专利名称：银杏内生镰刀菌纤溶酶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种银杏内生镰刀菌纤溶酶，属于一种纤溶酶。
背景技术：
急、慢性心血管栓塞性疾病已成为当今社会中老年人的群发病，血栓栓塞性疾病如心肌梗塞(myocardial infarction，MI)、冠心病、脑血栓、静脉血栓塞等，严重危害人类健康及生命。对血栓栓塞性疾病的治疗涉及以下几方面一是阻止血小板凝集，二是阻止血纤维蛋白形成，三是促进血纤维蛋白溶解[1]。目前溶栓疗法是血栓栓塞性疾病的常规治疗方法，即给患者注射链激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase，UK)、组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogen activator，t-PA)等溶栓剂，使血栓溶解。溶栓剂从作用机理上可以分为两大类一类是纤维蛋白溶酶，能直接降解纤维蛋白(原)成可溶性小肽(小分子产物)，是血液中降解纤维蛋白重要的酶，简称为纤溶酶(plasmin)；另一类是纤溶酶原激活剂(plasminogen activator)，它本身不降解纤维蛋白，而是通过激活纤溶酶原，释放纤溶酶降解纤维蛋白。这两类酶虽然作用方式不一样，但最终的结果都是降解纤维蛋白(原)，达到抗凝或溶解血栓的目的，统称为纤维蛋白水解酶[3，4]。
全世界有血栓栓塞性疾病人1500万，溶栓剂潜在市场约20亿美元，据报道1992年美国t-PA产值就达1.8亿美元。据卫生部统计，中国急性心肌梗塞和脑血栓中风发病人数已超过300万，死亡率超过60％，目前中国对溶栓药品需求的人数至少有500万，中国同世界各国一样，血栓病的发病率有逐年增加的趋势，这说明溶栓剂有广阔的应用前景，目前常用的及一些还在开发的同类药物如链激酶、尿激酶、蚓激酶等，均在不同程度上存在一定缺陷，或者是毒性较强、副作用较大；或者在人体内半衰期短，药效难以发挥；或者来源紧缺，造价高，价格昂贵难以成为一种大众药物。寻找并研制出效率高、特异性强、副作用低的新型溶栓药物具有重要的意义。
微生物是溶栓药物的重要来源，早期发现的β-溶血链球菌(Streptococcushemolyticus)产生的链激酶(Streptokinase)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)产生的葡激酶(Staphylokinase)。近年来不断筛选到许多能产生纤溶酶的微生物，在各类微生物中均有纤溶酶，根霉菌和黄青霉菌等，但是，利用银杏内生镰刀菌来分离制备纤溶酶，还未见任何报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从银杏内生真菌(Fusarium sp.)获得的纤溶酶，命名为银杏内生镰刀菌纤溶酶。
本发明的另一个目的是提供上述产品的制备方法。
本发明是以如下技术方案实现的该银杏内生镰刀菌纤溶酶是从银杏(Ginkgo biloba)内生真菌(Fusarium sp.)发酵获得的发酵液，经盐析得到沉淀，沉淀经透析脱盐后，然后分别用DEAE-Sepharose柱层析、DEAE-Biosephar FastFlow柱层析和CM-Sepharose柱层析等方法进行洗脱，收集活性峰，SDS-PAGE鉴定其纯度，对纯银杏内生镰刀菌纤溶酶进行冷冻干燥，即得到分子量约34kDa的银杏内生镰刀菌纤溶酶。
上述特点的银杏内生镰刀菌纤溶酶的制备方法，包括如下步骤(1)将银杏内生镰刀菌菌株在PDA斜面培养基上，25-27℃恒温箱中培养3-4天，待菌丝生长旺盛时，接种在马铃薯葡萄糖培养液PD，26℃，125rpm下培养5-8d后，将培养物过滤或离心得上清发酵液；(2)在步骤1得到的上清发酵液，加入硫酸铵至80％饱和度进行盐析，离心后得沉淀；(3)将步骤2得到的沉淀进行透析脱盐，然后分别用DEAE-Sepharose柱层析或DEAE-Biosephar Fast Flow柱层析和CM-Sepharose柱层析的方法进行洗脱，收集活性峰，用SDS-PAGE测定纯度；，分子量约34kDa。冷冻干燥后，即可得纯化的银杏内生镰刀菌纤溶酶。
上述分离纯化用Bio-rad中或低压层析系统。
本发明具有如下特点该银杏内生镰刀菌纤溶酶具有直接降解纤维蛋白作用，有很好的血栓溶解活性，可用于抗血栓药物的制备。
银杏内生镰刀菌纤溶酶约34kDa，酶活温度广，最适作用温度为35℃左右，对pH稳定，最适pH8.0，C6H5O73-、S2O32-、Mg2+、K+、Ba2+对该酶有激活作用，10mmol/L EDTA能使其活力提高27％。
