专利名称：猪繁殖与呼吸综合征-安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地是涉及基因工程疫苗，特别涉及猪繁殖与呼吸 综合征疫苗。
技术背景猪繁殖与B乎B及综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus , PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原，主要表现为妊娠母猪严重繁殖障碍以及 仔猪的呼吸症状和高死亡率。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世 界各主要养猪国家及地区，并己成为危害养猪业最严重的传染病之一。PRRS的预防 与防治主要依靠疫苗的接种。目前用于PRRS预防与防治的商用疫苗主要有弱毒疫苗 和灭活疫苗。但己证实弱毒疫苗存在散毒及高几率毒力返强的安全隐患，国外许多国 家已禁用弱毒疫苗。灭活疫苗虽然安全性好，但不仅需要多次重复接种，而且免疫效 果不理想，还经常可以导致免疫失败。因此，迫切需要研制出更安全、高效、廉价的 新型疫苗来预防与防治PRRS。PRRSV是有囊膜的单股线性正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，包括9个 开放阅读框(ORFla、 ORFlb、 ORF2-ORF7)(Deas et al， J Clin Microbiol, 1996; Snijder et ai， J Gen Virol,，1998)其中有ORF5编码的GP5蛋白具有最强的中和病毒能力 (Pirzadeh et al ， J Gen Virol, 1997,1998; Zhang etal， Vet Microbiol ， 1998; Weilandetal， Vet Microbio1,1999)， GP5是目前构建PRRS重组病毒弱毒活疫苗和DNA疫苗的最佳 候选基因。 Ostrowsi等(J Virol, 2002)在GP5暴露在囊膜表面的N-端鉴定了 2个抗原表 位，即表位A和表位B。表位A为A27V28L29N3Q，在诱导GP5的抗体上，A表位占主 导地位，它通过抑制与其相隔仅7个氨基酸的中和性表位B被动免疫系统的识别，使 免疫系统只产生针对表位A的非中和抗体，导致免疫后3周内猪血清内针对GP5的 抗体是抗A表位的非中和抗体;而B表位由第37-45位连续的9个氨基酸残基组成(抗 体主要识别H"I"Y4 45)，它所诱导的中和抗体出现较晚，感染后(4-6周)才能检 测到针对B位点的中和抗体，由此可见，A表位与PRRSV中和无关，在猪被PRRSV 感染期间，抗GP5的抗体主要是针对A表位的非中和抗体，并将抗表位B的中和抗 体的产生推迟至少3周，构建新一代PRRSV疫苗，表位A的存在是有害无益的，因 此去除A表位抑制中和抗体的作用同时增强B表位产生中和抗体能力的工作是非常 有必要的。经改造的安卡拉牛痘病毒(Modified W Ankara, MVA)是将牛痘病毒Ankara株 经鸡胚成纤维细胞传570代后得到的。MVA属于生物安全I级，作为疫苗载体有以下 几点优点(1)可以携带较大的外源基因；(2)在人类和哺乳动物细胞中可以高表达 重组蛋白；(3)引起较强的体液免疫和细胞免疫；(4)冷冻及冻干保存具有较长的稳 定性。鉴于MVA的以上优点，将其作为疫苗载体携带PRRSV的GP5-BB，制成基因工 程疫苗。 发明内容本发明的任务是采用安卡拉牛痘病毒作为载体，分别与猪繁殖与呼吸综合征病 毒GP5、 GP5-DB基因重组得到DNA疫苗,目的是能达到理想的免疫效果，制备新型的 基因工程疫苗。实现本发明的技术方案是 (1)从天然猪繁殖与呼吸综合征病毒中PCR扩增GP5基因，此处的猪繁殖与呼 吸综合症病毒来源于Liboratorios Hipra公司生产的PRRS弱毒疫苗。(2) 将天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因采用猪偏爱密码子将其核苷酸序 列优化，并采用基因合成仪合成优化的序列GP5A，本处所述的优化是指用猪偏爱密 码子替换猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因原有的密码子。(3) 利用PCR将优化GP5基因中的表位A替换为猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因的表位B，新合成的基因称为GP5-DB基因。(4) 将GP5和GP5-DB基因克隆到真核表达载体JN-2中，本处的真核表达载体 JN-2由本实验室构建(见图十八)。(5) 将构建的JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB质粒与安卡拉牛痘病毒重组。(6) 筛选重组病毒得到猪繁殖与呼吸综合征GP5和GP5-DB基因安卡拉牛痘重 组病毒。(7) 用重组病毒免疫BALB/c小鼠。(8) 通过间接ELISA及病毒微量中和试验检测其免疫效果。(9) 用重組病毒免疫BALB/c小鼠，做疫苗的保护性实验。(10) 用重组病毒免疫低日龄乳猪和妊娠母猪，作疫苗的本动物保护性实验。 本发明基于所研发的疫苗最终将用于本体动物猪体内,故在保证PRRS GP5基因氨基酸序列不变的前提下,用猪的偏爱密码子取代猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因 的密码子，再以GP5、 GP5-DB基因研制成新型的DNA疫苗免疫猪，这样可以使GP5基 因的蛋白表达量增加从而增强其疫苗的免疫效果以达到良好的预防效果.
