专利名称：一种具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉一种具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物，特别涉及一 种以植物中药为原料制成的具有抑制精子运动功能和体外杀精子作用的药物。
技术背景男性抗生育研究已成为世界研究的热点，目前男性节育的主要方法有体外 排精、周期性禁欲、使用阴茎套、输精管绝育手术、物理避孕法、激素类避孕 药和激素类免疫避孕药。但是其舒适性和安全性阻碍了男性节育的发展。如输 精管绝育术在我国四川省做过大量临床实验性研究，但是一直不能解决可复性、附睾淤积、抗精子抗体形成等问题；植物药类的棉酚和雷公藤以及作用于 睾丸后的一些药物均因其较大的毒性和不可复性不能广泛应用于临床。激素类 避孕药物在目前看来最有发展前途，但因为影响了正常体内的激素代谢，其前 景尚无法预知。十九世纪60年代开始，化学合成药物口服避孕药开始广泛应用，近年来 虽然作了大量的改进，减少了激素的用量，但是长期服用对人体仍有不可忽视 的副作用。外用杀精避孕药经济、安全而且避孕效果良好，使用阴道杀精避孕 方法的育龄妇女在我国逐步增加，目前以表面活性剂壬苯醇醚的栓剂、乳剂和 避孕药膜最为常见。但是这种药物也存在一定的局限性，如对外生殖器有轻微 刺激等。如何有节制的生育自古以来就是困扰人类的一个问题。本世纪60年代以 来，口服避孕药的广泛应用大大减少了意外妊娠率，实现了人类有计划的生育
调控目标。但是目前使用的口服避孕药多为仿照人体激素化学合成产物，长期 服用会不可避免的干扰人体激素代谢。所以国内外一直都试图寻找高效、低毒的体外杀精子药物。现在临床上常用的杀精子剂为Nonoxynol-9，经长期临床证明效果可靠，但根据国内外资料报道及一些研究显示其不良反应也不容忽视。如在一定的浓度下破坏阴道正常菌群增大局部感染的机会，造成不同程度的阴道粘膜充血、水肿和炎性浸润。高剂量可引起阴道、宫颈上皮组织破坏等，甚至可造成阴道溃疡，且上述不良反应与杀精剂的剂量相关[参见1. Dayal MB， Wheeler J， W川iams CJ， Disruption of the upper female reproductive tract epithelium bynonoxynol-9[J]. Contrac印tion， 2003 Oct; 68(4): 273-9 。 2 . Raymond Chen PL， Luoto J， " fl/. Contraceptive effectiveness and safety of five nonoxynol-9 spermicides: a randomized trial. Obstet Gynecol [J], 2004 Mar; 103(3): 430-9。
3 . Phillips DM， Taylor CL， Zacharopoulos VR， Nonoxynol-9 causes rapid exfoliation of sheets of rectal epithelium [J]. Contraception. 2000 Sep; 62(3):149-54.]。因而寻找一种安全、高效、低毒的体外杀精子剂已成为国内外科研工作者的研究热点。发明内容本发明的任务是提供一种具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物， 使其能够作为外用杀精避孕药使用，并具有安全、有效、低副作用等特点。本发明提供的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物，是以植物中 药鹿藿为原料制成的药剂。中药鹿藿(欣/7 c力o^3 ra2"Z i7i5" 在李时珍年代《本草纲目》中始有记载，认为鹿藿无毒，其嫩芽可供食用，对其药用功效并无记载[参见叶晓环，卢锐，黄卫国，基层中药杂志，1999， 13 (4) 54]。鹿藿生于山间土坡杂草丛中，广泛分布于江苏、安徽、江西、福建、台湾、 湖北、湖南、广西、广东、四川、云南等地。