。每个样本选取相同部位的同一张石蜡切片，在显微镜下观察子宫颈部位的粘膜及其粘膜下间质的病理形态学变化。随机选取非重叠的3个视野，采用计算机图像分析系统分析炎性细胞数量等。
病理形态学评分标准如下粘膜鳞状上皮层次仅局部超过2-3层略有增厚为“+”，明显增厚为“++”，广泛增厚并使粘膜凹凸不平为“+++”有些处柱状上皮可见有增生而出现鳞化趋势为“+”，明显鳞化为“++”，鳞化区域广泛甚至达宫腔为“+++”仅见极少区域鳞状上皮出现糜烂而被邻近柱状上皮增生替代为“+”，柱状上皮增生明显替代鳞状上皮为“++”，鳞状上皮大片脱落由柱状上皮替代为“+++”；仅见极少区域糜烂突破基底膜为“+”，可见明显粘膜上皮变性坏死为“++”，粘膜溃疡伴有感染为“+++”。
炎细胞浸润仅见粘膜及粘膜下浅层有少量炎细胞浸润为“+”，粘膜及粘膜下间质内均有中等量炎细胞浸润为“++”，粘膜下及间质内深层均见大量广泛炎细胞浸润为“+++”。
间质成纤维细胞增生间质内仅见成纤维细胞略较正常对照组增多为“+”，成纤维细胞增生明显并有少量胶原纤维束为“++”，成纤维细胞增生伴有大量胶原纤维束形成为“+++”。
综合宫颈总体病理改变程度分为如下4级正常六项中仅见浅层少量炎细胞浸润；轻度六项中两项以上“+”；中度六项中两项以上“+”，两项有“++”；重度六项中一项有“+++”，两项有“++”，三项有“+”；或三项有“+++”。
5.子宫颈组织IL-8和PGE2含量测定从液氮中取出组织，称取3-5mg放微型匀浆器中，加无水乙醇0.4ml，轻研磨，再加生理盐水1.6ml，研磨制成匀浆，离心，取上清，置-30℃保存，然后统一按试剂盒说明书采用放射免疫分析法分别测定IL-8和PGE2含量。
实验结果1.大鼠子宫颈组织一般状况观察动物造模后，均可见活动减少，阴道外口有浓稠略黄分泌物。末次给药后24小时，阴性对照组大多数动物(约12只)阴道外口有浓稠略黄分泌物，KGF-2160μg·kg-1治疗组仅个别动物阴道外口有少量分泌物，其余均干燥、清洁，活动正常。
2.子宫颈组织病理形态学观察造模大鼠子宫颈组织大量炎性细胞浸润，可见上皮糜烂与粘膜溃疡，并有糜烂部位柱状上皮替代鳞状上皮的趋势。粘膜下层毛细血管扩张充血，间质水肿，从粘膜至间质均可见大量炎性细胞浸润，并可见间质纤维组织增生。KGF-2 40、80和160μg·kg-1治疗组与阴性对照组相应部位比较，粘膜下炎性细胞浸润明显减轻，其中160μg·kg-1治疗组的细胞形态与组织结构更接近正常对照组。结果见表2、3。
表2。KGF-2阴道栓对实验性宫颈炎大鼠宫颈病理形态学变化的影响
与正常组比较**P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01表3。KGF-2阴道栓对实验性宫颈炎大鼠宫颈组织炎症细胞数的影响(x±s)
与正常组比较**P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.013.对大鼠宫颈组织IL-8和PGE2含量的影响与阴性对照组比较，KGF-2 40、80和160μg·kg-1给药组大鼠子宫颈组织IL-8和PGE2含量明显降低，以160μg·kg-1给药组作用最强。结果见表4。
表4。KGF-2阴道栓对实验性宫颈炎大鼠宫颈组织IL-8和PGE2含量的影响(OD，x±s)
与正常组比较**P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01结果表明应用外源性KGF-2能显著改善子宫颈炎大鼠宫颈组织病理形态学改变程度，可使大鼠宫颈组织炎性细胞减少、IL-8和PGE2含量下降，以KGF-2160μg·kg-1治疗组作用最强。表明KGF-2对实验性大鼠子宫颈炎有很好的治疗作用，其机制可能与下调IL-8和PGE2介导的炎症反应有关。
本发明的优点1.本发明采用的KGF-2能有效的促进宫颈鳞状上皮的增殖，使慢性宫颈炎糜烂的宫颈面再鳞状上皮化，加速宫颈糜烂的愈合。
