专利名称：回折模拟物及其相关的方法
技术领域：
本发明总地涉及回折(reverse-turn)模拟结构及其相关的化学文库。本发明还涉及在癌症疾病治疗中的应用和包含它们的药物组合物。
背景技术：
随机筛选分子作为治疗剂的可能活性已存在多年，并导致许多重要的药物发现。虽然分子生物学和计算化学的发展已导致增加对称为“理性药物设计”的兴趣，但已证明这种技术并不如最初预测的那样快速或可靠。因此，近年来的兴趣发生了更新并返回到随机药物筛选。为此目的，已在基于组合化学文库的开发和对这种文库进行寻找生物活性成员的筛选的新技术方面取得具体的进步。
一般来说，组合化学文库仅仅是一种分子的收集。这种文库随库内的化学物质种类以及用于产生文库成员和鉴定与有用的生物靶体相互作用的成员的方法而改变。虽然这个领域仍然处于发展初期，但产生和筛选文库的方法已变得相当繁多和复杂。例如，一篇最近的关于不同组合化学文库的综述已确定了多种这样的技术(Dolle，J.Com.Chem.，2(3)383-433，2000)，包括使用标记和非标记的文库成员(Janda，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110779-10785，1994)。
最初，组合化学文库一般限于肽或核苷酸来源的成员。为此目的，Houghten等人的技术例示了称为“双定义迭代”的方法用于通过分裂合成技术装配可溶性组合肽文库(Nature(London)35484-86，1991；Biotechniques 13412-421，1992；Bioorg.Med.Chem.Lett.3405-412，1993)。通过这种技术，已获得含有数千万成员的可溶性肽文库。已表明这种文库有效地鉴定类阿片肽，如甲硫氨酸-和亮氨酸-脑啡肽(Dooley和Houghten，Life Sci.52，1509-1517，1993)，而N-酰基化肽文库已用于鉴定作为有效的类阿片拮抗剂的乙酰基脑啡肽(Dooley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010811-10815，1993.更为最近地，已构建全D-氨基酸类阿片肽文库，并对其进行针对mu(″μ″)阿片样物质受体的止痛活性的筛选(Dooley等人，Science 2662019-2022，1994)。
虽然含有来源于肽和核苷酸的成员的组合文库具有重要的价值，但本领域中仍需要含有不同来源的成员的文库。例如，传统的肽文库在很大程度上仅改变氨基酸序列来产生文库成员。虽然公认肽的二级结构对于生物活性来说是重要的，但这种肽文库并没有赋予它的文库成员受限制的二级结构。
为此目的，某些研究者已尝试用二硫键环化肽以提供更加限制的二级结构(Tumelty等人，J.Chem.Soc.1067-68，1994；Eichler等人，Peptide Res.7300-306，1994)。但是，这种环化肽一般而言仍相当具有柔性，且生物利用度差，因而取得的成功有限。
更为最近地，已开发出更加接近地模拟生物活性蛋白质或肽中发现的回折二级结构的非肽化合物。例如，Kahn的美国专利5,440,013和Kahn的公开的PCT WO94/03494、PCT WO01/00210A1和PCTWO01/16135A2，这些文献公开了模拟回折三维结构的构象限制的非肽化合物。
虽然在构象限制的回折模拟物的合成及鉴定方面取得了显著的进展，但本领域中仍需要模拟肽的二级结构的小分子。本领域中还需要含有这种成员的文库，以及用于合成和筛选针对感兴趣的靶体，特别是生物靶体的库成员的技术，以鉴定生物活性库成员。例如Kahn的美国专利5,929,237及其部分继续美国专利6,013,458还公开了模拟生物活性肽和蛋白质的回折区的二级结构的构象限制的化合物。Obrecht充分综述了构象限制的回折模拟物的合成和鉴定及它们在疾病中的应用(Advances in Med.Chem.，4，1-68，1999)。
本发明也满足这些要求，并通过提供模拟生物活性肽和蛋白质的回折区的二级结构的构象限制的化合物而提供进一步相关的优点。
Wnt信号途径调节多种不同的过程，包括细胞生长、肿瘤发生和发育(Moon等人，1997，Trends Genet.13，157-162；Miller等人，1999，Oncogene 18，7860-7872；Nusse和Varmus，1992，Cell 69，1073-1087；Cadigan和Nusse，1997，Genes Dev.11，3286-3305；Peifer和Polais，2000 Science 287，1606-1609；Polakis 2000，Genes Dev.14，1837-1851)。Wnt信号途径已在多种不同的生物体中作了充分研究。已发现Wnt信号转导引起的TCF4/β-连环蛋白介导的转录的活化在它的生物功能中起重要的作用(Molenaar等人，1996，Cell 86，391-399Gat等人，1998 Cell 95，605-614；Orford等人，1999J.Cell.Biol.146，855-868)。
在不存在Wnt信号的情况下，肿瘤抑制基因腺瘤样息肉及结肠癌基因(APC)同时与丝氨酸激酶糖原合酶激酶(GSK)-3β和β-连环蛋白相互作用(Su等人，1993，Science 262，1734-1737；Yost等人，1996 GenesDev.10，1443-1454；Hayashi等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，242-247；Sakanaka等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，3020-3023；Sakanaka和William，1999，J.Biol.Chem 274，14090-14093)。GSK-3β导致的APC的磷酸化调节APC与β-连环蛋白的相互作用，从而可以调节β-连环蛋白的信号功能(B.Rubinfeld等人，Science 272，1023，1996)。Wnt信号作用稳定β-连环蛋白，使其转移到核，在那里它与转录因子的淋巴细胞增强子因子(LEF1)/T-细胞因子(TCF4)家族的成员相互作用(Behrens等人，1996Nature 382，638-642；Hsu等人，1998，Mol.Cell.Biol.18，4807-4818Roose等人，1999Science 285，1923-1926)。
最近已表明一种已知的致癌基因c-myc是β-连环蛋白/TCF4介导的转录的靶基因(He等人，1998 Science 281 1509-1512；Kolligs等人，1999 Mol.Cell.Biol.19，5696-5706)。许多其它重要的基因，包括也参与肿瘤发生的细胞周期蛋白D1和金属蛋白酶，已确定受TCF4/β-连环蛋白转录途径的调节(Crawford等人，1999，Oncogene18，2883-2891；Shtutman等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，11，5522-5527；Tetsu和McCormick，1999 Nature，398，422-426)。
而且，已发现Wnt信号作用的数种下游介质的超表达调节凋亡(Moris等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，7950-7954；He等人，1999，Cell 99，335-345；Orford等人，1999J.Cell.Biol.，146，855-868；Strovel和Sussman，1999，Exp.Cell.Res.，253，637-648)。APC在人结肠直肠癌细胞中的超表达诱导凋亡s(Moris等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，7950-7954)，β-连环蛋白的异位表达抑制与细胞外基质吸附的丧失有关的凋亡(Orford等人，1999，J.Cell Biol.146，855-868)。TCF4的显性失活突变体表达导致的TCF4/β-连环蛋白转录的抑制阻断Wnt-1-介导的细胞存活，并使细胞对凋亡刺激物如抗癌药具有敏感性(Shaoqiong Chen等人，2001，J.Cell Biol.，152，1，87-96)，而APC突变通过允许构成性survivin表达(一种已知的抗凋亡蛋白质)而抑制凋亡(Tao Zhang等人，2001，Cancer Research，62，8664-8667)。