其性辛、苦、平，有消积散结、消肿止痛、舒筋活络的功效，内服主治小儿疳积、神经性头痛、风湿性关节炎、腰肌劳损；外用于痈疖肿痛、蛇、虫咬伤。内服生药用量在25-50g每日。[参 见《全国中草药汇编》下册，人民卫生出版社，1975年527 ]。目前对中药鹿 藿的药效和毒副作用没有确切认识，尚未见有用于男女性抗生育作用的报道。本发明以植物中药鹿藿为原料制成的药剂可以是任何一种药剂学上所说 的剂型。制剂的制备方法如下将原料药材鹿藿晒干后先经净选、粉碎，然后可用以下几种方法提取1. 水煎法水煎2次，每次加8倍水量，煎lh，滤过。2. 水提醇沉法鹿藿水提2次，水提液(IO倍量)浓縮至l/2量，加乙醇沉淀，弃去醇杂质，醇溶液经乙醇回收得醇浸膏。3. 醇水双提法鹿藿粗粉用8倍量75%乙醇回流提取2小时，醇提液加压 回收乙醇得药液a;药渣水煎2次方法同上述水煎法，弃去药渣，煎液离心除 杂浓縮成药液b。混合药液a和药液b，喷雾干躁，干压法制粒。提取后添加相应辅料可制备成各种剂型，可制成颗粒剂、片剂、胶囊、口 服液、丸剂(蜜丸、滴丸)、膏剂和糖浆、软膏、栓剂、泡腾片等剂型。4. 精提纯药物作为注射剂鹿藿粗粉，水蒸汽蒸馏，留取挥发油和过滤浓縮后的药液，混合过滤，灭 菌分装。本发明药物对人类精子运动功能抑制效果的实验资料 1.材料与方法1.1鹿藿水煎剂制备中药鹿藿100g浸泡2h后，加入800ml水煮沸1.5h， 留取上清液，再加入500ml水煮沸lh，合并两次上清液，浓縮至50ml,使终 浓度为2g/ml。高速离心机(12000一10min)离心除渣，0.22pm的微孔滤膜过滤 除菌，用NaOH调整pH为7.2-7.4，分装-20'C冻存备用。1.2精子悬液制备具有正常生育能力的男性，禁欲4-6天，手淫法取精, 待精液液化后采用计算机辅助的精子分析系统(CASA:)进行分析，其精液常规 值符合WHO推荐的正常标准[参见:WHO，人类精液及精子-宫颈粘液相互作用 实验室检验手册[M]，第四版.北京人民卫生出版社，2001， 51]，选取10例纳 入实验。将液化的精液用预热至37t:的Ham's F-10 (Sigma)洗涤，再用 IVF-30(Vitrolife)按照文献M上游法进行优化，使前向运动精子百分率(a+b级) 在60%以上，活率在70°/。以上，再调整其密度至40X106-60X10Vml备用。1.3实验方法每份制备好的精子悬液标本分成六份加入96孔无菌培养 板，每孔lOO(il。其中实验组四组，即5pl组、10pl组、15)al组、20|11组， 分别加入鹿藿水煎剂5pl、 1(^1、 15^1、 20|_J (每pl含生药2吗)。另两组为 黄芪组和空白对照组，黄芪组加入以同样方法预处理的黄甚水煎剂5|11(每)il 含生药l(ig)作为药物对照组；不加处理的优选精子悬液作为空白对照组，37 。C恒温水浴箱共孵育。在加入药物后3min， 10min， 20min， 30min采用CASA 进行分析，观察对人精子活率(Motility),精子前向运动百分率(progressive motility)、直线运动速度(VSL)、曲线运动速度(VCL)、平均路径速度(VAP)、 精子头部侧摆幅度(ALH)的影响。同时取相同条件处理的精液标本参照文献[3] 加入特异性分子荧光探针(美国耶鲁大学医学院精子生理研究室惠赠)染色， 观察精子存活率(Viability)的变化。1. 4统计方法所有数据采用Stata8. 0软件包进行统计，采用组间t检 验和方差分析(ANOVA);所有数据均用riS表示。2. 结果2.1精子活率见图l