2.KGF-2使宫颈组织炎性细胞减少、IL-8和PGE2含量下降，能显著改善宫颈炎症过程中组织病理形态学改变程度。
3.KGF-2能显著减少IL-1β诱导炎症状态的宫颈鳞状上皮细胞IL-8和PGE2的分泌，减少炎性介质的产生，发挥有效的抗炎作用。
4.KGF-2对人体没有毒副作用，使用安全，效果良好。
5.本发明采用阴道栓剂，技术成熟，生产工艺简单易行。
6.本发明采用阴道给药方式，给药方便，无痛苦，没有后遗症。
具体实施例方式
下面将描述本发明的实施例，但本发明的内容完全不限于此。
一种制备治疗慢性宫颈炎的阴道栓剂，其制备步骤如下采用热熔法制备栓剂，其制备方法如下先配置甘油明胶，即称取配方量的明胶，放入等量的纯水中，待其充分溶胀后，置37-40℃水浴中加热溶解，按比例加入甘油，搅拌，蒸去多余的水分，加入稳定剂、缓冲剂、保护剂，搅匀，保持温度在37-40℃，将KGF-2加入，搅匀趁热灌入已灭菌涂有润滑剂的阴道栓模中，冷却，削去模口溢出部分，脱模，密封，得KGF-2栓剂成品。甘油明胶中甘油、明胶、水的比例是70∶20∶10。
权利要求
1.一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征是它由下述原料按重量百分比制成角质细胞生长因子-20.01-2％，基质84-94％，稳定剂1-8％，缓冲剂1-4％，保护剂0.5-2％。
2.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征是所述的基质为甘油明胶。
3.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征是稳定剂为蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖的其中一种或其中混合物。
4.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征是缓冲剂为磷酸盐、乌头酸、柠檬酸、戊二酸、乙酸盐、枸橼酸盐其中一种。
5.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征是保护剂为人血白蛋白、牛血白蛋白其中一种。
6.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征在于角质细胞生长因子-2 0.02％，甘油明胶90％，蔗糖6％，磷酸盐3.48％，人血白蛋白0.5％。
7.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征在于角质细胞生长因子-2 0.04％，甘油明胶92％，葡萄糖2.16％，枸橼酸盐4％，牛血白蛋白1.8％。
8.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征在于角质细胞生长因子-2 1.3％，甘油明胶86％，甘露醇7.79％，乌头酸3.71％，牛血白蛋白1.2％。
9.根据权利要求1所述的一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，其特征在于角质细胞生长因子-2 1.7％，甘油明胶89％，蔗糖6％，戊二酸1.4％，人血白蛋白1.9％。
全文摘要
本发明公开了一种治疗慢性宫颈炎的栓剂，它以角质细胞生长因子－2为有效成份，其特征在于所述栓剂含有角质细胞生长因子－2与基质、稳定剂、缓冲剂和保护剂一定比例组成。用于慢性宫颈炎的治疗，具有给药方便，对慢性宫颈炎有很好的抗炎、促进宫颈上皮修复的作用，效果良好，无毒副作用的优点。
文档编号A61P15/00GK1895299SQ20061001927
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月6日 优先权日2006年6月6日
发明者杨静, 尹龙武, 李颖, 敖英, 彭仁琇, 夏雪雁, 孔锐 申请人:武汉大学