虽然在人癌中没有发现Wnt基因的突变，但在大部分的结肠直肠肿瘤中发生的APC或β-连环蛋白的突变导致不适当地活化TCF4，超表达c-myc和产生肿瘤生长(Bubinfeld等人，1997，Science，275，1790-1792；Morin等人，1997，Science，275，1787-1790；Casa等人，1999，Cell.Growth.Differ.10，369-376)。在85％的结肠直肠癌和多种其它的癌症中肿瘤抑制基因(APC)丢失或失活(Kinzler和Vogelstein，1996，Cell 87，159-170)，APC的主要作用是Wnt信号转导级联的负调节剂的作用。这种途径的核心特征涉及通过与包括APC在内的基于Axin的大复合体相互作用而调节β-连环蛋白的胞质库的稳定性和定位。这种相互作用导致β-连环蛋白的磷酸化，从而瞄准其以进行降解。
最初在蛋白质相互作用试验中鉴定了CREB结合蛋白质(CBP)/p300，起先通过与转录因子CREB的结合(Chrivia等人，1993，Nature，365，855-859)，后来通过其与腺病毒转化蛋白E1A的相互作用(Stein等人，1990，J.Viol.，64，4421-4427；Eckner等人，1994，Genes.Dev.，8，869-884)。CBP具有参与多种细胞功能包括转录辅激活物功能的潜能(Shikama等人，1997，Trends.Cell.Biol.，7，230-236；Janknecht和Hunter，1996，Nature，383，22-23)。CBP/p300加强β-连环蛋白介导的siamois启动子(一种已知的Wnt靶体)的活化(Hecht等人，2000，EMBO J.19，8，1839-1850)。β-连环蛋白直接与CBP的CREB结合域相互作用，并且β-连环蛋白与CBP协同以刺激TCF4/β-连环蛋白的转录活化(Ken-Ichi Takemaru和Randall T.Moon，2000J.Cell.Biol.，149，2，249-254)。
根据这种背景知识，Wnt途径的TCF4/β-连环蛋白和CBP复合体可以被认为是调节细胞生长、肿瘤发生和细胞凋亡等的靶分子。也就是说，需要通过抑制CBP而阻断TCF4/β-连环蛋白转录途径从而可以用于治疗癌症特别是结肠直肠癌的化合物。
附图的简要说明
图1显示关于本发明的化合物对于SW480细胞的IC50测定的图，其中在不同浓度的实施例4制备的化合物的情况下测定对SW480细胞的细胞生长抑制作用以得到IC50值。具体而言，测定该试验化合物对萤火虫和renilla萤光素酶活性的抑制程度。结果发现该试验化合物抗SW480细胞生长的IC50如表4公开。详细的方法与实施例6公开的方法相同。
发明内容
本发明涉及模拟生物肽和蛋白质回折区的二级结构的构象限制的化合物(这里还称为“回折模拟物”及其相关的化学文库)。本发明还公开包含这种化合物的文库及其合成和筛选方法。
本发明的回折模拟结构可用作生物活性剂，包括(但不限于)用作诊断、预防和/或治疗剂。本发明的回折模拟结构文库可用于鉴定这种生物活性剂。在本发明的实施过程中，所述文库可以包含数十至数百至数千(或更多)的单独的回折结构(这里还称为“成员”)。
本发明的化合物具有以下通式(I)
其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-或-(C＝O)-，W 为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或不存在，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9相同或不同并独立地选自氨基酸侧链部分或其衍生物、所述分子的残余物、连接物和固体载体，以及它们的立体异构体。
在其中的A为-(CHR3)-，B为-(C＝O)-，D为-(CHR5)-， E is-(C＝O)-，而G为-(XR7)n-的实施方案中，本发明的化合物具有下式(II) 其中W、Y和n如以上定义，而R1、R2、R3、R5和R7如在以下详细描述中定义。
在其中的A为-(C＝O)-，B为-(CHRR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，而G为-(C＝O)-(XR9)-的实施方案中，本发明的化合物具有下式(III) 其中W、Y和n如以上定义，Z为氮或CH(如果Z为CH，则X为氮)，而R1、R2、R4、R6和R9如以下详细描述中定义。
在其中的A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，而G为(XR7)n-的实施方案中，本发明的化合物具有以下通式(IV) 其中W、Y和n如以上定义，Z为氮或CH(如果Z为氮，则n为0，而如果Z为CH，则X为氮而n不为0)，而R1、R2、R4、R6和R7如在以下详细描述中定义。
本发明还涉及包含以上式(I)的化合物的文库，以及用于合成这种文库的方法和用于筛选所述文库以鉴定生物活性化合物的方法。还公开了包含本发明的化合物与药学上可接受的载体或稀释剂相组合的组合物。
具体而言，本发明涉及包含这些化合物的药物组合物，用于治疗与Wnt信号途径有关的包括癌症在内的疾病。本发明还涉及用于治疗与Wnt信号途径有关的包括癌症在内的疾病的方法。
参照附图和以下的详述描述将更清楚地看到本发明的这些和其它方面。为此目的，这里引述各种参考资料，它们更为详细地描述某些方法、化合物和/或组合物，并被全部引用作为参考。
以下将更为详细地例示本发明。
在本发明的一个方面，公开了具有下式(I)的回折模拟结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G 为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-或-(C＝O)-，W 为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或不存在，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9相同或不同并独立地选自氨基酸侧链部分或其衍生物、所述分子的残余物、连接物和固体载体，以及它们的立体异构体。
更为具体而言，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9独立地选自氨基C2-5烷基，胍C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代的苯基(其中所述取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、苄基、取代的苄基(其中苄基上的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、萘基、取代的萘基(其中所述取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、双苯基甲基、取代的双苯基甲基(其中所述取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基、取代的吡啶基(其中所述取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基C1-4烷基、取代的吡啶基C1-4烷基(其中所述吡啶取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、嘧啶基C1-4烷基、取代的嘧啶基C1-4烷基(其中所述嘧啶取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代的三嗪-2-基-C1-4烷基(其中所述三嗪取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑C1-4烷基、取代的咪唑C1-4烷基(其中所述咪唑取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基环已基C0-2烷基。
在一个实施方案中，R1、R2、E的R6和G的R7、R8、R9相同或不同，并代表化合物的残余物，而A的R3、B的R4或D的R5选自氨基酸侧链部分或其衍生物。这里所用的术语“化合物的残余物”意指在R1、R2、R5、R6、R7、R8和/或R9位置与回折模拟结构共价连接的任何部分、试剂、化合物、载体、分子、连接物、氨基酸、肽或蛋白质。此术语还包括氨基酸侧链部分及其衍生物。
这里所用的术语“氨基酸侧链部分”代表在天然存在的蛋白质中存在的任何氨基酸侧链部分，包括(但不限于)表1确定的天然存在的氨基酸侧链部分。本发明的其它天然存在的氨基酸侧链部分包括(但不限于)3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羟基赖氨酸、γ-羧基谷氨酸、磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸的侧链部分。此外，糖基化氨基酸侧链也可以用于实施本发明，包括(但不限于)糖基化苏氨酸、丝氨酸和天冬酰胺。
表1
