槲皮素-7-o-葡萄糖甙在柘木或其制剂质量控制中的应用的制作方法

专利名称：：槲皮素-7-o-葡萄糖甙在柘木或其制剂质量控制中的应用的制作方法槲皮素-7-0-葡萄糖甙在柘木或其制剂质量控制中的应用駄鰣本发明涉及一种已知化合物的新用途，具体涉及槲皮素-7-0-葡萄糖甙在柘木或其制剂质量控制中的应用。背晕技术柘木为桑科柘属植物Cudraniatricuspidata(Carr.)Bun.落叶灌木或小乔木，其功能为清热凉血，近代民间用于消化道肿瘤。主要化学成分为黄酮类、氧杂蒽酮类、木脂素、香豆素及多糖类化合物，70年代至90年代，国内外学者(中日韩)对柘木抗癌作用进行研究，基本确认黄酮类化合物是柘木抗癌、抑癌有效成分，多糖参与了免疫调节，对抗癌具有协同作用。在国内，有关柘木的药品开发始于60年代，研发成功的制剂有糖浆剂，该剂型己被收载于部颁药品标准，经临床使用，证实柘木糖浆对消化道肿瘤患者化疗或放疗有辅助治疗作用，并能改善病人的生活质量。此外，CN1515294则公开了含柘木的固体制剂及其制备方法。然而，目前柘木制剂的质控体系还不够完善，检测指标单一，没有形成一个更严格的质控体系，在这样的质控体系下，仍然难以保证产品的质量稳定，这与中药现代化并走向国际的发展方向是不相适应。7-葡萄糖-山奈酚甙(populnin)是目前用于柘木制剂质控的唯一黄酮甙成分，这在专利申请文件CN1515294及CN1726962中均有报道。然而，7-葡萄糖-山奈酚即山柰酚-7_0~葡萄糖甙不仅存在于柘木(Cudraniatricuspidata)中(张月华等，医药工业(3):15-20,1980),其它植物中也存在该化合物，如国外木贼属植物Equiset咖telmateta(K.R.MarkhametalTetrahedron34:1389-1397,1978)、火炭母草叶(polygonumChineseL.)(CA1977，87:180733U)、景天属植物SedumTerhata(JATRCKJ.CAKUEBruttonia33(4):498-507,1981)、蒙药广枣(choerospondiasaxillaris)(邓丽嘉等中草药105(3):8-9，1989)、牡丹花(Paeoniasuffrutixosa)(XiaoWANGetalJ.ofchromatogr.A1075(1-2):127-131，2005)、国外大戟科植物Chamaesyceprostrate(RojassetalPlantaMedic65(5):478-478,1999)、国外白花丹科植物Limoniastrummonopetatum(HMRasmanetalPlantaMedica72(10):1055,2006)、国外植物Metamaraetamsubsp.gussonei叶及种子中(F.confatietalphytotherapyResearch18(7):585-587,2004)。欧洲植物数据库记载(http-//www.liberherhar咖.com)在Althaeaofficinalis的花、Brassicanigra的叶、Centaureacyanus的茎、积血草(Centellaasiatice)的叶、问荆(Equisetumarvense)的茎、银杏(Ginkgobiloba)的茎、Madicagosative的莲叶、Macluraurantiaca的叶、Serenoarepensd的花、Thespesiapopulnea的花以及葡萄(Vitisvinifera)叶含有populnin。因此可以认为该成分并非柘木独有，虽然质控过程中对这个单一成分进行检测是一种技术进步，但它并非是最为理想的程度，因此继续寻找其它的检测指标，探索并建立一种更为科学、合理的药品质量保障体系仍具有积极的现实意义。槲皮素-7-0-葡萄糖甙早期报道存在于锦葵科植物陆地棉(Gosspiumhirsutura)和棉属(Gosspi咖)其它种类植物花中(《天然活性成分简明手册》孙文基绳金房主编，北京中国医药科技出版社，1998，7ISBN7-5067-5)，以后陆续报道，在澳洲栽培的心形益母草(LeonuruscardiacaL.)(kartiigTetalJ.Natprod48:494,1985)、藏药蒸倒牛(Biebersteiniaheterost簡nMaxim)(张晓峰等药学学报30(3):211-214，1995)、红花叶(CarthamustimctriusL)(YaginumaSatoeetalBiosciencebiotechnologyandbiochemistry67(8):1691-1698,2003)、蒲公英(Taraxacummongolic咖)同属品种TaraxacumofficinaleWEB.exWPGG(KatrinSchutzetalRapidCommunicationinMaxSpectrometry19(2):179-186，2004)、豇豆种皮(Bigussinensis)(QichangetalJ.AgricFoodchem52(22):6694，2004)、夏枯草(Prunellavulgaris)(I.S.DmitruketalChemofNaturalCompounds23(3):374-375,2004)以及日本桃叶珊瑚(Aucubajaponica)(TsukasaIwashinaJ.ofJapaneseBotany72(6):337-346,1997)中也有该成分存在。据欧洲植物数据库记载(http://www.liberherharum.com),在Artemisiaannua的根茎、Brassicanigra的叶、Centaureac，us的基、Chamomi11arecutita的花、Gossypiumsp的花、paeonialactflora的叶、Pinussilvestris的叶、Salixalba的莲皮及taraxacumofficinale的花也有槲皮素-7-0-葡萄糖甙成分。本发明人在柘木有效成分分离中获得了槲皮素-7-0-葡萄糖甙，根据上述文献的比较分析，植物中除了柘木同时含有山柰酚-7-0-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-葡萄糖武二成分外，至今尚未见其它植物品种同时含有上述二成分的报道，对此发明人认为若能在柘木及其制剂质控中同时检测上述二成分，不仅能显著提高质控项目专属性，而且扩大了有效成分控制数量，有利于进一步完善柘木及其制剂的质量控制体系。基于上述设想，发明人通过研究，建立了槲皮素-7-0-葡萄糖甙和山柰酚-7-O"葡萄糖甙作为柘木制剂质控指标的方法。