图一为从猪繁殖与呼吸综合征病毒中PCR扩增得到的GP5基因序列。 图二为利用猪密码子偏爱性优化的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5A基因序列。 图三为pUC57质粒的酶切图谱。 图四为GP5 PCR产物的1°/。琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DL2000Marker， 1为 GP5A序列片断。图五为GP5-DB的前半段基因GPA的电泳图，其中M为DL2000Marker， 1为 GPA序列片断。图六为GP5-DB的后半段基因GPB的电泳图，其中M为DL2000Marker， 1为 GPB序列片断。图七为GP5-DB基因的电泳图，其中M为DL2000Marker， 1为GP5-DB序列片断。图八为利用猪密码子偏爱性优化的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5-DB基因序列。 图九为JN-2-GP5的Pmel和Ascl双酶切鉴定结果，其中M为DL2000Marker， 1、2、 3和4分别为JN-2-GP5的四个克隆的酶切结果。图十为JN-2-GP5-DB Pmel和Ascl双酶切鉴定的结果，其中M为DL2000Marker,1为JN-2-GP5-DB的双酶切结果。图H"—为GP5相关重组病毒免疫小鼠的ELISA抗体。 图十二为GP5-DB相关重组病毒免疫小鼠的ELISA抗体。 图十三为GP5相关重组病毒免疫小鼠的中和抗体。 图十四为GP5-DB相关重组病毒免疫小鼠的中和抗体。 图十五为GP5、 GP5-DB相关重组病毒免疫小鼠的保护性实验。 图十六为GP5、 GP5-DB相关重组病毒免疫低日龄仔猪的保护性实验。 图十七为GP5、 GP5-DB相关重组病毒免疫妊娠母猪保护性实验。 图十八为JN-2的质粒酶切图谱。图十九为天然的PRRSVGP5基因与优化的GP5A基因的Blast结果。
具体实施方式
实施例1.GP5序列的合成1) 以GP5序列为基础，设计一对引物。GP1 : 5'-CGGGATCCGCCACCATGGGCATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3' GP2: 5'-G GAATTCCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3'2) 以GP1、 GP2为引物，以猪繁殖与呼吸综合征病毒为模板进行PCR，扩增GP5 序列的反应体系和反应条件是反应体系为ddH20 18.5pL， 10xbuffer 2.5pL， dNTP(2,5mmol/L) 2^L, GP1 (10pmol/L) 0.5pL， GP2 (10pmol/L) 0.5^iL， pfbDNApolymerase(5u4iL) 0.5pL, PRRSV (50倍稀释)0.5^iL。反应参数为94°C 2min，94。C 15s,60。C 15s,72°C 30s，30 cycles，72。C 3min。扩增 得到的GP5片断长630bp (见图四)。实施例2.优化GP5A序列的合成。首先保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白氨基酸序列不变的前提下，采用猪偏 爱密码子将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5序列优化并利用基因合成仪合成优化序列， 优化序列称作GP5A，序列优化和优化序列的合成工作均是委托GenScript公司完成，合 成的序列克隆在pUC57中(图三)，GP5A序列见图二。实施例3.GP5-DB序列的改造合成。1)以优化的GP5A为基础，分别设计两对引物分别为GPA1:5'-CTCGAGGTTTAAACCCACCATGCTG-3'(划线部分分别为Xhol和Pmel 酶切位点)；GPA2: 5'-GTTGCTGGCGTTATAAATCAACTGAATATGAGACAGGTAGA AGGGCAC-3';GPB1: 5'-CAGTTGATTTATAACGCCAGCAACAACAACAG-3';8 GPB2: 5'-GTCGACGGCGCGCCTCACAGGCGGCCCCACG-3'(划线部分分别为 Sall和Ascl酶切位点)。