除了天然存在的氨基酸侧链部分之外，本发明的氨基酸侧链部分还包括其多种衍生物。这里所用的氨基酸侧链部分的“衍生物”包括对天然存在的氨基酸侧链部分的修饰和/或改变。例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸侧链部分一般可以归类为低级链烷基、芳基或芳基烷基部分。氨基酸侧链部分的衍生物包括其它直链或支链的、环状或非环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的低级链烷基、芳基或芳基烷基部分。
这里所用的“低级链烷基部分”包含1-12个碳原子，“低级链芳基部分”包含6-12个碳原子，而“低级链芳烷基部分”包含7-12个碳原子。因此，在一个实施方案中，氨基酸侧链衍生物选自C1-12烷基、C6-12芳基和C7-12芳基烷基，而在更优选的实施方案中，选自C1-7烷基、C6-10芳基和C7-11芳基烷基。
本发明的氨基酸侧链衍生物还包括低级链烷基、芳基和芳基烷基部分的取代的衍生物，其中所述取代基选自(但不限于)一个或多个以下化学部分-OH、-OR、-COOH、-COOR、-CONH2、-NH2、-NHR、-NRR、-SH、-SR、-SO2R、-SO2H、-SOR和卤素(包括F、Cl、Br和I)，其中各种情况下的R独立地选自直链或支链的、环状或非环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的低级链烷基、芳基或芳烷基部分。而且，本发明的环状低级链烷基、芳基和芳基烷基部分包括萘，以及杂环化合物如噻吩、吡咯、呋喃、咪唑、唑、噻唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷、吡啶、嘧啶、嘌呤、喹啉、异喹啉和咔唑。氨基酸侧链衍生物还包括低级链烷基和芳烷基部分的烷基部分的杂烷基衍生物，包括(但不限于)烷基和芳烷基膦酸酯和硅烷。
代表性的R1、R2、R5、R6、R7、R8和R9部分具体包括(但不限于)-OH、-OR、-COR、-COOR、-CONH2、-CONR、-CONRR、-NH2、-NHR、-NRR、-SO2R和-COSR，其中各种情况下的R为如以上定义。
在另一个实施方案中，除了作为氨基酸侧链部分或其衍生物(或R1、R2、R5、R6、R7、R8和R9情况下的化合物的剩余物)之外，R1、R2、R5、R6、R7、R8或R9可以是利于化合物与另一部分或化合物连接的连接物。例如，本发明的化合物可以与一种或多种已知的化合物如生物素连接，用于诊断或筛选分析。而且，R1、R2、R5、R6、R7、R8或R9可以是将化合物连接到固体载体(如用于固相肽合成的载体)上的连接物，或者可选择地可以是载体本身。在此实施方案中，与另一部分或化合物或者与固体载体的连接优选在R1、R2、R7或R8位，并更优选在R1或R2位。
在其中的A为-(CHR3)-，B为-(C＝O)-，D为-(CHR5)-，E为-(C＝O)-，G为-(XR7)n-的实施方案中，本发明的回折模拟化合物具有下式(II) 其中R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如以上定义。在一个优选的实施方案中，R1、R2和R7代表化合物的剩余物，而R3或R5选自氨基酸侧链部分。
在其中的A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为-(C＝O)-(XR9)-的实施方案中，本发明的回折模拟化合物具有下式(III) 其中R1、R2、R4、R6、R9、W和X如以上定义，Z为氮或CH(如果Z为CH，则X为氮)。在一个优选的实施方案中，R1、R2、R6和R9代表化合物的剩余物，而R4选自氨基酸侧链部分。在其中的A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为(XR7)n-的更具体的实施方案中，本发明的回折模拟化合物具有下式(IV) 其中R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如以上定义，而Z为氮或CH(如果Z为氮则n为0，而如果Z为CH则X为氮而n不为0)。在一个优选的实施方案中，R1、R2、R6和R7代表化合物的剩余物，而R4选自氨基酸侧链部分。在这种情况下，如果Z和X分别为CH，则R6或R7可以选自氨基酸侧链部分。
本发明的回折模拟结构可以通过使用合适的起始组成分子(以下称为“组成部件”)制备。简言之，在具有式(II)的回折模拟结构的合成中，将第一和第二组成部件偶合形成组合的第一-第二中间产物，如果需要的话，将第三和/或第四组成部件偶合以形成组合的第三-第四中间产物(或者如果可以商购得到的话，可以使用单一的第三中间产物)，然后将组合的第一-第二中间产物和第三-第四中间产物(或第三中间产物)偶合得到第一-第二-第三-第四中间产物(或第一-第二-第三中间产物)，将该产物环化得到本发明的回折模拟结构。可选择地，式(II)的回折模拟结构可以通过在溶液中分步地依次偶合各单独的组成部件或通过在固相肽合成中常用的固相合成依次偶合各单独的组成部件而制备。
在本发明的上下文中，“第一组成部件”具有下式S1 其中R2如以上定义，且R为适用于肽合成的保护基。适宜的R基团包括烷基，且在优选的实施方案中，R为甲基。这些第一组成部件可以容易地由CH(OR)2-CHO或CH(OR)2-CH2-Hal(其中Hal意指卤原子)通过还原胺化或置换H2N-R2的取代反应而合成。
本发明的“第二组成部件”具有下式S2 其中L1为羧基活化基团如卤原子，R4如以上定义，而P为适用于肽合成的氨基保护基。优选的保护基包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁氧基羰基(BOC)、甲氧基羰基(MOC)、9H-芴基甲氧基羰基(FMOC)和烯丙氧基羰基(Alloc)。如果L为-C(O)NHR，则-NHR可以为羧基保护基。N-保护的氨基酸可以商购得到。例如，FMOC氨基酸可以从多种来源获得。这些化合物至本发明的第二组成部件的转化可以容易地通过将N-保护的氨基酸的羧酸基团活化而实现。适宜的活化的羧酸基团包括其中的X为卤化物如氯化物或溴化物的酰基卤，其中的X为酰基如乙酰基的酸酐，反应性酯如N-羟基琥珀酰亚胺酯和五氟代苯基酯，以及其它活化中间产物如在使用碳化二亚胺如二环己基碳化二亚胺(DCC)的偶合反应中形成的活性中间产物。
在氨基酸的叠氮基衍生物用作第二组成部件的情况下，这种化合物可以由对应的氨基酸，通过Zaloom等人(J.Org Chem.465173-76，1981)公开的反应而制备。
可选择地，本发明的第一部件可以具有下式S1′
其中R如以上定义，而L2为离去基团如卤原子或甲苯磺酰基，而本发明的第二部件可以具有下式S2′ 其中R2、R3和P如以上定义。
本发明的“第三组成部件”具有下式S3a或S3b 其中G、E、L1和L2如以上定义。适宜的第三组成部件可从多种来源商购得到，或者可以通过任何已知的有机化学方法制备。
更为具体而言，可以通过以下方法合成式(II)的本发明的回折模拟结构使第一组成部件与第二组成部件反应得到组合的第一-第二中间产物，然后使组合的第一-第二中间产物依次与第三组成部件反应得到组合的第一-第二-第三-第四中间产物，然后将此中间产物环化得到回折模拟结构。
具有结构I′的回折的一般合成可以通过以下技术合成。通过使用偶合试剂如光气将第一组成部件1与第二组成部件2偶合而在N-脱保护后得到如以下例示的组合的第一-第二中间产物1-2 其中R1、R2、R4、R7、Fmoc、Moc和X如以上定义，而Pol代表聚合载体。
本发明的代表性的组成部件的合成如在制备实施例和工作实施例中所述。
式(III)和(IV)的回折模拟结构可以由类似于以上公开的模型组分合成的技术制得，但其中对组成部件进行适当的修饰。
如上述，Kahn等人的USP 6,013,458的回折模拟物可用作生物活性剂，例如诊断、预防和治疗剂。在该USP 6,013,458的实施例9中呈现了代表性回折模拟物的阿片剂受体结合活性，其中发现该发明的回折模拟物有效地抑制放射性标记的脑啡肽衍生物与δ和μ阿片剂受体的结合，其中的数据表明这些回折模拟物作为受体激动剂和潜在的止痛剂的应用。
本发明的回折模拟结构将可用作生物活性剂，例如诊断、预防和治疗剂。
因此，由于根据本发明的化合物具有回折模拟结构，它可以用于调节温血动物中细胞信号传导转录因子相关肽，包括给该动物施用有效量的式(I)的化合物。
而且，本发明的回折模拟结构还可以有效地用于抑制温血动物中肽与PTB域结合；用于调节温血动物中G蛋白质偶联受体(GPCR)和离子通道；用于调节温血动物的细胞因子。
同时，已发现式(I)的化合物特别是式(VI)的化合物有效地抑制或治疗由Wnt信号途径调节的疾病，例如癌症，特别是结肠直肠癌。
