专利名称：一种治疗男性秃发药物的制备方法及其在临床中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的制备方法，特别是涉及一种治疗男性秃发药物的制备方法及其在临床中的应用。
背景技术：
男性秃发是中老年男性临床常见的一种疾病，目前还没有一种有效治疗方法。由于生活节奏的加快，男性秃发还有进一步升高的趋势。
一般认为，人毛乳头细胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的发育及周期性生长调控中起重要作用。要阐明人毛乳头细胞对调节毛囊生长和发育的机制，必须从人毛乳头细胞自身分泌的生物活性成份着手，这也是今后毛囊研究的重要内容之一。我们在建立人毛乳头细胞体外培养模型基础上，应用低传代人毛乳头细胞的培养上清制成条件培养基，观察其对不同传代的人毛乳头细胞生长状态的影响，发现人毛乳头细胞条件培养液(dermal papilla cellconditional medium DPCCM)能将非凝集生长的人毛乳头细胞有效诱导为凝集性生长状态，并促进细胞增殖。为进一步分析人毛乳头细胞生长活性蛋白的体内生物学活性，我们将人毛乳头细胞条件培养液制成冻干粉，初步应用于男性秃发患者，发现其有改善男性秃发的治疗效果。
鉴于上述，本发明的目的在于提供一种治疗男性秃发药物的制备方法。本发明的另一目的在于男性秃发药物在临床中的应用。
本发明药物的制备方法及其临床应用是通过以下步骤来实现的(1).试剂和材料低糖培养基(DMEM)购自Sigma公司。Hepes购自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三军医大学西南医院输血科提供。
(2).药物制备的方法2.1基础培养基的制备2.1.1人AB型血清的制备a)采集健康献血员(经查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋体感染)全血200ml入无抗凝剂的血袋；
b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；c)2000rpm离心30分钟；d)用血清分离器分离人AB型血清，所分离的人AB型血清可放入-20℃冷冻箱备用，也可直接行下例步骤h)；e)将人AB型血清袋从-20℃冷冻箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小时；f)将人AB型血清室温放置2小时；g)将人AB型血清在37℃水箱中放置1小时；h)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，其上下温差应小于0.5℃；i)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。
上述人AB型血清制备的步骤也可为l)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋；m)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；n)2000rpm离心30分钟；o)用血清分离器分离人AB型血清，所分离的AB型血清可放入-20℃冷冻箱备用；p)将人AB型血清袋从-20℃冷冻箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小时；q)将人AB型血清室温放置2小时；r)将人AB型血清在37℃水箱中放置1小时；s)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，其上下温差应小于0.5℃；t)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；u)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；v)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。
2.1.2基础培养基的制备将15ml人AB型血清与85ml低糖培养基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氢钠，0.03g L-谷氨酰胺混匀后，用0.22微米孔径的微孔滤膜过滤除菌，直接使用或-20℃冻存备用。
2.2人毛乳头细胞条件培养液的收集(1)取意外死亡的正常健康青年(经查排除HI、HBV、HCV、梅毒螺旋体感染)枕后一手掌大小头皮，用二步酶法分离人毛乳头细胞(参见钟白玉，杨希川，杨卫兵，等。二步酶消化法分离人头皮毛乳头细胞[J]。中华皮肤科杂志，2003；36(7)406。)；(2)培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基，100ml培养瓶中加入7ml基础培养基，3天换一次基础培养基；(3)开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代毛乳头细胞培养上清从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心管并拧紧，在IK16型离心机(美国SIGMA公司)中3000rpm离心10分钟；(4)在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清(小心不能搅起底部的沉淀)，移入无菌玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20℃冻存备用。
2.3人毛乳头细胞条件培养液冻干粉的制备(1)冻干室紫外线消毒4小时；(2)操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上用无菌吸管将人毛乳头细胞条件培养液分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且留出冻干孔；(3)将冻干瓶放入冻干机中；(4)冻干过程I -40℃ 4小时II -20℃ 3小时 (开始抽真空至结束)III-5℃ 10小时IV 5℃ 4小时V 15℃ 3小时VI 25℃ 5小时(5)在真空环境下，真空封包冻干瓶；(6)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞；(7)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。
治疗男性秃发药物的理化特性为颜色白色；
形态粉末状；pH值7.35；溶解度每瓶用3ml生理盐水在3秒钟内可完全溶解，溶解后液体为橙红色。
本发明的优点和产生的有益效果是人毛乳头细胞为分泌性细胞，在体外培养时可分泌许多蛋白质，这些蛋白质可促进毛囊的生长和发育，在体外实验我们已证明其有确切的生物学活性，但其应用于临床还未见报道，我们在原有的培养人毛乳头细胞的基础上，改进其培养基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培养出人毛乳头细胞，我们收集培养过低传代人毛乳头细胞的基础培养基，用于临床治疗男性秃发，观察其治疗效果，发现有确切的治疗作用，取得了良好的经济效益和社会效益。