图1可见，正常对照组精子的活率在30min内没有显著变化，黄芪组和正 常对照组的活率在相同时间点统计学无显著性差异。各实验组均可造成精子活 率降低，呈明显的量效和时效关系。5u 1组加药后3min时与正常组无显著性差异(P=0. 1167)，加药后10min 活率降为正常对照组的一半，统计学差异有显著性(代0.01,/M).0013),但随 着时间的延长精子活率呈现一定的稳定性，无明显降低现象。lOiil组3niin 时即可使精子活率下降一半，以后随时间延长逐渐下降，在20min时精子活率 已低于10%。 15ixl组和20ul组抑制精子活率作用十分明显，3min内使精子 活率降低70%， 10min时精子活率已低于59&。2.2精子前向运动百分率(a+b级精子)正常组a+b级精子百分率在30min内保持稳定，30min时仍高于50%。各实验组a+b级精子显著降低，呈明显的时效和量效关系。15|il组20min和20^1组10min时a+b级精子己降至不足29&， 15|il组30min、 20jil组20min精子前向运动百分率仅为0. 06%，在400X高倍镜下仅有1-2个精子仍有慢速运动能力。经统计学验证，有显著性差异。黄芪组a+b级精子较正常组略少，统计学上差异无显著性。见表1 表l精子前向运动百分率3min 10min 20min 30min止常对照组 57.49± 14.82 57.49± 14.82 55.49± 14.82 50.95± 13.115(^1绗 44.59± 19.84* 32.29± 18.41** 27.28± 19.26** 13.72±8.42**10(il组 35.56±13.39** 19.96士 11.63** 9.88±7.92** 2.37±3.54**15(il组 13.09± 13.56** 3.61 ±2.91** 1.48±2.21** 0.06±1.19**20^1组 11.88±15.26** 1.86±1.72** 0.06±0.19** 0±0**黄芪绗 47.45± 14.37 54.19± 14.19 47.22± 15.35 40.69±20.99表l 精子前向i^动白'分率 、if.常组比较*尸<0.05 **尸<0.01
2. 3 VSL、 VCL、 VAP和ALH各实验组VSL、 VCL和VAP呈现一致性降低趋势，5 ii 1组10min起，10 ia 1 组、15ixl组及20til组3min起即与正常对照组有显著性差异(代0.05)。正 常对照组和黄芪组下降趋势不明显，统计学上差异无显著性("0.05)。各实验组ALH 10min内出现增高现象，随后再下降。显微镜下表现为精子 头部侧摆幅度增加，但不能快速前向游动。延长观察时间，正常对照组在2h 后出现ALH缓慢增高现象。黄芪组ALH—直保持较高水平，在实验时间段内随 时间延长有增高倾向。2. 4精子存活率观察正常对照组、4个实验组和黄芪组在10min、 30min、 lh、 2h的精子存 活率。随时间延长各组精子存活率均呈下降趋势，经统计学检验差异无显著性。通过不同浓度的中药鹿藿对人类精子运动的影响的实验研究，证实本发明 药物对人类精子有强有效的制动作用，在一定范围内随剂量加大和时间的延长 药效逐渐增强，呈明显的量效和时效关系。本发明实验10^1组加入中药鹿藿 10min时可使精子活率降至20. 4%， 15^1组和20^1组3min内可使精子活率降 至16. 7%和15. 42%，在临床上属于弱精子症标准。10min时15^1组和20^1组 精子活率低于1%。在实验过程中发现，加入20pl中药鹿藿(药物体积指数为 0.167)并不影响整个反应体系的渗透压，其精子制动作用最有效，可在3min 之内使精子失去运动能力。本发明药物在体外可快速有效地抑制精子运动，但 在一定时间内不会造成正常精子死亡，是一种有效的体外杀精剂。黄芪组精子运动参数总体上较正常对照组略差，经统计学检验无明显差异 性。造成黄芪组精子运动较正常对照组略弱的原因可能是因为黄芪水煎剂含糖 量较高，使精子悬液粘稠度加大、机械性阻力增加所致。
动物体内实验结果发现， 一定浓度范围内的中药鹿藿口服3个月可使生精小管内生精细胞排列紊乱，层数减少，产生的精子畸形率增加，交配成功后雌 鼠受孕率明显降低。证实鹿藿可以抑制精子的运动，阻止精子进入子宫和输卵 管与卵子结合。实验组雄鼠生长良好，肝、肾病理切片未见明显异常。证明本 发明药物在不发生明显毒副作用的基础上有良好的抑制雄性生育力的作用。 亚急性毒性试验证明本发明药物无明显的毒副作用和皮肤粘膜刺激作用，Wistar大鼠高剂量灌胃三个月，证实动物生长良好，病理切片报告无明显肝、肾损害。实验证明本发明药物是一种高效、安全的抑精药物。