其中Ra为具有8-11个环成员的二环芳基，它可以具有1-3个选自氮、氧或硫的杂原子；Rb为具有5-7个环成员的单环芳基，它可以具有1-2个选自氮、氧或硫的杂原子；并且化合物中的芳环可以具有一个或多个选自卤化物、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基。
因此，本发明的一个目的是提供一种包含安全和有效量的具有通式(VI)的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物，所述组合物可以用于治疗由Wnt信号途径特别是TCF4-β-连环蛋白-CBP复合体调节的疾病。
而且，本发明提供一种通过使用上述本发明的组合物而抑制肿瘤细胞生长的方法；一种通过使用上述本发明的组合物而诱导肿瘤细胞凋亡的方法；一种通过使用上述本发明的组合物而治疗由TCF4-β-连环蛋白-CBP复合体调节的疾病的方法；和一种通过施用本发明的组合物以及其它抗癌药如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇、顺铂、丝裂霉素C、替加氟、雷替曲塞、卡培他滨和伊立替康等而治疗癌症如结肠直肠癌的方法。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有如下的(6S，10R)-构型 其中Ra和Rb具有与以上的定义相同的含义。
在本发明的另一方面，公开了包含本发明的回折模拟结构的文库。本发明的文库一旦被组配，则可以筛选鉴定具有生物活性的个体成员。例如，这种对生物活性成员的文库筛选可以包括例如评价库成员的结合活性或评价库成员对功能分析的作用。筛选一般通过使库成员(或库成员的子集)与感兴趣靶体如抗体、酶、受体或细胞系接触来完成。这里将能够与感兴趣靶体相互作用的库成员称为“生物活性库成员”或“生物活性模拟物”。例如，生物活性模拟物可以是能够与抗体或受体结合的库成员，能够抑制酶的库成员，或者能够引发或拮抗例如与细胞系有关的功能反应的库成员。换句话说，对本发明的文库的筛选确定哪些库成员能够与一种或多种感兴趣的生物靶体相互作用。而且，如果发生相互作用，则可以从库成员中鉴定生物活性模拟物。从文库中鉴定单一(或有限数量)的生物活性模拟物得到本身具有生物活性的回折模拟结构，从而用作诊断、预防或治疗剂，并还可以进一步用于显著促进对在这些领域中先导化合物的鉴定。
本发明的文库的肽模拟物的合成可以通过使用已知的肽合成技术，联合本发明的第一、第二和第三组成部件而完成。更为具体而言，可以将任何氨基酸序列加到构象限制的回折模拟物的N-末端和/或C-末端。为此目的，可以在固体载体(如PAM树脂)上通过已知技术(例如参见John M.Stewart和Janis D.Young，Solid Phase PeptideSynthesis，1984，Pierce Chemical Comp.，Rockford，Ill)，或者在甲硅烷基连接的树脂上通过醇添加(参见Randolph等人，J Am Chem.Soc.1175712-14，1995)而合成模拟物。
此外，溶液和固相合成技术的组合可以用于合成本发明的肽模拟物。例如，可以将固体载体用于合成线性肽序列，直至将构象限制的回折加入序列的那一点。然后可以将先前通过溶液合成技术合成的适宜的构象限制的回折模拟结构作为下一个“氨基酸”加到固相合成(即具有N-末端和C-末端的构象限制的回折模拟物可以用作有待加到线性肽上的下一个氨基酸)。在将构象限制的回折模拟物结构引入序列后，可以接着加入另外的氨基酸以完成与固体载体结合的肽。可选择地，线性N-末端和C-末端保护的肽序列可以在固体载体上合成，从载体上移除，然后使用已知的溶液偶合技术在溶液中与构象限制的回折模拟结构偶合。
在本发明的另一方面，公开了用于构建所述文库的方法。传统的组合化学技术(例如参见Gallop等人，J.Med.Chem.371233-1251，1994)允许通过连续地将试剂组合到基本分子骨架而快速地制备大量的化合物。组合技术已用于构建来源于天然存在的氨基酸的肽文库。例如，通过获得20个被适宜保护的和不同的氨基酸的20种混合物，并使每一种与20个氨基酸之一偶合，建立400个(即202)二肽的文库。重复此过程7次导致制备包含大约260亿(即208)个八肽的肽文库。
具体而言，本发明文库的肽模拟物的合成可以使用已知的肽合成技术而完成，例如以下[4，4，0]回折模拟物文库的一般路线 本发明文库的肽模拟物的合成使用具有96孔平板的FlexChemReactor Block通过已知技术完成。在以上路线中，′Pol′代表一种溴乙缩醛树脂(Advanced ChemTech)，而详述的过程如以下例示。
步骤1将溴乙缩醛树脂(37mg，0.98mmol/g)和在DMSO中的R2-胺的溶液(1.4mL)置于具有96孔平板的Robbins block(FlexChem)。将反应混合物于60℃下使用旋转烘箱[Robbins Scientific]振荡12小时。用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤2将在DMF中的可商购得到的Fmoc氨基酸(4当量)、PyBob(4当量)、HOAt(4当量)和DIEA(12当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡12小时后，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤3往反应前通过DMF溶胀的树脂中加入在DMF中的25％哌啶，并将反应混合物于室温下振荡30分钟。再次重复此脱保护步骤，并用DMF、甲醇洗涤树脂，然后用DCM洗涤。将在DMF中的肼酸(hydrazine acid)(4当量)、HOBt(4当量)和DIC(4当量)的溶液加到树脂，并将反应混合物于室温下振荡12小时。用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤4a(其中肼酸为MOC氨基甲酸酯)室温下用甲酸(1.2mL每孔)将步骤3得到的树脂处理18小时。在过滤除去树脂之后，使用SpeedVac[SAVANT]减压浓缩滤液得到产物，为油。用50％水/乙腈稀释产物，然后在冷冻后冻干。
步骤4b(其中Fmoc肼酸用于通过异氰酸酯制备脲)往反应前通过DMF溶胀的树脂加入在DMF中的25％哌啶，并将反应混合物于室温下振荡30分钟。再次重复此脱保护步骤，并用DMF、甲醇洗涤树脂，然后用DCM洗涤。往在反应前通过DCM溶胀的树脂中加入在DCM中的异氰酸酯(5当量)。室温下将反应混合物振荡12小时后，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。用甲酸(1.2mL每孔)于室温下将树脂处理18小时。在过滤除去树脂后，用SpeedVac[SAVANT]减压浓缩滤液得到产物，为油。用50％水/乙腈稀释产物，然后在冷冻后冻干。
步骤4c(其中Fmoc-肼酸用于通过活性氨基甲酸酯制备脲)往反应前通过DMF溶胀的树脂中加入在DMF中的25％哌啶，并将反应混合物于室温下振荡30分钟。再次重复此脱保护步骤，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。往在反应前通过DCM溶胀的树脂中加入在DCM中的氯甲酸对硝基苯基酯(5当量)和二异丙基乙胺(5当量)。在将反应混合物于室温下振荡12小时后，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。往树脂中加入在DCM中的伯胺，在室温下保持12小时，并用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。反应后在室温下用甲酸(1.2mL每孔)将树脂处理18小时。过滤除去树脂后，用SpeedVac[SAVANT]减压浓缩滤液得到产物，为油。用50％水/乙腈稀释产物，然后在冷冻后冻干。
为产生这些构件文库，根据制备实施例例示的方法合成关键的中间产物肼酸。
表2显示了可以根据本发明制备的[4，4，0]回折模拟物文库，其代表性的制备如实施例4给出。
[4，4，0]回折模拟物文库
此外，本发明的文库的肽模拟物的合成可以采用如下的[4，3，0]回折模拟物文库的一般路线完成。
本发明的二环模板文库的肽模拟物的合成使用具有96孔平板的FlexChem Reactor Block通过已知技术完成。在以上的路线中，′Pol′代表溴乙缩醛树脂(Advanced ChemTech)，而详细的过程如下述。