图1是银杏内生镰刀菌纤溶酶的SDS-PAGE；图2是银杏内生镰刀菌纤溶酶最适作用温度；图3是pH对银杏内生镰刀菌纤溶酶的影响图4是银杏内生镰刀菌纤溶酶的热稳定性；图5是阴离子对银杏内生镰刀菌纤溶酶活性的影响；图6是阳离子对银杏内生镰刀菌纤溶酶活性的影响。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步说明本发明的方法。
实施例1银杏内生镰刀菌纤溶酶制备(1)发酵将银杏内生镰刀菌(Fusarium sp)在置于PDA平板上，在24-30℃恒温箱中培养3～5d，然后在PD液体培养基中25℃培养5d。培养结束后，离心或过滤收集发酵上清液。
(2)盐析和脱盐取发酵上清液1000mL，用硫酸铵饱和度为80％进行沉淀，于实验层析冷柜(0℃)中逐步加入516g硫酸铵，边溶边加，全部溶解后，4℃冰箱静置过夜，离心(8000rpm，15min，4℃)，沉淀部分用双蒸水溶解，置于透析袋中对双蒸水透析24h，再对20mmol/L pH9.0 Tris-Cl透析24h。
(3)离子交换柱层析DEAE-Sepharose柱层析取上述透析过的银杏内生镰刀菌(Fusarium sp)上样于DEAE-Sepharose层析柱，上样前用20mmol/L pH9.0 Tris-Cl平衡层析柱，直至流出液紫外吸收值和电导值不再发生变化，上样后用2个柱体积的平衡缓冲液流经柱子，使得未被柱子吸附的部分完全流出柱子，对吸附在柱子上的部分以20mmol/L pH9.0 Tris-Cl(A液)和0.5mol/L NaCl(B液)作梯度洗脱，即0-100％B液4个柱体积，流速0.5mL/min，紫外波段280nm检测，软件LP Data View记录整个层析过程。收集活性峰，得纤溶酶粗酶。
CM-Sepharose柱层析取纤溶酶粗酶上样于CM-Sepharose层析柱，上样前用20mmol/L pH4.6NaAc-HAc平衡层析柱，直至流出液紫外吸收值和电导值不再发生变化，上样后用2个柱体积的平衡缓冲液流经柱子，使得未被柱子吸附的部分完全流出柱子，对吸附在柱子上的部分以20mmol/L pH4.6 NaAc-HAc(A液)和0.5mol/L NaCl(B液)作梯度洗脱，即0-100％B液4个柱体积，流速1.0mL/min，分管收集，每管2mL，紫外波段280nm检测，软件LP Data View记录整个层析过程。收集活性峰，冷冻干燥，SDS-PAGE电泳(见图1)，得银杏内生镰刀菌纤溶酶。
实施例2银杏内生镰刀菌纤溶酶制备将实施例1中的DEAE-Sepharose柱层析用DEAE-Biosephar Fast Flow柱层析取上述透析过的银杏内生镰刀菌(Fusarium sp)上样于DEAE-Biosephar FastFlow层析柱，上样前用20mmol/L pH7.8 PBS平衡层析柱，直至流出液紫外吸收值和电导值不再发生变化，上样后用2个柱体积的平衡缓冲液流经柱子，使得未被柱子吸附的部分完全流出柱子，对吸附在柱子上的部分以20mmol/L pH7.8 PBS(A液)和0.5mol/L NaCl(B液)作梯度洗脱，即0-100％B液4个柱体积，流速1.0mL/min，紫外波段280nm检测，软件LP Data View记录整个层析过程。收集收集活性峰，得纤溶酶粗酶。其它步骤同实例1。
实验例主要是测定纤溶活性及外界条件对活性的影响。
纤溶活性的测定用纤维蛋白琼脂平板法。按Astrup[55]方法稍作改进，冻干人纤维蛋白原50mg溶解于5mL 9g/L NaCl液，并保温于45℃水浴30min；75mg琼脂溶于5mL 9g/LNaCl液，微波炉加热熔化，加热过程中有水分散失，加蒸馏水补足，45℃水浴保温5min，两者混匀，加入30μL凝血酶溶液，立即混匀，注入直径9cm的塑料培养皿中，将培养皿移至水平的实验台上，待其冷却凝固。这样制备的纤维蛋白平板，为普通平板，因市售的纤维蛋白原含有微量纤溶酶原，将普通平板于80℃烘箱中处理30min，使得纤溶酶原失活，即为加热平板。用移液枪吸取10μL各内生真菌培养上清液，加到普通平板上，37℃保温数小时，观察有无溶圈的出现和大小。
温度对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性的影响温度对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性影响的测定结果见图2，从图中可以看出，在所设定的温度中，酶作用的最适温度在35℃左右，在低于最适作用温度时，酶活性随温度的升高而迅速上升，在高于最适作用温度时，酶活性随温度的升高而缓慢下降，当温度超过45℃时活性急剧下降，到60℃时活性几乎丧失。绘制的曲线表明，人的体温在银杏内生真菌EG18纤溶酶作用的最佳范围内，银杏内生真菌EG18纤溶酶进入人体后能正常发挥作用，在血栓形成部位能迅速降解血栓。