发明内容本发明的目的是公开槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的新用途，即在柘木或柘木制剂质量控制中的应用。本发明的另一目的是公开一种柘木或柘木制剂的质量控制方法。本发明第一方面，公开了槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙在柘木或拓木制剂质量控制中的应用。发明人在柘木水溶性成分分离中获得了槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙单体。关于槲皮素和山奈酚以及它们的糖甙化合物，国际上普遍认为具有抗氧化、抗炎、抗心血管疾病以及抗癌等生理活性(ElliottMiddletonetalPharmacologicalReviews52(4):673-751，2002)，这些功效成分也与柘木的功效相符，因此发明人认为，槲皮素-7-0-D-葡萄糖甙完全符合作为柘木或柘木制剂的质控指标的要求，可以用于柘木或柘木制剂的质量控制。同时，与山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙指标成分相结合，该质控方法不仅提高了项目的专属性，而且扩大了有效成分控制数量，有利于完善柘木及其制剂质控体系。发明人经大量研究，给出了从柘木中分离槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙的方法，并建立了如何将槲皮素-7-0"e-d-葡萄糖甙用作柘木或柘木制剂的质控指标的具体方法，包括槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙的鉴别及定量，这部分内容在发明人公开的柘木或柘木制剂的质量控制方法中有详细的阐述。本发明第二方面，公开了一种柘木或柘木制剂的质量控制方法，包括检测槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙的含量。较佳的，槲皮素-7-0-e_d-葡萄糖甙的含量测定方法为hplc法。更佳的，质量控制过程还包括检测总黄酮的含量及山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙的含量。较优的，总黄酮含量以山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙为对照，采用UV法定量测定，山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙含量以HPLC法测定。优选的，质控过程还包括用TCL法鉴别槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙和山奈酚-7-0-3-D-葡萄糖甙。上述HPLC法测定槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的操作步骤按照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)进行测定(1)色谱条件与系统适应性试验填充剂为十八烷基硅垸基合硅胶，流动相为体积比为38:62的甲醇-水溶液或甲醇一体积百分比0.3%的醋酸水溶液或甲醇一体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液，检测波长为257nm，理论板数按槲皮素-7-0~P-D-葡萄糖甙计算，应不低于1000;(2)配置槲皮素-7-O-D-葡萄糖甙对照品溶液；(3)供试样品溶液制备精密称取或量取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理，先用大孔树脂柱纯化处理，再经微孔滤膜过滤获得；(4)测定法分别精密精密吸取对照品溶液与供试样品溶液5-15n1，注入液相色谱仪，测定，即得。实施例中，优选了下述方案a)色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷基合硅胶为填充剂；甲醇-水(或0.3%醋酸水或0.1%三氟乙酸水)(38:62)(v:v)为流动相；检测波长为257nm，理论板数按槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙计算，应不低于1000。b)对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙对照品适量，加甲醇制成每ml含50iig的溶液，即得。c)供试品溶液制备(1)柘木取本品粉末约0.5g,精密称定，置锥形瓶中，加入60%乙醇(v%)50ml，加热回流4小时，过滤，滤液浓縮至约10ml，加于大孔树脂柱(0.8cmxl0cm,用适量水预洗)上,用水50ml洗脱，弃去水液，再用甲醇40ml洗脱，收集洗脱液，至50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45&m)滤过，即得。(2)提取物或制剂取本品适量，研细，取约50-100mg，精密称定，用水10ral超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟使溶解，加于大孔树脂柱(0.8cmxl0cm，用适量水预洗)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用甲醇40ml洗脱，收集洗脱液，至50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。d)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5-15nl，注入液相色谱仪，测定，即得。上述UV法的操作步骤为(1)配置山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙对照品溶液；(2)制备标准曲线；(3)供试样品溶液制备精密称取或量取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理制成样品；(4)测定法在样品溶液加AlCl3及醋酸钾溶液前后，分别用分光光度计测定408nm波长处的吸收度，以两者吸收度的差值从标准曲线上读出供试品溶液中山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙的重量，计算，即得。实施例中，优选了下述方案a)对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压千燥至恒重的山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙对照品4mg,置100ml量瓶中，加60%乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每lml中含无水山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙40yg)。