步骤1将溴乙缩醛树脂(1.6mmol/g)和在DMSO中的R1胺的溶液(2M溶液)置于96孔Robbins block(FlexChem)。将反应混合物于60℃下使用旋转烘箱[Robbins Scientific]振荡12小时。用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤2将在DMF中的可商购得到的Fmoc氨基酸(4当量)、PyBob(4当量)、HOAt(4当量)和DIEA(12当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡12小时后，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤3往反应前通过DMF溶胀的树脂中加入在DMF中的25％哌啶。在将反应混合物于室温下振荡30分钟后，再次重复此脱保护步骤，然后用DMF、甲醇洗涤树脂，然后用DCM洗涤。将在DMF中的肼氨基甲酰氯(4当量)、HOBt(4当量)和DIC(4当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡12小时后，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤4往反应前通过DMF溶胀的树脂中加入在DMF中的25％哌啶。在将反应混合物于室温下振荡30分钟后，再次重复此脱保护步骤，然后用DMF、甲醇洗涤树脂，然后用DCM洗涤。将在DCM中的R1-异氰酸酯(5当量)加到反应前通过DCM溶胀的树脂。在将反应混合物于室温下振荡12小时后，用DMF、MeOH洗涤树脂，然后用DCM洗涤。
步骤5室温下用甲酸(1.2mL每孔)将树脂处理18小时。在过滤除去树脂之后，使用SpeedVac[SAVANT]减压浓缩滤液得到产物，为油。用50％水/乙腈稀释产物，然后在冷冻后冻干。
表3显示了可以根据本发明制备的[4，3，0]回折模拟物文库，其代表性的制备如实施例5给出。
[4，3，0]回折模拟物文库
在本发明进一步的另一方面，公开了筛选文库的生物活性和分离生物活性文库成员的方法。对本发明的文库通过多种技术和方法筛选生物活性。一般地，筛选分析可以如下进行(1)使文库的模拟物与感兴趣的生物靶体如受体接触，以使文库的模拟物和靶体之间发生结合，和(2)通过适宜的分析如Lam等人(Nature 35482-84，1991)或Griminski等人(Biotechnology 121008-1011，1994)(这里引用这二者作为参考)所公开的量热分析来检测结合事件。在一个优选的实施方案中，文库成员在溶液中而靶体固定在固相上。可选择地，文库可以固定在固相，并可以通过使其与溶液中的靶体接触而进行探测。
下表4显示从本发明的文库中选择的用于生物活性试验的化合物及其IC50值，所述IC50值是通过实施例6所述的报道基因分析测定的。
所选择的文库化合物的IC50(μM)
在本发明中发现通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物由于其特异性结合CBP而可以抑制CBP介导的癌细胞的转录活化，并且它得到SW480细胞的CBP与本发明的化合物发生免疫沉淀的支持。
本发明的化合物还可以抑制SW480细胞内的survivin表达，从而抑制癌细胞的致癌活性。本发明的化合物可以用于抑制癌细胞，因而可以用于调节细胞生长。支持这些结果的是，本发明的化合物还进一步显示它可以在SW480细胞内诱导caspase-3活化，从而在细胞中诱导凋亡活性。本发明的化合物还可以有利地用于诱导细胞的凋亡。
为证明癌细胞的致癌活性，通过以下方法进行体外MTS细胞毒性分析试验。
细胞毒性试验将SW480或HCT116细胞置于96孔微平板(104细胞/孔)，并在37℃下培养24小时。用不同浓度的TCF4化合物对细胞处理24小时。将20μl MTS溶液(Promega)加到每孔，并在37℃下培养2小时。通过使用微平板读板器(Molecular Device)读取在490nm下的吸光率来测定细胞生存力，并计算每种浓度化合物的细胞毒性。
生长抑制分析将SW480或HCT116细胞置于96孔微平板(104细胞/孔)，并在37℃下培养24小时。将20μl的[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐](MTS)溶液(Promega)加到每孔，并在37℃下培养2小时后读取吸光率(阴性对照)，然后用不同浓度的TCF4化合物对细胞处理48小时。将20μl MTS溶液(Promega)加到每孔，并在37℃下培养2小时。通过使用微平板读板器(Molecular Device)在490nm下读取吸光率来测定细胞生存力，并计算每种浓度化合物的细胞毒性。
所选择的文库化合物的致癌活性的结果如表5所示。
通过对所选择的文库化合物进行MTS或硫罗丹明B(sulforhodamine B)分析而得到的致癌活性
在本发明的另一方面，公开了一种包含具有通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物的药物组合物。对于含有本发明化合物的药物组合物的制备，本领域技术人员可以使用相关领域中已知的公知知识和技术。公知的多种载体和其它添加剂可以用于制备本发明的组合物。本发明的药物组合物可以标准方式给药以用于待治疗的病症，例如通过口服、直肠给药或肠胃外给药。
对于这些目的，本发明的化合物可以通过本领域中已知的方法制成诸如以下的形式片剂、胶囊、水溶液或油溶液或悬浮液、(脂质)乳液、可分散粉末、栓剂、药膏、乳霜、滴剂和无菌注射水溶液或油溶液或悬浮液。
适宜的本发明的药物组合物是适于以单元剂型口服的药物组合物，如含有大约1mg至大约1g本发明化合物的片剂或胶囊。
另一方面，本发明的药物组合物是适于静脉内、皮下或肌内注射的药物组合物。例如患者可以接受大约1μg/kg至大约1g/kg静脉内、皮下或肌内剂量的本发明化合物。可以通过推注的方式施用静脉内、皮下和肌内剂量。可选择地，可以通过在一段时间内连续输注来施用静脉内剂量。
可选择地，患者接受大约等于每日肠胃外剂量的日口服剂量，每天施用组合物1-4次。
下表例示在人类中进行治疗或预防应用的包含化合物或其药学上可接受的盐的代表性药物剂型
包含通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物的药物组合物可以用于治疗由Wnt信号途径调节的疾病，特别是癌症，更具体是结肠直肠癌。
在本发明的另一方面，公开了一种用于抑制受试者肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向细肿瘤细胞施用安全和有效量的本发明的化合物。包含这种化合物的组合物还可以用于抑制肿瘤细胞。因此，这种方法可以用于治疗哺乳动物受试者的癌症。它可以有利地用于治疗结肠直肠癌。
在本发明的另一方面，公开了一种用于治疗由Wnt信号途径调节的疾病的方法，其中所述方法包括给患者施用安全和有效量的具有通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物。包含本发明的化合物的药物组合物也可以用于此目的。在这一点上，在本发明中发现具有通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物或包含它的药物组合物可以用于治疗由TCF4-β连环蛋白-CBP复合体调节的疾病，所述复合体被认为负责引发与Wnt信号途径有关的癌细胞的超表达。因此，本发明的另一方面提供一种使用具有通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物治疗由TCF4-β连环蛋白-CBP复合体调节的疾病的方法。
而且，由于癌症的治疗还与诱导受试者癌细胞发生凋亡密切相关，因此本发明还涉及一种使用通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物诱导癌细胞凋亡的方法。
根据现有技术已知5-FU[氟尿嘧啶；5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮]可以诱导培养的口癌细胞发生凋亡(D.Tong等人，Oral Oncology36，2000236-241)。而且还已知结肠癌对5-FU有敏感性(D.Arango等人，Cancer Research 61，2001 4910-4915)。因此在本发明中，制备具有确定的抗癌活性的5-FU与本发明的式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物的组合，并针对SW480细胞系进行试验。结果发现5-FU与本发明化合物，特别是TCF4化合物的组合对抑制癌细胞生长如SW480细胞有显著的作用。
因此，本发明的另一方面是提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括给受试者施用安全和有效量的权利要求1的具有通式(I)的化合物，特别是通式(VI)的化合物，以及其它抗癌剂如5-Fu。