pH对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性的影响pH对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性影响的测定结果见图3，从图中可以看出，在所设定的pH中，酶作用最适pH为8，在pH3-6之间酶活性缓慢上升，pH大于6时，活性迅速增加，pH8时升到最大，pH大于8时活性又迅速下降。绘制的曲线表明，银杏内生真菌EG18纤溶酶作用的最佳pH范围为(弱)碱性环境，酸性环境不利于银杏内生真菌EG18纤溶酶发挥作用。
热稳定性不同温度处理银杏内生真菌EG18纤溶酶后剩余活性见图4。以从4℃贮存取出后直接测活为对照，计算不同处理酶剩余活性分别是100％，99％，86％，79％，78％，79％，59％，42％。在低于25℃时酶活性保持稳定，高于25℃时酶活性略有损失(20％左右)，当超过45℃的高温处理后，酶活损失较大，55℃处理1h约损失一半的活性。也就是该纤溶酶在室温下比较稳定，但也不耐高温。
阴离子对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性的影响阴离子对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性影响的测定结果见图5，从图中可以看出，在所选择的阴离子中，有的对酶有激活作用，有的是抑制作用，C6H5O73-，S2O32-激活作用较强，NO3-对酶活力没有影响，Cl-，HSO3-对酶有抑制作用，HSO3-处理后的酶活几乎完全丧失。
阳离子对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性的影响阳离子对银杏内生真菌EG18纤溶酶活性影响的测定结果见图，从图6中可以看出，在所选择的阳离子中，有的对酶有激活作用，有的对酶有抑制作用，K+，Ba2+，Mg2+，Ca2+对该酶有不同程度的激活作用，其中Mg2+激活作用最强；Zn2+，Mn2+，Na+，Co2+均能抑制其活力，Zn2+抑制作用最强。
权利要求
1.一种银杏内生镰刀菌纤溶酶，其特征在于，该纤溶酶是由一种银杏内生镰刀菌发酵所获得的发酵液，经硫酸铵盐析，透析脱盐，然后用DEAE-Sepharose柱层析或DEAE-Biosephar Fast Flow柱层析，然后CM-Sepharose柱层析方法进行纯化得到的，该纤溶酶的分子量为34kDa。
2.一种权利要求1所述的银杏内生镰刀菌纤溶酶，其特征在于，先培养银杏内生镰刀菌，然后进行发酵，获银杏内生镰刀菌纤溶酶，具纯化，具体步骤为(1)发酵将银杏内生镰刀菌菌株在PDA斜面培养基上，25-27℃恒温箱中培养3-5天，待菌丝生长旺盛时，制备马铃薯葡萄糖培养液PD，然后在马铃薯葡萄糖培养液PD中在25-26℃，125rpm下培养5d-6d后，离心或过滤收集发酵液上清液；(2)盐析和脱盐在发酵上清液中用硫酸铵至饱和度为80％进行沉淀，离心后收集蛋白沉淀；用透析或DEAE-纤维素脱盐；(3)离子交换柱层析用DEAE-Sepharose柱层析、或用DEAE-Biosephar FastFlow柱层析收集活性峰，得纤溶酶粗酶，然后用CM-Sepharose柱层析的方法进行纯化，得到纯洗脱液，并用SDS-PAGE测定纯度和相对分子量，结果得到纯化的酶，SDS-PAGE显示单条带，分子量约34kDa，后冷冻干燥，得银杏内生镰刀菌纯纤溶酶。
3.根据权利要求2所述银杏内生镰刀菌纤溶酶的制备方法，其特征是所需的培养基为，制备马铃薯葡萄糖培养液PD含葡萄糖或蔗糖1-4％，MgCl20.01-0.09％，或在马铃薯葡萄糖培养液PD中加入0.01-0.9％的酵母浸膏。
4.根据权利要求2或3所述的银杏内生镰刀菌纤溶酶的制备方法，其特征是该纤溶酶的纯化用Bio-rad中或低压层析系统纯化。
5.根据权利要求1所述的银杏内生镰刀菌纤溶酶的制备方法，其特征是，该银杏内生镰刀菌纤溶酶应用在抗血栓药物中。
全文摘要
一种银杏内生镰刀菌纤溶酶，是通过银杏内生镰刀菌发酵所得，对其发酵液进行硫酸铵盐析，经透析脱盐，然后用DEAE－Sepharose柱层析、DEAE－Biosephar Fast Flow柱层析和CM－Sepharose柱层析的方法进行纯化并用SDS－PAGE测定纯度和相对分子量，结果得到一纯化的纤溶酶，SDS－PAGE显示单条带，分子量约34kDa。该纤溶酶具有直接降解纤维蛋白的纤溶活性，和很好的血栓溶解作用。该银杏内生镰刀菌纤溶酶可以用于制备溶栓药物。
文档编号A61K38/43GK1896232SQ20061008594
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者蒋继宏, 冯友健, 陈凤美, 方德兰, 曹小迎, 刘美艳, 孙勇 申请人:徐州师范大学