b)标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分别置10ml量瓶中，各加O.lmol/L三氯化铝溶液2ml,1mol/L醋酸钾溶液3ml,加60%乙醇至刻度，摇匀，放置10分钟；另取0.1mol/L三氯化铝溶液2ml，lmol/L醋酸钾溶液3ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置10分钟，作为空白。照分光光度法(中国药典2005年一部附录VB)，在408nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。c)测定法(1)柘木取本品粉末约O.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入6Cm乙醇50ml，称定重量，置水浴回流提取4小时，防冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃取初滤液，精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定吸收度(Al);另精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自"加O.lmol/L三氯化铝溶液"起，依法测定吸收度(A2)，以两者吸收度的差值从标准曲线上读出供试品溶液中山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的重量(yg)，计算，即得。本品柘木含总黄酮以山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙(C21H2。0u)计，不得少于0.16%。(2)提取物或制剂取本品适量，研细，取约50-100mg,精密称定，置50ml量瓶中，加入60%乙醇40ml，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇勾，测定吸收度(A,);另精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自"加0.1mol/L三氯化铝溶液"起，依法测定吸收度(A2)，以两者吸收度的差值从标准曲线上读出供试品溶液中山奈酚-7-o~e-D-葡萄糖甙的重量(ug)，计算，即得。上述HPIX法测定山奈酚-7-0-P-D-葡萄糖甙的操作步骤按照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)进行测定(O色谱条件与系统适应性试验填充剂为十八垸基硅烷基合硅胶，流动相为体积比44:56的甲醇-水溶液或甲醇一O.3%的醋酸水溶液或甲醇一0.1%的三氟乙酸水溶液检测波长为265nm，理论板数按山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙计算，应不低于1000;(2)配置山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙对照品溶液；(3)供试样品制备精密称取或量取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理，先用大孔树脂柱纯化处理，再经微孔滤膜过滤获得；(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试样品溶液5-15ii1，注入液相色谱仪，测定，即得。实施例中，优选了下述方案a)色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅垸基合硅胶为填充剂；甲醇-水(或0.3%醋酸水或0.1%三氟乙酸水)(44:56)(v:v)为流动相；检测波长为265nm,理论板数按山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙计算，应不低于1000。b)对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙对照品适量，加甲醇制成每ml含40ug的溶液，即得。c)供试品溶液制备(1)柘木取本品粉末约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加入60%乙醇50ml，加热回流4小时，过滤，滤液浓縮至干，残渣加甲醇40ml超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟，溶解后转移至50ml量瓶中，放冷，并稀释至刻度，摇匀，用徼孔滤膜(0.45Pm)滤过，即得。(2)提取物或制剂取本品适量，研细，取约50-100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入甲醇40ral，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。d)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5-15nl，注入液相色谱仪，测定，即得。上述的TCL法的操作步骤为(1)取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理后，制成供试品溶液；(2)分别配置山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-0-D-葡萄糖甙的对照品溶液；(3)照薄层色谱法吸取上述溶液各5-10lil，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:3:3:1乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯下，检视供试品色谱中是否在与对照品色谱的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点。实施例中，优选了下述方案(1)取柘木(0.5g)或提取物或制剂(50-lOOrag)粉末，加甲醇5ml，柘木样品超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，提取物或制剂样品超声处理(功率250W，频率50kHz)IO分钟，滤过，滤液置水浴上浓縮至约lml，作为供试品溶液；(2)另分别取山奈酚-7-o~e-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙对照品，加甲醇各制成每lml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；(3)照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5-10"1,分别点样于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:3:1)(体积比)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点。