专利名称：用于治疗肿瘤转移的真核表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及构建含有Bikunin的真核细胞表达载体，以表达含有Bikunin的融合蛋白，用于治疗恶性肿瘤。
背景技术：
恶性肿瘤是引起人类死亡的主要疾病之一。传统的治疗方法主要包括手术、化疗和放疗。经过几十年卓有成效的努力，肿瘤患者生存期得到延长，生存质量得到提高。但目前恶性肿瘤仍然是威胁人类健康的主要疾病之一，尤其是针对晚期伴有转移的患者，疗效不佳，预后不良。这就迫使人们寻找新的治疗方法。伴随着分子生物学的发展，生物治疗应运而生。
生物治疗是用生物制剂对疾病进行治疗。它具有特异性高、副作用小、疗效可靠，因此，近年来发展迅猛。
肿瘤转移是一个极其复杂、多步骤的肿瘤细胞与宿主之间相互作用的过程。它涉及原发肿瘤组织上异质细胞亚群的选择，肿瘤细胞黏附和运动性、血管生成等多种肿瘤细胞的生物学行为。
Bikunin是含有Kunitz结构的蛋白酶抑制剂，它能抑制胰蛋白酶(trypsin)和血浆纤维蛋白溶酶(plasmin)活性，也能通过抑制前炎症细胞因子以抑制炎症的应答反应(Fries，E.et al.(2000)Int.J.Biochem.Cell Biol.32，125-137.Nakamura，H.et al.(1997)Iht.Arch.Allergy Immunol.112，157-162)。除此之外，它能通过抑制尿激酶型血浆酶原激活物(urokinase-type plasminogenactivator，uPA)及其受体的表达，从而抑制肿瘤转移。在卵巢癌细胞中，无论是过表达还是加入外源Bikunin，都能有效抑制肿瘤细胞的转移(Hiroshi Kobayashiet al(2002)Eur.J.Biochem.269，3945-3957.Hiroshi Kobayashi et al(2004)JBC.279，6371-6379.Hiroshi Kobayashi et al(2003)JBC.278，7790-7799)。因此，Bikunin可作为治疗肿瘤转移的生物制剂。
人源生物制剂不易引发免疫反应，也不易产生耐药性，带有标签的融合蛋白易于检测和纯化。因此，我们构建了真核细胞表达载体pSecTag2B-Bikunin，以表达分泌的、带有Myc和组氨酸的Bikunin融合蛋白，为治疗肿瘤转移提供新的生物制剂。
发明内容
本发明的目的是构建Bikunin的真核细胞表达载体，以表达含有Bikunin的融合蛋白，用于治疗恶性肿瘤的转移。
本发明的技术解决方案本发明所述构建Bikunin的真核细胞表达载体，以表达含有Bikunin的融合蛋白。具体为1.目的基因的获得常规从人肝细胞系L02中提取RNA，经逆转录合成cDNA，用PCR括增Bikunin。
2.pMD18-T-Bikunin载体的构建用常规的分子生物学方法构建pMD18-T-Bikunin载体，经酶切和PCR鉴定后，对插入序列进行测序证实插入片段为目的基因Bikunin。
3.pSecTag2B-Bikunin的构建将pMD18-T-Bikunin酶切产物亚克隆到pSecTag2B中，酶切和PCR鉴定构建含有Bikunin的真核表达载体pSecTag2B-Bikunin。
4.pSecTag2B-Bikunin在NIH3T3细胞中的表达用磷酸钙沉淀法将pSecTag2B-Bikunin转染NIH3T3细胞，Western blot检测转染后24小时的细胞培养上清，有融合蛋白的表达。
本发明的有益效果是为治疗肿瘤转移提供新的生物制剂。该基因克隆于人肝细胞系L02，且应用真核表达系统，表达分泌型带有标签-Myc和组氨酸的Bikunin融合蛋白。因此，既具有克服了异源蛋白的免疫原性，又具有能进行翻译后的糖基化，易于分离纯化的优点。可作为制备治疗恶性肿瘤的药物。
四
图1.PCR扩增Bikunin的1.5％琼脂糖电泳结果1DNA marker.2PCR产物(箭头所指为Bikunin)图2.pMD18-T-Bikunin经BamHI和HandIII双酶切产物电泳结果1DNA marker；2，3，4为不同克隆的双酶切结果(箭头所指为释放的Bikunin片段)图3.pMD18-T-Bikunin为模板的BikuninPCR产物电泳图1DNA marker；2，3，4，5，6为不同克隆的PCR结果(箭头所指为Bikunin)；7，8为不含Bikunin载体作为阴性对照。
图4.pSecTag2B-Bikunin PCR扩增Bikunin和BamHI、HandIII双酶切产物电泳图1DNA marker；2，3为不同克隆的Bikunin PCR产物；4，5为双酶切结果(箭头所指为Bikunin)
图5.Western blot检测融合蛋白Bikunin的表达1磷酸钙转染NIH3T3细胞培养上清(在约50kD处见有阳性条带)；2阴性对照五具体实施方式
本发明应用RT-PCR方法，从人肝细胞系L02扩增Bikunin，将其克隆于pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T-Bikunin，经酶切、PCR及测序鉴定后，将Bikunin亚克隆至真核表达载体pSecTag2B中，经酶切及PCR鉴定，证明构建成功含有Bikunin的真核表达载体pSecTag2B-Bikunin。用磷酸钙法转染NIH3T3细胞，24小时后，Western blot检测浓缩25倍的细胞培养上清，证明有融合蛋白的表达。
材料与来源试剂，Trizol和pSecTag2B为Invitrogen公司产品；引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成；pMD18-T Simple vector及应用的酶类和试剂盒，除特殊标明外，均购于大连宝生物工程有限公司；序列测定由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)完成。