图1为精子活率随时间和药物浓度变化的实验结果具体实施方式
实施例1取中药鹿藿100g浸泡2h后，加入800ml水煮沸1.5h，留取上清液，再加 入500ml水煮沸lh，合并两次上清液，浓縮至50ml，使终浓度为2g/ml。高速 离心机12000r"0min离心除渣，0.22,的微孔滤膜过滤除菌，用NaOH调整 pH为7.2-7.4，分装。实施例2将原料药材鹿藿晒干后粉碎，鹿藿粗粉用8倍量75%乙醇回流提取2小时， 醇提液加压回收乙醇得药液a;药渣水煎2次方法同上述水煎法，弃去药渣， 煎液离心除杂浓縮成药液b，混合药液a和药液b，喷雾干躁，加制药上可接 受的赋形剂打模制得片剂。
权利要求
1. 一种具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物，是以鹿藿(Rhynchosia volubilis Lour)为原料按常法制成的药剂。
2. 根据权利要求1所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物， 其特征在于所述的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
3. 根据权利要求2所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物， 其特征在于所述的药剂是水煎剂。
4. 根据权利要求2所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物， 其特征在于所述的药剂是片剂。
5. 根据权利要求3所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用药物的 制备方法，其特征在于将原料药材鹿藿晒干后粉碎，加8倍水量，煮沸煎1-1.5h， 留取上清液，再加入5倍水量煮沸lh，合并两次上清液，浓縮至终浓度为2g/ml， 离心除渣，过滤除菌，制得水煎剂。
6. 根据权利要求4所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用药物的 制备方法，其特征在于将原料药材鹿藿晒干后粉碎，鹿藿粗粉用8倍量75%乙 醇回流提取2小时，醇提液加压回收乙醇得药液a;药渣水煎2次方法同上述 水煎法，弃去药渣，煎液离心除杂浓縮成药液b，混合药液a和药液b，喷雾 干躁，加制药上可接受的赋形剂打模制得片剂。
7. 权利要求1至4中任何一项所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精 作用的药物在制备节育药物中的应用。
8. 权利要求1至4中任何一项所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精 作用的药物在制备体外杀精药物中的应用。
9. 权利要求1至4中任何一项所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精 作用的药物用于体外杀精。
10. —种体外杀灭精子的方法，其特征在于将权利要求1至4中任何一项 所述的具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物与精液接触。
全文摘要
本发明提供了一种具有抑制精子运动功能和体外杀精作用的药物，该药物是以植物中药鹿藿为原料制成的药剂，可以是任何一种药剂学上所说的剂型。通过不同浓度的中药鹿藿对人类精子运动的影响的实验研究，证实本发明药物对人类精子有强有效的制动作用，在一定范围内随剂量加大和时间的延长药效逐渐增强，呈明显的量效和时效关系。动物体内实验证实鹿藿可以抑制精子的运动，阻止精子进入子宫和输卵管与卵子结合，可作为节育药和体外杀精之用。
文档编号A61K36/48GK101209277SQ20061016661
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月31日 优先权日2006年12月31日
发明者徐惠敏, 熊承良 申请人:华中科技大学