本发明的第三方面，公开了从柘木中分离槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的方法，包括下列步骤(1)取经水或稀醇提取的柘木提取浓縮液，过大孔树脂柱；(2)经水洗脱后，以体积比为30%95%的乙醇溶液梯度洗脱；(3)收集30%50%乙醇流份，浓縮后，过硅胶柱，以体积比为030:10070的甲醇-乙酸乙酯溶液为洗脱剂，梯度洗脱，以TLC法为检测手段，收集含有槲皮素-7-0~P-D-葡萄糖甙成分的流份；(4)浓縮、干燥步骤(3)获得的流份，用少量甲醇溶解，用凝胶柱分离，用甲醇作为洗脱液，以TLC法为检测手段，收集含有槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙成分的流份；(5)经反相制备液相分离精制，经反相硅胶柱先出样的成分即为槲皮素-7-0"0-d-葡萄糖甙。实施例中，优选了下述方案(1)经水或稀醇提取的柘木提取浓縮液，过大孔树脂柱；(2)水充分洗脱后，以30%95%乙醇(v%)溶液梯度洗脱；(3)收集30%50%乙醇流份，浓縮，加适量硅胶，混和、干燥、粉碎，置硅胶柱顶，以甲醇-乙酸乙酯(030:10070)(体积比)为洗脱剂，梯度洗脱，以TLC法为检测手段，收集含有槲皮素-7-o~e-d-葡萄糖甙成分的流份；\(4)浓縮、干燥上述流份，用少量甲醇溶解，置凝胶柱(S印hadexLH-20)上进一步分离，用甲醇作为洗脱液，仍以TLC法为检测手段，收集含有槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙成分的流份；(5)部分浓缩上述流份，进样至填有反相硅胶(RP-18)的制备液相色谱仪，流动相为甲醇-水(40:60)，先出样的流份为槲皮素-7-0-0-D-葡萄糖武，该流份放置过夜，有淡黄色针状结晶析出，过滤，干燥结晶体，即得；后出样的是山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙。上述方法可用于制备质控中使用的槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙对照品，并且用该方法获得的槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙纯度超过98%(HPLC归一法)。本发明的优点在于提供了一个用于柘木或柘木制剂质量控制的全新指标一槲皮素-7-0-葡萄糖甙，至目前为止，存在槲皮素-7-0-葡萄糖甙的植物中均未报道发现存在山柰酚-7-0-葡萄糖甙，而柘木中恰恰同时存在这两种物质，槲皮素-7-0-葡萄糖甙与山柰鼢-7-0~葡萄糖甙相结合不仅可以凸现柘木或柘木制剂测试的专属性和特异性，而且又扩大的单一有效成分数量控制，弥补了柘木制剂质控指标单一的缺陷，完善了柘木制剂的质控体系。图l槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙化学结构式图2山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙化学结构式具体实施例方式本发明中，"柘木制剂"包括柘木液体制剂及固体制剂，上述液体制剂不仅包括柘木糖浆、柘木注射液等液体形式的成品制剂，还包括柘木提取物、柘木流浸膏等半成品制剂；固体制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、干糖浆剂等固体形式的成品制剂，还包括柘木干浸裔粉等半成品制剂。柘木提取物、柘木浸膏的制备方法在专利CN1515294中获得公开，柘木颗粒剂、片剂、胶囊剂、干糖浆剂的制备方法在专利CN1515294及CN1726962中均有公开，柘木糖浆、柘木注射液的制备方法在CN1726962中获得公开。本发明中，"槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙"的结构式参见图l。本发明中，"山奈酚-7-o~e-D-葡萄糖甙"的结构式参见图2。下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如《中国药典》2005版中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例1柘木干浸膏粉的制备100kg柘木小块，加水7倍，提取4小时，放出药液，进行第二次提取，加水5倍，提取时间3小时，合并提取液，减压浓縮至相对密度1.07(80'C),喷雾干燥，得干浸裔粉5kg。实施例2柘木部位提取物的干浸裔粉制备100kg柘木小块，加60%乙醇500kg,提取3小时，放出药液，进行第二次提取，加60%乙醇400kg，提取时间2小时，合并提取液，减压浓縮至药液无醇味，过一填有中性大孔树脂柱，然后用纯净水、20%、40%、60%、80乙醇，收集60—80%乙醇洗脱液并浓縮干燥，得部位提取干浸膏粉1.5kg。实施例3柘木颗粒剂的制备取实施例1制得的浸膏粉与乳糖按2:1比例混合，制粒，得到黄棕色颗粒。实施例4柘木干糖浆的制备100kg柘木小块，加30%乙醇6倍，提取3小时，放出药液，进行第二次提取，加同浓度的乙醇5倍，提取时间3小时，合并提取液，减压浓縮至相对密度1.07(80r)，喷雾干燥，得干浸膏粉4.5kg。取上述稀醇总提取的浸膏粉与辅料按l:l比例充分混合，制成干糖浆剂。辅料由糖粉、乳糖、可溶性淀粉和CMC(4:3:2:1)组成。实施例5柘木片的制备取实施例2制得的干浸膏粉(黄酮含量18%)45%，加微晶纤维素35%，低取代径丙纤维素8%，淀粉8%，混合制粒，内加微粉硅胶、硬脂酸镁各0.5%,压片，薄膜包衣3%,片重0.5g。实施例6柘木胶襄的制备取实施例2制得的浸裔粉(总黄酮含量18%)60%，糊精20%、淀粉10%,混合，另取10%量淀粉制浆，用于湿法制粒，干燥后装填胶囊，粒重0.4，每粒含总黄酮4(kg,其中populnin4mg，槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙3.5mg。