已表明本发明的化合物抑制survivin的表达。Blanc-Brude等人，Nat.Medicine 8987(2002)已表明survivin是平滑肌细胞凋亡的关键调节剂，它在病理性管壁重塑中起重要作用。因此，本发明另一方面提供一种治疗或预防与血管成形术有关的再狭窄的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的本发明的回折模拟物。在一个实施方案中，本发明治疗再狭窄，即给患有再狭窄的受试者施用本发明的回折模拟物实现再狭窄的严重性、范围或程度等的减轻。在另一个实施方案中，本发明预防再狭窄，即给预期会发生新的或额外的再狭窄的受试者施用本发明的回折模拟物实现再狭窄的预期严重性、范围或程度等的减轻。任选所述受试者为哺乳动物受试者。
已表明本发明的化合物抑制TCF/B-连环蛋白转录。Rodova等人，J.Biol.Chem.27729577(2002)已表明PKD-1启动子是B-连环蛋白/TCF途径的靶体。因此，本发明另一方面提供一种治疗或预防多囊性肾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的本发明的回折模拟物。在一个实施方案中，本发明治疗多囊性肾病，即给患有多囊性肾病的受试者施用本发明的回折模拟物实现多囊性肾病的严重性、范围或程度等的减轻。在另一个实施方案中，本发明预防多囊性肾病，即给预期会发生新的或额外的多囊性肾病的受试者施用本发明的回折模拟物实现多囊性肾病的预期严重性、范围或程度等的减轻。任选所述受试者为哺乳动物受试者。
已表明本发明的化合物抑制Wnt信号作用的表达。Hanai等人，JCell Bio.158529(2002)已表明一种已知的抗血管生成因子血管内皮抑素(endostatin)抑制Wnt信号作用。因此，本发明另一方面提供一种治疗或预防异常血管生成疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的本发明的回折模拟物。在一个实施方案中，本发明治疗异常血管生成疾病，即给患有异常血管生成疾病的受试者施用本发明的回折模拟物实现异常血管生成疾病的严重性、范围或程度等的减轻。在另一个实施方案中，本发明预防异常血管生成疾病，即给预期会发生新的或额外的异常血管生成疾病的受试者施用本发明的回折模拟物实现异常血管生成疾病的预期严重性、范围或程度等的减轻。任选所述受试者为哺乳动物受试者。
已表明本发明的化合的抑制Wnt信号作用的表达。Sen等人，P.N.A.S.(USA)972791(2000)已表明患类风湿性关节炎的哺乳动物表现出RA滑液组织中的Wnt和Fz表达增加。因此，本发明另一方面提供一种治疗或预防类风湿性关节炎疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的本发明的回折模拟物。在一个实施方案中，本发明治疗类风湿性关节炎疾病，即给患有类风湿性关节炎疾病的受试者施用本发明的回折模拟物实现类风湿性关节炎疾病的严重性、范围或程度等的减轻。在另一个实施方案中，本发明预防类风湿性关节炎疾病，即给预期会发生成新的或额外的类风湿性关节炎疾病的受试者施用本发明的回折模拟物实现类风湿性关节炎疾病的预期严重性、范围或程度等的减轻。任选所述受试者为哺乳动物受试者。
已表明本发明的化合物抑制Wnt信号作用的表达。Uthoff等人，Int.J.Oncol 19803(2001)已表明在溃疡性结肠炎(与局限性回肠炎患者相比)中发生差别上调紊乱fz(Wnt途径分子)。因此，本发明另一方面提供一种治疗或预防溃疡性结肠炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的本发明的回折模拟物。在一个实施方案中，本发明治疗溃疡性结肠炎，即给患有溃疡性结肠炎的受试者施用本发明的回折模拟物实现溃疡性结肠炎的严重性、范围或程度等的减轻。在另一个实施方案中，本发明预防溃疡性结肠炎，即给预期会发生新的或额外的溃疡性结肠炎的受试者施用本发明的回折模拟物实现溃疡性结肠炎的预期严重性、范围或程度等的减轻。任选所述受试者为哺乳动物受试者。
本发明的最佳实施方式以下非限制性实施例例示本发明的化合物、组合物和应用方法。
实施例制备实施例1(N-Fmoc-N′-R3-肼基)-乙酸的制备(1)N-Fmoc-N’-甲基肼的制备 给2L、双颈、圆底烧瓶配备一个玻璃塞和一个钙管。加入在THF(300mL)中的硫酸甲基肼(20g，139mmol)溶液和加入在THF中的DiBoc(33g，153mmol)的溶液。在2小时内通过加液漏斗滴加饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)并剧烈搅拌。6小时后，缓慢加入在THF中的Fmoc-Cl(39g，153mmol)的溶液。将所得的悬浮液于0℃下搅拌6小时。用EA(500mL)萃取混合物，并保留有机层。用硫酸钠干燥溶液并真空蒸发。不经纯化继续进行下一步骤。
给1L、双颈、圆底烧瓶配备一个玻璃塞和一个钙管。加入在MeOH(300mL)中的反应混合物的溶液，通过加液漏斗缓慢加入浓HCl(30mL，12N)并在冰水浴中磁力搅拌，并搅拌过夜。用EA(1000mL)萃取混合物，并保留有机层。用硫酸钠干燥溶液，并真空蒸发。用正己烷和EA将残余物结晶纯化得到产物(32.2g，83％)。
1HNMR(DMSO-D6)δ7.90-7.88(d，J＝6Hz，2H，)，δ7.73-7.70(d，J＝9Hz，2H，)，7.44-7.31(m，4H)，4.52-4.50(d，J＝6Hz，2H)，4.31-4.26(t，J＝6Hz，1H)，2.69(s，1H)(2)(N-Fmoc-N′-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯的制备
给1L、双颈、圆底烧瓶配备一个玻璃塞和与一个钙管连接的回流冷凝器。加入在甲苯(300mL)中的N-Fmoc-N′-甲基-肼(20g，75mmol)的溶液。缓慢加入在甲苯(50mL)中的叔丁基溴乙酸酯(22g，111mmol)的溶液。缓慢加入Cs2CO3(49g，149mmol)。缓慢加入NaI(11g，74mmol)，并剧烈搅拌。将反应混合物于回流温度下搅拌1天。将混合物过滤，并用乙酸乙酯[EA](500mL)萃取有机层。用硫酸钠干燥溶液，并真空蒸发。用己烷∶EA＝2∶1溶液将产物作色谱纯化得到产物(19.8g，70％)。
1H-NMR(CDCl3-d)δ7.78-7.75(d，J＝9Hz，2H，)，δ7.61-7.59(d，J＝6Hz，2H，)，7.43-7.26(m，4H)，4.42-4.40(d，J＝6Hz，2H)，4.23(b，1H)，3.57(s，2H)，2.78(s，3H)，1.50(s，9H)(3)(N-Fmoc-N′-甲基-肼基)-乙酸的制备 给1L、双颈、圆底烧瓶配备一个玻璃塞和一个与钙管连接的回流冷凝器。加入(N-Fmoc-N′-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(20g，52mmol)。缓慢加入HCl溶液(150mL，4M在二烷中的溶液)并在冰水浴中剧烈搅拌。将反应混物于RT下搅拌1天。将溶液于40℃进行减压完全浓缩。加入饱和NaHCO3水溶液(100mL)，并用二乙醚(100mL)洗涤水层。在0℃下缓慢滴加浓HCl(pH2-3)。萃取混合物，并保留有机层(500mL，MC)。用硫酸钠干燥溶液并真空蒸发。用正己烷和乙酸乙酯将残余物重结晶纯化得到产物(12g，72％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ12.38(s，1H)，8.56(b，1H)，7.89-7.86(d，J＝9Hz，2H，)，δ7.70-7.67(d，J＝9Hz，2H，)，7.43-7.29(m，4H)，4.29-4.27(d，J＝6Hz，2H)，4.25-4.20(t，J＝6Hz，1H)，3.47(s，2H)，2.56(s，3H)
制备实施例2(N-Moc-N′-R7-肼基)-乙酸的制备(1)(N′-甲氧基羰基-肼基)-乙酸乙酯的制备 将肼基甲酸甲酯(50g，0.55mol)溶于DMF(300ml)，然后将溴乙酸乙酯(68ml，0.555mol)、碳酸钾(77g，0.555mol)加到反应容器。将混合物加热到50℃持续5小时。在反应完成后，将混合物过滤，用EtOAc稀释，并用盐水洗涤(3次)。用柱纯化粗产物(洗脱剂Hex/EtOAc＝4/1)。
Pdt72g(无色油)(2)[N-R7-N′-甲氧基羰基-肼基]-乙酸乙酯 将乙酯(10g，0.05mol)、碳酸钾(6.9g，0.05mol)和R3-溴化物(14.1g，0.06mol)溶于DMF(200ml)，并将混合物加热至50℃持续5小时。反应完成后，将混合物过滤，用EA稀释，并用盐水洗涤(3次)。用色谱法(洗脱剂Hex/EtOAc＝4/1)纯化粗产物。