实施例1.目的基因的获得常规从人肝细胞系L02中提取RNA，经逆转录合成cDNA，反应体系为RNA 1μg，5X AMV buffer 4μl，dNTP 1mM，RNase Inhibitor 20U，Oligo(dT)18Primer 50pmol，AMV Reverse Transcriptase 5U，DEPC H2O加至20μl。混匀，42℃反应1小时，冰上放置2分钟。PCR反应引物上游引物5’-cca taagct tag agt ccg gag ggc tgt gct acc cca aga a-3’，下游引物5’-att tggatc cca gtt gga gaa gcg cag cag ctc ctc atc-3’，分别含有Hand III和Bam HI酶切位点(下画线部分)。反应体系为cDNA 1μl，5X Prime STAR buffer6.0μl，dNTP 0.2mM，Prime STAR DNA polymerase 0.3μl，Primer 50pmol，反应体积为30μl。反应条件为95℃变性5分钟，95℃30秒，66℃30秒，72℃30秒，35个循环，72℃延伸10分钟。反应产物用1.5％琼脂糖电泳鉴定。
2.pMD18-T-Bikunin载体的构建应用宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0试剂盒(按说明书操作)切胶回收目的片段，然后应用宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa DNA A-Tailing Kit试剂盒进行3’端加A反应(按说明书操作)。加A后的产物与pMD18-T Simple vector连接(应用Takara DNA Ligation Kit)，反应体系为pMD18-T Simple vector1μl，上述PCR加A产物0.2pmol，加H2O至5μl后加入等量(5μl)LigationMix，混匀，16℃反应30分钟，全量加入100μl Top10大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42℃90秒后，冰上放置1分钟，加入890μl LB培养基，37℃250rpm培养1小时，取适量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。质粒提取应用上海赛百盛基因技术有限公司UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒，按使用说明书操作。用Hand III和Bam HI双酶切和PCR鉴定后，对序列进行测定证实插入片段为目的基因Bikunin。pMD18-T-Bikunin载体的构建成功。
3.pSecTag2B-Bikunin的构建用Hand III和Bam HI分别对pMD1B-T-Bikunin和pSecTag2B进行双酶切，用宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0试剂盒(按说明书操作)切胶回收目的片段，按载体∶酶切产物(1∶5)混合(总体积5μl)，加入等量(5μl)LigationMix，混匀，16℃反应30分钟，全量加入100μl Top10大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42℃90秒后，冰上放置1分钟，加入890μl LB培养基，37℃250rpm培养1小时，取适量菌液涂布含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃250rpm培养过夜。质粒提取应用上海赛百盛基因技术有限公司UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒，按使用说明书操作。用Hand III和Bam HI双酶切和PCR鉴定构建的载体。
4.pSecTag2B-Bikunin在NIH3T3细胞中的表达磷酸钙沉淀法20μg pSecTag2B-Bikunin用去离子水稀释至100μl，同时将50μl 2.5M CaCl2加入到350μl的去离子水中。100μl稀释的20μgpSecTag2B-Bikunin逐滴滴入稀释的CaCl2中。将上述DNA/CaCl2混合液逐滴加入500μl 2X HeBS，边加入，边吹打混合，随即在旋涡混合仪上振荡5秒。室温静置20分钟以形成沉淀。将沉淀逐滴均匀加入细胞中，轻轻晃动。标准条件下培养12小时，换液。培养24-48小时收集培养上清。培养上清浓缩20-25倍，行Westen blot检测。证明有融合蛋白Bikunin的表达。见附图。
权利要求
1.一种Bikunin真核细胞表达载体，其特征是该载体表达产物为含有Myc和组氨酸标签的Bikunin融合蛋白。
2.根据权利要求1所述Bikunin真核细胞表达载体的构建方法，其特征在于Bikunin克隆于人肝细胞系L02，将其克隆于pMD18-T Simple Vector中，经酶切、PCR及测序鉴定后，再亚克隆至真核表达载体pSecTag2B中，构建含有Bikunin的真核表达载体pSecTag2B-Bikunin，用磷酸钙沉淀法将pSecTag2B-Bikunin转染NIH3T3细胞，表达了融合蛋白Bikunin。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白Bikunin在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生制药技术领域，所述构建含有Bikunin的真核表达载体pSecTag2B－Bikunin所表达的产物为带有Myc和组氨酸标签的融合蛋白。本发明应用RT－PCR方法，从人肝细胞系L02扩增Bikunin，将其克隆于pMD18－T SimpleVector中构建pMD18－T－Bikunin，经酶切、PCR及测序鉴定后，将Bikunin亚克隆至真核表达载体pSecTag 2B中，经酶切及PCR鉴定，证明构建成功含有Bikunin的真核表达载体pSecTag2B－Bikunin。用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞，24小时后，Western blot检测浓缩25倍的细胞培养上清，证明有融合蛋白的表达。该蛋白作为生物制剂可用于肿瘤转移的治疗。
文档编号A61P35/00GK1884554SQ20061008544
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月16日 优先权日2006年6月16日
发明者孙国勋, 张辰宇, 李朝军, 项阳 申请人:南京大学