实施例7槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙与山奈酚-7-0"e-D"葡萄糖甙的分离和鉴别取经水或稀醇提取的柘木提取浓縮液，直接过一己经水相处理的大孔树脂柱，经水充分洗脱干净后，以30%95%乙醇溶液梯度洗脱，对收集的30%50%乙醇流份部分，经浓缩后，上一硅胶柱，以乙酸乙酯-甲醇(030%甲醇)梯度洗脱，洗脱液以TLC法为检测手段，硅胶TLC检测的展开条件乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:0.5:0.5)，显色条件喷洒A1C13乙醇液，薄板挥干后在365nra萤光下检视欲分离成分是否在与槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙或山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙对照色谱相同的位置上，显有相同黄绿荧光斑点，有则确认为含槲皮素-7-0-e-0-葡萄糖甙或山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙的流份。分别合并含山奈酚-7-0-0-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-e-d-葡萄糖甙的流份，富含山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖武和槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的流份分别浓縮后，以甲醇作洗脱液，多次过凝胶柱分离，收集欲分离的山奈酚-7-0"e-0-葡萄糖甙和槲皮素-7-0~e-d-葡萄糖甙。得到的山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙粗品分别经反相制备液相进一步纯化分离，精制后二个的对照品纯度达到98%(HPLC归一法)。山奈酚-7-0-P-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0~&-D-葡萄糖甙化学结构经UV、EI-MS、ESI-MS、H-隨R及C-NMR光谱分析研究加以确认。鉴定经分离的山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙淡黄色粉末(MeOH)，mp.259261'C(未校正)，紫外吸收入max(MeOH):252、265和369nm。质谱EIM/Z286(强峰，甙元离子峰)，448(微弱，分子离子峰)，ESI(M-1)/Z447.2(最强峰)，(M+l)/Z449.0(最强峰)，理论分子量448.37。核磁共振1H-隨(DMS0-d6)S(ppm):5.11(1H,甙键上质子)、6.38(1H'd,C6—H)、6.77(1H，d,C8-H)、6.90(2H，d,C3，—H,C5,—H)、8.04(2H,d，C2，-H,C6，—H)、9.53(1H，C3-0H)、10.13(1H,C4,-0H)、12.45(1H，C5-0H);13C-簡R(DMS0-d6)S(ppm)数据见表l。紫外吸收、质谱以及氢、碳核磁共振数据与山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙文献值(张月华，任婉薇，万树文等.柘木化学成分研究[J].医药工业(3):15，1980)均对应吻合，其中碳谱的数据与文献值高度一致(K.R.Markham，B.Ternal,R.Stanley,H.GeigerandT.J,MabryCARBON-13NMRSTUDIESOFFLAV0N0IDS-III[J].Tetrahedron.1978,34:1389-1397)。山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的结构见图2。经分离的槲皮素-7-0-e-d-葡萄糖甙淡黄色粉末(Me0H),卿.219223'C(未校正)，紫外吸收入max(MeOH):208、257和375nm。质谱ESI(M-1)/Z463.24(最强峰)，理论分子量464.37。核磁共振1H-NMR(固-d6)S(卯m):5.15(1H，d,甙键上质子)、6.41(1H,d，C6-H)、6.76(1H,d,C8—H)、6.91(1H,d，C5,-H)、7.55(1H,dd,C2，-H)、7.71(1H,d，C6,-H)、9.10(3H,m，C3、C3，、C4，-0H)、12.47(1H，s,C5-0H);13C-NMR(DMS0-d6)S(ppm)数据见表1。质谱以及氢、碳核磁共振数据与槲皮素-7-0"P-D-葡萄糖甙文献值(张晓峰，胡伯林，周丙南.藏药熏倒牛的活性物质研究[J].药学学报。1995，30(3):211-214)均对应吻合。碳谱的测定数据与文献(K.R.Markham,B.Ternal,R.Stanley,H.GeigerandT.J.MabryCARBON-13NMRSTUDIESOFFLAVONOIDS-III[J].Tetrahedron.1978，34:1389-1397)高度一致。槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙的结构见图1。表l.化合物I(山奈酚-7-(hP-D-葡萄糖甙)和II(槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙)l3C-NMR测定的化学位移数据(ppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>经上述试验确认从柘木中分离获得的化合物分别是山奈酚-7-o-e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙，纯度达98%。实施例8柘木或柘木制剂TLC鉴别试验取柘木粉末0.5g，加甲醇5ml，超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟；取适量提取物以及实施例16制备的柘木制剂样品，加甲醇5ml，分别超声处理10分钟。上述各溶液分别滤过，滤液置水浴上浓縮至约lml，作为供试品溶液。另取实施例7获得的山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0"e-D-葡萄糖甙，分别用甲醇溶解(0.2mg/ml)，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录附录VIB)试验，吸取供试品溶液5ul和对照溶液5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷洒AlCl3乙醇液，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱的位置上，所有供试品均显相同黄绿荧光斑点。