(3)[N-R7-N′-甲氧基羰基-肼基]-乙酸 将烷基化乙酯(9.5g，0.03mol)溶于THF/水(1/1，ml)，并在0℃下加入2N NaOH(28.3ml)溶液。将混合物于RT下搅拌2小时。在用UV检测不到原料酯后，用EA稀释溶液，然后分离。用1N HCl将水层酸化至pH 3-4，并用DCM萃取化合物(3次)。用MgSO4干燥合并的有机层，并蒸发得到一种黄色固体。
实施例1(1)Nβ-Moc-Nα-苄基-肼基甘氨酸的制备
根据文献方法制备此化合物。(Cheguillaume等人，Synlett 2000，3，331)(2)1-甲氧基羰基-2，8-二苄基-6-甲基-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪的制备 将溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)和在DMSO中的苄基胺溶液(2.5ml，2M)放置在带螺帽的小瓶中。在60℃下使用旋转烘箱[RobbinsScientific]将反应混合物振荡12小时。过滤收集树脂，用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。
将在NMP(Advanced ChemTech)中的Fmoc-丙氨酸(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)和DIEA(4当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡4小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
往树脂中加入在DMF中的20％哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将在DMF中的Nβ-Moc-Nα-苄基-肼基甘氨酸(4当量)、HOBT[Advanced Chem Tech](4当量)和DIC(4当量)的溶液加到以上制备的树脂。在室温下将反应混合物振荡3小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。在室温下真空干燥树脂。
用甲酸(2.5ml)将树脂于室温下处理18小时。过滤除去树脂之后，减压浓缩滤液得到产物，为油。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.51(d，3H)，2.99(m，1H)，3.39(d，1H)，3.69(m，1H)，3.75(m，1H)，3.82(s，3H)，4.02(d，1H)，4.24(d，1H)，4.39(d，1H)，4.75(d，1H)，5.14(q，1H)，5.58(dd，1H)，7.10-7.38(m，10H)。
实施例2(1)N′-Fmoc-N-甲基-肼基羰基氯化物的制备 将在15ml CH2Cl2和15ml饱和NaHCO3水溶液中的N-甲基肼甲酸9H-芴-9-基甲酯(107mg，0.4mmol)的冰冷的二相混合物快速搅拌，并一次性加入在甲苯(1.03ml，2mmol)中的1.93M光气。将反应混合物搅拌30分钟，收集有机相，用CH2Cl2萃取水相。用MgSO4干燥合并的有机相，过滤并减压浓缩得到128mg(97％)氨基甲酰氯，为一种泡沫固体。[注意光气蒸气是高毒性的。在通风罩中使用它]。将此产物不经进一步纯化用于以下固相合成。
(2)2，5-二甲基-7-苄基-3，6-二氧代-六氢-[1，2，4]三唑并[4，5-a]吡嗪-1-甲酸苄基酰胺的制备
将溴乙缩醛树脂(30mg，0.98mmol/g)和在DMSO中的苄基胺溶液(1.5ml，2M)放置在带螺帽的小瓶中。在60℃下使用旋转烘箱[RobbinsScientific]将反应混合物振荡12小时。过滤收集树脂，用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。
将在NMP(Advanced ChemTech)中的Fmoc-丙氨酸(3当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](3当量)和DIEA(3当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡4小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
往树脂中加入在DMF中的20％哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将在DCM中的以上步骤(1)得到的N’-Fmoc-N-甲基-肼基羰基氯化物(5当量)、DIEA(5当量)的溶液加到以上制备的树脂。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM和DMF洗涤。
往树脂中加入在DMF中的20％哌啶(对于1g树脂为10ml)。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
室温下用在DCM中的异氰酸苄基酯(4当量)和DIEA(4当量)的混合物将树脂处理4小时。然后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。室温下将树脂真空干燥。
室温下用甲酸将树脂处理14小时。过滤除去树脂后，将滤液减压浓缩得到产物，为一种油。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.98(s，3H)，3.18(m，1H)，3.46(m，1H)，4.37-4.74(m，5H)，5.66(dd，1H)，6.18(m，1H)，7.10-7.40(m，10H)。
实施例32，5，7-三甲基-3，6-二氧代-六氢-[1，2，4]三唑并[4，5-a]吡嗪-1-甲酸苄基酰胺根据与实施例2相同的方法制备标题化合物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.99(s，3H)，3.03(s，3H)，3.38(m，1H)，3.53(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.52(q，1H)，4.59(dd，1H)，5.72(dd，1H)，6.19(br.t，1H)，7.10-7.38(m，5H)。
实施例42-甲基-5-(对羟基苯基甲基)-7-萘基甲基-3，6-二氧代-六氢-[1，2，4]三唑并[4，5-a]吡嗪-1-甲酸苄基酰胺的制备将溴乙缩醛树脂(30mg，0.98mmol/g)和在DMSO中的萘基甲基胺溶液(1.5ml，2M)放置在带螺帽的小瓶中。在60℃下使用旋转烘箱[Robbins Scientific]将反应混合物振荡12小时。过滤收集树脂，用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。
将在NMP(Advanced ChemTech)中的Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](3当量)和DIEA(3当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡4小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
往树脂中加入在DMF中的20％哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将在DCM中的N’-Fmoc-N-甲基-肼基羰基氯化物(5当量)、DIEA(5当量)的溶液加到以上制备的树脂。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM和DMF洗涤。
往树脂中加入在DMF中的20％哌啶(对于1g树脂为10ml)。室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，用DMF、DCM洗涤树脂，然后用DMF洗涤。
室温下用在DCM中的异氰酸苄基酯(4当量)和DIEA(4当量)的混合物将树脂处理4小时。然后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。室温下将树脂真空干燥。
室温下用甲酸将树脂处理14小时。过滤除去树脂后，将滤液减压浓缩得到产物，为一种油。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.80-2.98(m，5H)，3.21-3.37(m，2H)，4.22-4.52(m，2H)，4.59(t，1H)，4.71(d，1H)，5.02(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.51(d，1H)，6.66(t，2H)，6.94(dd，2H)，7.21-8.21(m，12H).