应用本发明制备的药物在治疗男性秃发中有明显的疗效，本药物所用细胞和培养血清均对人体均无抗原性，用于人体无任何过敏反应，本发明用含人AB型血清的基础培养基培养人毛乳头细胞，较以前用小牛血清培养人毛乳头细胞在技术上取得了突破，为本药物应用于临床奠定了基础，这也是本发明关键技术的核心所在。此外，本发明所用药物为皮下注射，其有效药物利用度大大提高，其制备工艺十分考究，实用性强，能为广大患者服务。
图1为本发明男性秃发治疗前示意2为本发明男性秃发治疗后示意图具体实施方式
使用前依照上述药物制备的方法进行药物的配制每瓶冻干粉用3ml生理盐水溶解(恢复冻干前原始浓度)。
(1)、药物的生物安全性实施例1.1小鼠急性毒性试验我们选用7～9周龄、体重为18～22g的昆明种小鼠。按预试验公比0.8设立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。单次腹腔注射，药后立即观察、记录动物的中毒反应、死亡情况及时间，连续观察14天。
1.2家兔热原试验选3只体重为1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳静脉注射给药。测量家兔肛门体温，深度为6厘米，以后每隔1小时测量体温1次，共3次。
1.3细菌培养随机抽取5支冻干瓶，无菌生理盐水溶解，4道划线法接种于普通血平板上，培养48小时后观察结果。
1.4真菌培养随机抽取5支冻干瓶，无菌生理盐水溶解，接种于沙堡氏培养基上，培养10日后观察结果。
1.5结果小鼠急性毒性试验显示在腹腔注射不同剂量人毛乳头细胞条件培养液样品溶液后，各组动物未发现明显的中毒症状，在整个试验期限内无动物死亡或其它异常征象。家兔热原试验显示在耳静脉注射人毛乳头细胞条件培养液样品溶液后，各动物的体温变化均符合热原试验的要求。细菌和真菌培养均未见细菌和真菌生长。
(2)、药物的临床应用(1)治疗男性秃发药物的理化特性为颜色白色；形态粉末状；pH值7.35；使用前依照上述药物制备的方法进行药物的配制每瓶冻干粉用3ml生理盐水溶解(恢复冻干前原始浓度)。药物溶解度每瓶用3ml生理盐水在3秒钟内可完全溶解，溶解后液体为橙红色。
(2)治疗方案选择50例年龄在40～68岁的男性秃发患者为试验对象，常规消毒患部皮肤后皮下多点注射，每周1次，每个患部(直径小于5厘米)每次最多3ml，共4次，治疗完成后观察6个月。
人毛乳头细胞条件培养液在通过生物安全鉴定后，我们在患者知情同意的情况下应用于患部。50例人毛乳头细胞条件培养液治疗的男性秃发患者中，除6例无效外其余均有一定疗效。
权利要求
1.一种治疗男性秃发药物的制备方法，其特征在于用含人AB型血清的基础培养基培养低传代人毛乳头细胞，收集低传代人毛乳头细胞培养上清，将所收集上清液制备成冻干粉；(1)上述人AB型血清制备的步骤为a)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋；b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；c)2000rpm离心30分钟；d)用血清分离器分离人AB型血清；e)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，注意其上下温差应小于0.5℃；f)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用；(2)上述的基础培养基的制备方法基础培养基将15ml人AB型血清与85ml低糖培养基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氢钠，0.03g L-谷氨酰胺混匀后，用0.22微米孔径的微孔滤膜过滤除菌，直接使用或-20℃冻存备用；(3)人毛乳头细胞条件培养液的收集过程为a)取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小头皮，用二步酶法分离人毛乳头；b)培养时在50ml培养瓶中加入5ml基础培养基，100ml培养瓶中加入7ml基础培养基，3天换一次基础培养基；c)开启超净台并用紫外线消毒30分钟，操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上将低传代人毛乳头细胞培养上清从培养瓶中无菌倒入50ml无菌离心管中，用旋丝口盖盖上离心管并拧紧，在离心机中离心；d)在超净台上打开离心管，用无菌吸管吸出离心管中的上清，移入无菌玻璃容器中，加无菌橡皮塞后，作好标记，-20℃冻存备用。(4)人毛乳头细胞条件培养液的冻干过程为a)冻干室紫外线消毒4小时；b)操作时着隔离衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒双手后在超净台上用无菌吸管将药物分为3ml/冻干瓶，盖上瓶塞且留出冻干孔；c)将冻干瓶放入冻干机中；d)连续冻干过程I -40℃4小时II-20℃3小时III -5℃ 10小时IV5℃ 4小时V 15℃ 3小时VI25℃ 5小时e)在真空环境下，真空封包冻干瓶；f)打开冻干机冻干室门，取出冻干瓶，加瓶盖并加压封包瓶塞；g)贴上标签，注明标识和日期，4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种治疗男性秃发药物的制备方法，上述人AB型血清制备的步骤也可为a)采集健康献血员全血200ml入无抗凝剂的血袋；b)将全血血袋37℃水箱中放置1小时；c)2000rpm离心30分钟；d)用血清分离器分离人AB型血清，所分离的AB型血清可放入-20℃冷冻箱备用；e)将人AB型血清袋从-20℃冷冻箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小时；f)将人AB型血清室温放置2小时；g)将人AB型血清在37℃水箱中放置1小时；h)将人AB型血清在56℃水箱中放置1小时去除补体，其上下温差应小于0.5℃；i)在超净台上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分钟，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，将血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分装为15ml/瓶，-20℃冻存备用。
3.一种治疗男性秃发药物在临床中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种药物的制备方法，特别是涉及一种治疗男性秃发药物的制备方法。药物的前体为含15％人AB型血清的基础培养基，该基础培养基按15ml人AB型血清、85ml低糖培养基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g碳酸氢钠、0.03gL－谷氨酰胺配比构成。用基础培养基培养低传代人毛乳头细胞，收集低传代人毛乳头细胞培养上清为人毛乳头细胞条件培养液，将所收集的人毛乳头细胞条件培养液制备成冻干粉。本发明所制备的药物在治疗男性秃发中有明显的疗效，本药物所用细胞和培养血清对人体均无抗原性，用于人体无任何过敏反应。此外，本发明所用药物为皮下注射，其有效药物利用度大大提高，其制备工艺十分考究，实用性强，能为广大患者服务。
文档编号A61K9/19GK1879883SQ200610042780
公开日2006年12月20日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者罗洋 申请人:罗洋