实施例9柘木或柘木制剂中总黄醑、山奈酚-7"0-e-D"葡萄糖甙和槲皮素-7-0"e-D-葡萄糖甙含jt检铡1.总黄酮测定1.1对照品溶液的制备精密称取实施例7获得的山奈酚-7-0-P葡萄糖甙(populnin)对照品4mg，置100ml量瓶中，加60%乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每lml中含无水p叩ulnin40Pg)。1.2标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分别置10ml量瓶中，各加0.1mol/L三氯化铝2ml，1mol/L醋酸钾溶液3ml,加60%乙醇至刻度，摇匀，静置10分钟，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)试验，以相应的试液做空白，在408nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明杨属苷对照品在0.02360.1892mg范围内线性关系良好，其回归方程为C=0.272A+0.000478,r=0.99991.3精密度试验取同一对照品溶液，按标准曲线制备项下方法连续测定5次，吸收度平均值为0.324，RSD值为0.35W，表明精密度良好。1.4重复性试验精密称取同批样品5份，按样品测定项下方法操作，测定总黄酮含量，平均含量为l.Ol%，RSD值为0.06劣，表明重复性良好。1.5样品溶液稳定性试验同一样品溶液，每隔10分钟测定吸收度。结果显示，样品溶液在30分钟内吸收度基本稳定，故操作时间宜控制在30分钟以内。1.6加样回收率试验取己知含量的样品6份，定量加入对照品，按样品测定项下方法操作，测定总黄酮量，计算回收率，结果见表2.表2.加样回收率实验结果序号原有量加入量测得值回收率平均回收RSD(mg)(mg)(mg)(%)率(%)(%)10.25600.29550.5639104.2020.25600.29550.5661104.9530.25600.39400.6613102.87102.961.9240.25600.39400.6591102.3150.25600.39400.647799.4260.25600.39400.6659104.041.7样品测定(1)柘木取本品粉末约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中,精密加入60%乙醇50ml，称定重量，置水浴回流提取4小时，防冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃取初滤液，精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定吸收度(Al);另精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自"加0.1mol/L三氯化铝溶液"起，依法测定吸收度(A2)，以两者吸收度的差值从标准曲线上读出供试品溶液中山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的重量(tig)，计算，即得。结果见表3.。表3.柘木药材总黄酮含量测定数据批号050918051005051107黄酮含量(％)0.2190.2240.237平均含量(％)0.227经过三批药材的测定，其平均总黄酮含量为0.227%，现暂拟以其平均含量的70%计，制订含量限度，本品柘木含总黄酮以山奈酚-7-0-D-葡萄糖甙(C21H20011)计，不得少于0.16%。(2)提取物或制剂分别取实施例16样品适量，研细，取约50-100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入60。/。乙醇40ml，超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定吸收度(A!);另精密量取续滤液3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自"加0.1mol/L三氯化铝溶液"起，依法测定吸收度(A2)，以两者吸收度的差值从标准曲线上读出供试品溶液中山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙的重量(ttg)，计算，即得。结果见表4.。表4.柘木提取物或制剂总黄酮含量测定数据<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.山奈酚-7-0-0-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-0-0-D-葡萄糖甙含量检测2.1山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷基合硅胶为填充剂甲醇-0.3%醋酸水(44:56)(v:v)为流动相；检测波长为265nm，理论板数按山奈酚-7-0"P-D-葡萄糖甙计算，应不低于iooo。对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的山奈酚-7-0-D-葡萄糖甙对照品适量，加甲醇制成每ml含40ug的溶液，即得。供试品溶液制备(1)柘木取本品粉末约0.5g,精密称定，置锥形瓶中,加入60%乙醇50ml，加热回流4小时，过滤，滤液浓縮至干，残渣加甲醇40ral超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，溶解后转移至50ral量瓶中，放冷，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得。(2)提取物或制剂取本品适量，研细，取约50-100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入甲醇40ml，超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45"m)滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液lOnl,注入液相色谱仪，测定，即得。2.2槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅垸基合硅胶为填充剂；甲醇_0.3%醋酸水(38:62)(v:v)为流动相；检测波长为257咖，理论板数按槲皮素-7-0~P-D-葡萄糖甙计算，应不低于IOOO。对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的槲皮素-7-o~e-D-葡萄糖甙对照品适量，加甲醇制成每ml含50wg的溶液，即得。