实施例52-甲基-6-(对羟基苯基甲基)-8-萘基-4，7-二氧代-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-甲酸苄基酰胺的制备将溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)和在DMSO中的萘基胺溶液(2.5ml，2M)放置在带螺帽的小瓶中。在60℃下使用旋转烘箱[RobbinsScientific]将反应混合物振荡12小时。过滤收集树脂，用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。
将在NMP(Advanced ChemTech)中的Fmoc-Tyr(OBut)-OH(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)和DIEA(4当量)的溶液加到树脂。在将反应混合物于室温下振荡4小时后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
往树脂中加入在DMF中的20％哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
将在DMF中的Nβ-Fmoc-Nα-苄基-肼基甘氨酸(4当量)、HOBT[Advanced ChemTech](4当量)和DIC(4当量)的溶液加到以上制备的树脂。室温下将反应混合物振荡3小时后，过滤收集树脂，并用DMF洗涤，然后用DCM洗涤。往树脂中加入在DMF中的20％哌啶(对于1g树脂为10ml)。室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用DMF洗涤。
室温下用在DCM中的异氰酸苄基酯(4当量)和DIEA(4当量)的混合物将树脂处理4小时。然后，过滤收集树脂，并用DMF、DCM洗涤，然后用MeOH洗涤。室温下将树脂真空干燥后，室温下用甲酸(2.5ml)将树脂处理18小时。过滤除去树脂，并减压浓缩滤液得到产物，为一种油。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm2.73(s，3H)，3.13(d，1H)，3.21-3.38(m，3H)，3.55(d，1H)，3.75(t，1H)，4.22(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.79(d，1H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.68(d，2H)，6.99(d，2H)，7.21-8.21(m，12H)；MS(m/z，ESI)564.1(MH+)586.3(MNa+).
实施例6关于测定针对SW480细胞的IC50的生物分析和对细胞系的细胞毒性试验通过以下方法进行试验化合物已在实施例4中制备。
报道基因分析用SuperfectTM转染试剂(Qiagen，301307)转染SW480细胞。在转染前1天简单将细胞胰蛋白酶消化，并将其置于6孔平板(5×105细胞/孔)，从而使它们在转染当天50-80％汇合。
在150μl不含血清的培养基中稀释4微克(TOPFlash)和1微克(pRL-null)的DNA，并加入30μl SuperfectTM转染试剂。在室温下将DNA-Superfect混合物培养15分钟，然后将1ml 10％FBS DMEM加到此复合体中进行另外3小时的培养。在形成复合体时，用不含抗生素的PBS将细胞洗涤二次。
将DNA-SuperfectTM转染试剂复合体应用于细胞，然后在37℃和5％CO2中培养3小时。培养后，加入含10％FBS的恢复培养基，以使最终体积为1.18ml。进行3小时培养后，收获细胞，并再接种到96孔平板(3×104细胞/孔)。在37℃和5％CO2中培养过夜后，用试验化合物将细胞处理24小时。最后，通过荧光素酶分析(Promega，E1960)检查活性。
图1例示以上化合物对SW480细胞的IC50的测定结果。
硫罗丹明B(SRB)分析通过硫罗丹明B分析测定以上化合物对下列细胞的生长抑制作用。将在100μl培养基中的SW480细胞置于96孔平板的每孔，并使其附壁24小时。将化合物加到孔中以得到期望的最终浓度，并将平板于37℃下培养48小时。然后通过缓慢地将100μl冷的(4℃)10％三氯乙酸加到每孔，随后在4℃下培养1小时而固定细胞。用去离子水将平板洗涤5次，并使其风干。然后通过将100μlSRB溶液(在1％乙酸(v/v)中的0.4％SRB(w/v))加至孔中15分钟而将细胞染色。染色后，用1％乙酸快速洗涤平板5次以除去任何未结合的染料，并将其风干。用10mmol/L Tris碱(pH 10.5)将结合的染料溶解，然后对平板读数。在读板机上，在515nm的波长下，用Molecular Device读取光密度(OD)。生长抑制表示为相对生存力(％对照)，并在log/概率转化之后由浓度-反应曲线计算GI50。
实施例4得到的化合物的体外细胞毒性(SRB)分析
可以理解，虽然这里已为例示的目的描述了本发明的特定实施方案，但可以在不背离本发明的构思和范围的情况下作出多种改型。因此，除所附的权利要求之外本发明不受限制。
工业实用性模拟生物活性肽和蛋白质的回折区的二级结构的本发明的化合物可以抑制survivin的表达、TCF/B-连环蛋白转录和Wnt信号作用的表达。因此，本发明可以提供一种用于抑制哺乳动物受试者肿瘤细胞生长，与其它抗肿瘤药联合治疗癌症，治疗或预防疾病如与血管成形术有关的再狭窄、多囊性肾病、异常血管生成疾病、类风湿性关节炎疾病和溃疡性结肠炎的药物组合物和/或方法，以及一种鉴定生物活性化合物的方法，和化合物文库。
权利要求
1.具有以下通式(I)的化合物 其中A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为-(XR7)n-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或不存在，Y为氧或硫，X和Z为CH，n＝1；而R1、R2、R4、R6和R7相同或不同并且独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链衍生物、连接物和固体载体。
2.权利要求1的化合物，其中R1、R2、R4、R6和R7独立地选自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代的苯基(其中所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、苄基、取代的苄基(其中苄基上的取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、萘基、取代的萘基(其中所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、双苯基甲基、取代的双苯基甲基(其中所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、吡啶基、取代的吡啶基(其中所述取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、吡啶基C1-4烷基、取代的吡啶基C1-4烷基(其中所述吡啶取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、嘧啶基C1-4烷基、取代的嘧啶基C1-4烷基(其中所述嘧啶取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代的三嗪-2-基-C1-4烷基(其中所述三嗪取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、咪唑C1-4烷基、取代的咪唑C1-4烷基(其中所述咪唑取代基独立地选自氨基、脒基、胍基、肼基、氨基腙基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟代C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基中的一个或多个)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基环己基C0-2烷基。
3.权利要求2的化合物，其中R1、R2、R4、R6或R7连接到固体载体或固体载体衍生物上。
4.一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项的化合物和药学上可接受的载体。
5.权利要求1-3之任一项的化合物在制备用于抑制哺乳动物受试者肿瘤细胞生长的药物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述肿瘤细胞为结肠直肠细胞。
7.权利要求1-3之任一项的化合物与其它抗肿瘤药组合在制备治疗癌症的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述抗肿瘤药选自5-FU、紫杉醇、顺铂、丝裂霉素C、替加氟、雷替曲塞、卡培他滨和伊立替康。
9.权利要求1-3之任一项的化合物在制备治疗或预防与血管成形术有关的再狭窄的药物中的用途。
10.权利要求1-3之任一项的化合物在制备治疗或预防多囊性肾病的药物中的用途。
11.权利要求1-3之任一项的化合物在制备治疗或预防异常血管生成疾病的药物中的用途。
12.权利要求1-3之任一项的化合物在制备治疗或预防类风湿性关节炎疾病的药物中的用途。
13.权利要求1-3之任一项的化合物在制备治疗或预防溃疡性结肠炎的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了模拟生物活性肽和蛋白质回折区的二级结构的构象限制的化合物。这种回折模拟结构具有广泛的应用领域，包括用作诊断和治疗剂。还公开了包含本发明的回折模拟结构的文库以及用于筛选它们以鉴定生物活性成员的方法。本发明还涉及这种化合物用于抑制或治疗由Wnt信号途径调节的疾病例如癌症特别是结肠直肠癌、与血管成形术有关的再狭窄、多囊性肾病、异常血管生成疾病、类风湿性关节炎疾病或溃疡性结肠炎的应用。
文档编号A61P13/00GK1872857SQ20061009378
公开日2006年12月6日 申请日期2002年10月11日 优先权日2001年10月12日
发明者M·卡恩, M·江口, S－H.·文, J-U·钟, S-C·李, K-W·郑 申请人:中外药品株式会社