供试品溶液制备(1)柘木取本品粉末约0.5g，精密称定，置锥形瓶中,加入6096乙醇50ml，加热回流4小时，过滤，滤液浓縮至约10ml，加于大孔树脂柱(0.8cmX10cm，用适量水预洗)上,用水50ml洗脱，弃去水液，再用甲醇40ml洗脱，收集洗脱液,至50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。(2)提取物或制剂取本品适量，研细，取约50-100mg，精密称定，用水l(kl超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟使溶解，加于大孔树脂柱(0.8cmxl0cm,用适量水预洗)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用甲醇40ml洗脱，收集洗脱液，至50ral量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液IOPI,注入液相色谱仪，测定，即得。测试结果见表5.。表5.柘木或提取物或制剂中山奈酚和槲皮素的糖甙含量数据<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实验结果显示，回流提取时间为4或5小时，积分面积值相差无几，故选用4小时回流提取方案。3)提取物或制剂超声提取时间选择取柘木提取物100mg,4份，精密称定，分别置锥形瓶中，加甲醇50ml，再称定重量，同时置于超声仪(功率250W，频率50kHz)水浴中进行超声提取，分别在10、20、30和40分钟后取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，作为供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10lU，注入液相色谱仪，测定山奈酚-7-0-P-D-葡萄糖甙的积分面积。分析柱用十八垸基硅烷基合硅胶为填充剂；甲醇-水(44:56)(v:v)为流动相；检测波长为265nm,测定结果见表8.。表8.不同时间超声提取的样品积分面积测定<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实验结果显示，超声提取时间为30或40分钟，积分面积值相差无几，故选用30分钟超声提取方案。有关hplc测定山奈酚-7-0-e-d-葡萄糖甙和槲皮素-7-o-e-d-葡萄糖甙含量的线性关系、精密度、重复性、稳定性均符合分析要求，加样回收率分别为99.76%和98.24%。实施例10稳定性试验对于经实施例8和实施例9检测合格的柘木颗粒剂样品，我们进行了加速稳定性研究，试验条件为温度37'C，相对湿度75%，放置三个月，在0月、l月、2月、3月分别检查颗粒水分、颗粒粒度、溶化性、卫生学指标，实施了TLC鉴别，黄酮的含量测定。在试验期间，检査项目均符合现行版《中国药典》的要求，鉴别试验和含量测定值无显著性变化。实施例11毒理学研究对于实施例l的样品，进行了最大给药量测定提取物灌胃给小鼠7、14、28g/kg,其最高剂量相当生药510g/kg,为临床使用剂量的101倍，结果动物无一死亡，亦未发现明显的毒副反应。结论柘木提取物灌胃对小鼠的最大给药量为28g/kg。实施例12药效试验对于实施例l的样品，进行了药效学试验1.柘木提取物体外抗肿瘤活性试验(1〉对人HCT-116肠癌细胞生长活性的影响柘木提取物对人HCT-116肠癌细胞的生长活性具有明显的抑制作用。其中，实施例1样品最小抑瘤浓度为2.5X10、/ml;乙醇(60%)提取物最小抑瘤浓度为6.3X10—5g/ml。见表9。表9.对人HCT-116肿瘤细胞生长的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(2)对人SGC-7901胃癌细胞生长活性的影响实施例1样品和柘木醇提物对人SGC-7901胃癌细胞的生长活性具有明显的抑制作用，其最小抑瘤浓度均为2.5X1(Tg/ml。见表IO。表10.对人HCT-116肿瘤细胞生长的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例1样品和乙醇提取物体外给药，对人HCT-116肠癌细胞或人SGC-7901胃癌细胞均有不同程度的直接抑制作用。2.抗胃癌作用试验灌胃给实施例1样品2.6、5.2g/kg，皮下注射氟尿嘧啶注射液100mg/kg，对裸小鼠所荷SGC-7901癌细胞的生长活性均有显著的抑制作用(P〈0.01或P<0.05)，其抑瘤率分别为47.9%、32.2%、75.6%。见表ll。表11.实施例1样品对SGC-7901癌细胞株的抑制作用(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>氟尿嘧啶0.1X460.276±0.139**-75.6模型对照61.133±0.198*P〈0.05，**P<0.05,与模型对照比实施例1样品口服给药，对人SGC-7901胃癌有抑制作用。3.实施例1样品对5-TH3受体结合的抑制试验表12.实施例1样品对5-HT3受体「H]GR65630结合的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例1样品在浓度为lmg/ml时特异性结合的抑制率为34.0±4.0(%)，因此对5-HT3受体，H]GR65630结合有一定的抑制作用。显示其有一定的对抗肿瘤化疗时呕吐的作用。4.免疫活性试验(1)对碳粒廓清能力的影响灌胃给实施例1样品0.83g/kg、人参提取物0.16g/kg，每日1次，连续7日，小鼠吞噬指数K值和校正吞噬活性a值均有升高，与空白对照比差异显著(P<0.05))。见表13。表13实施例l样品对小鼠碳粒廓清能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*P〈0.05'与空白对照比(2)对巨噬细胞吞噬能力的影响灌胃给实施例1样品0.28、0.83g/kg、人参提取物0.16g/kg，每日1次，连续7日，小鼠对鸡红细胞的吞噬百分率或吞噬指数均有明显的提高，与空白对照比，差异显著或非常显著(P〈0.05或P<0.01)。见表14。表14实施例l样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*P〈0.05'**P〈0.Q1，与空白对照比灌胃给实施例l样品0.83g/kg，每日1次，连续7日，能显著提高小鼠对碳痢廓清的能力；灌胃给实施例l样品0.28、0.83g/kg，每日1次，连续7日，能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。上述试验表明用本发明的质控方法进行质控生产合格的制剂质量稳定，活性成分含量可控，抗肿瘤效果显著，完全符合制剂的要求。权利要求1、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙在柘木或柘木制剂质量控制中的应用。2、一种柘木或柘木制剂的质量控制方法，包括检测槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙的含量。3、如权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，所述槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的含量测定方法为HPLC法。4、如权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于，所述HPLC法为(1)色谱条件与系统适应性试验填充剂为十八烷基硅烷基合硅胶，流动相为体积比为38:62的甲醇-水溶液或甲醇一0.3%的醋酸水溶液或甲醇一0.1%的三氟乙酸水溶液，检测波长为257mn，理论板数按槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙计算，应不低于1000;(2)配置槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙对照品溶液；(3)供试样品溶液制备精密称取或量取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理，先用大孔树脂柱纯化处理，再经微孔滤膜过滤获得；(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试样品溶液5-15ix1，注入液相色谱仪，测定，即得。5、如权利要求2至4中任一权利要求所述的质量控制方法，其特征在于，质量控制过程还包括检测总黄酮的含量以及山奈酚-7-O-e-D-葡萄糖甙的含量。6、如权利要求5所述的质量控制方法，其特征在于，所述总黄酮含量以山奈酚-7-0~e-D-葡萄糖甙为对照，采用UV法定量测定，所述山奈酚-7-0-D-葡萄糖甙含量以HPLC法测定。7、如权利要求6所述的质量控制方法，其特征在于，所述UV法为(1)配置山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙对照品溶液；(2)制备标准曲线；(3)供试样品溶液制备精密称取或量取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理制成样品；(4)测定法在样品溶液加AlCl3及醋酸钾溶液前后，分别用分光光度计测定408nm波长处的吸收度，以两者吸收度的差值从标准曲线上读出供试品溶液中山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙的重量，计算，即得。8、如权利要求6所述的质量控制方法，其特征在于，所述HPLC法为(l)色谱条件与系统适应性试验填充剂为十八烷基硅烷基合硅胶，流动相为体积比44:56的甲醇-水溶液或甲醇一O.3%的醋酸水溶液或甲醇一0.1%的三氟乙酸水溶液，检测波长为265nm，理论板数按山奈酚-7-0-e_D-葡萄糖甙计算，应不低于1000;(2)配置山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙对照品溶液；(3)供试样品制备精密称取或量取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理，先用大孔树脂柱纯化处理，再经微孔滤膜过滤获得；(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试样品溶液5-15nl，注入液相色谱仪，测定，即得。9、如权利要求2、3、4、6、7、8中任一权利要求所述的方法，其特征在于，质控过程还包括用TCL法鉴别槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙和山奈酚-7-0-e-D-葡萄糖甙。10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的TCL法为(1)取适量柘木粉末或提取物或制剂，经常规提取或溶解处理后，制成供试品溶液；(2)分别配置山奈酚-7-o~e-D-葡萄糖甙和槲皮素-7-o-e-D-葡萄糖甙的对照品溶液；(3)照薄层色谱法吸取上述溶液各5-10nl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:3:3:1乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯下，检视供试品色谱中是否在与对照品色谱的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点。11、柘木中分离槲皮素-7-0-e-D-葡萄糖甙的方法，包括下列步骤(1)取经水或稀醇提取的柘木提取浓縮液，过大孔树脂柱；(2)经水洗脱后，以体积比为30%95%的乙醇溶液梯度洗脱；(3)收集30%50%乙醇流份，浓縮后，过硅胶柱，以体积比为030:10070的甲醇-乙酸乙酯溶液为洗脱剂，梯度洗脱，以TLC法为检测手段，收集含有槲皮素-7-0-P-D-葡萄糖甙成分的流份；(4)浓縮、干燥步骤(3)获得的流份，用少量甲醇溶解，用凝胶柱分离，用甲醇作为洗脱液，以TLC法为检测手段，收集含有槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙成分的流份;(5)经反相制备液相分离精制，经反相硅胶柱先出样的成分即为槲皮素-7-0~e-D-葡萄糖甙。全文摘要本发明涉及槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙的新用途，公开了槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙在柘木或柘木制剂质量控制中的应用。同时，本发明还公开了新的柘木或柘木制剂质量控制方法，包括检测槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙的含量。本发明的公开，提供了一个用于柘木或柘木制剂质量控制的全新指标-槲皮素-7-O-葡萄糖甙，很好地弥补了柘木制剂质控指标单一的缺陷，完善了柘木制剂的质控体系。文档编号A61K36/60GK101176755SQ20061011815公开日2008年5月14日申请日期2006年11月9日优先权日2006年11月9日发明者华菊根,张园明,徐晓英,袁华梁,谢家骏申请人:上海市中药研究所;上海雷允上科技发展有限公司