其中引物GPA2中将优化GP5中的表位A替换为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因的表位B。2)分别以两对引物为引物，以优化的GP5A序列为模板进行PCR， GPA和GPB 的反应体系和反应参数都相同分别为反应体系为ddH20 18.5pL， 10xbuffer 2.5^L， dNTP(2.5mmol/L) 2&， GPA1或 GPB1 ( 10nmol/L ) 0.5pL ， GPA2或GPB2 ( 10pmol/L ) 0.5pL ， pfo DAN polymerase(5u/^iL)0.5nL， puc57-GP5质粒(50倍稀释)(优化GP5)0.5pL。 反应参数为94。C 2min,94。C 15s， 60。C 15s，72。C 30s，30 cycles，72。C 3min。 GPA和 GPB分别扩增得到100bp和400bp的片段(见图五和图六)，分别将GPA和GPB的 PCR产物割胶纯化用于GP5-DB的PCR的扩增模板。3) GP5-DB的PCR的扩增，以GPA和GPB的PCR纯化产物为模板，以GPA1和GPB2 为引物，进行PCR ， 反应体系为4dH20 37.5pL ， 10xbuffer5.0pL ， dNTP(2.5mmol/L)4.0^L， GPA11.0pL， GPB2 (10pmol/L) l.OpL， Ex DAN polymerase (5u4iL)0.5^iL， GPA的PCR纯化产物0.5|iL， GPB的PCR纯化产物0.5&。PCR反应参数为94。C 2min， 94°C 15s， 60°C 15s, 72°C 30s， 30 cycles, 72。C 3min。结果扩增出一条约600bp的条带(见图七)，与预期大小一致。将GP5-DB的PCR产物克隆到PMD18-T载体中测序，结果表明GP5-DB构建成 功，表位A替换为表位B。实施例4. JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB重组质粒的构建1) JN-2-GP5的构建用Pmel和Ascl将pUC57-GP5及目的载体JN-2两步法双酶切，然后进行连接， 将连接产物转化至DH5 a中，挑取克隆进行酶切鉴定，结果表明酶切片段与预期大小 一致(见图九)，重组质粒JN-2-GP5构建成功。2) JN-2-GP5-DB的构建用Pmel和Ascl将TS-GP5-DB及目的载体JN-2两步法双酶切，然后进行连接， 连接反应体系略，将连接产物转化至DH5 a中，挑取克隆进行Pmel和Ascl双酶切鉴 定，结果表明酶切片段与预期大小一致(见图十)，重组质粒JN-2-GP5-DB构建成功。实施例5. JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB质粒与安卡拉牛痘病毒重组。1) JN-2-GP5质粒与安卡拉牛痘病毒重组将CEF接种细胞培养6孔板，细胞接种量为0.6乂106个/孔，置于37'C 0)2培养 箱培养过夜。取2个无菌的EP管，1井EP管中加入200PL Opti-MEM和80uL Metafectene，混匀；2 # EP管中加入200 u L Opti-MEM禾B 40 u g JN-2-GP5混匀，室 温放置30min。将两个EP管混合编号3弁，混匀后室温放置15min。取5 u L MVA病 毒液加入到5mL Opti-MEM中，混匀，取适量的病毒液到3#EP管中使MOI为0.01 感染单位/细胞，在3弁EP管中添加0pti-MEM使总体积达到2mL。吸弃细胞板内液 体，每孔用lmLOpti-MEM润洗，将3弁EP管内液体加到细胞培养6孔板中，加入的 量为lmL/ L,铺满细胞，在37。C孵育4h。每孔加入4mL生长液，置于37'C (:02培 养箱培养2天。细胞病变后用细胞刮将贴壁细胞刮落，将2孔细胞悬液混合，转移到 离心管内，2500rpm5min4。C。弃上清，用400 u L维持液重悬细胞，反复冻融3次。 置冰上超声破碎30s，冰上静置lmin后再次破碎，于-8(TC保存。 2) JN-2-GP5-DB质粒与安卡拉牛痘病毒重组将CEF接种细胞培养6孔板，细胞接种量为0.6乂106个/ 匕置于37'C (302培养 箱培养过夜。取2个无菌的EP管，1#EP管中加入200uL Opti-MEM和80"L Metafectene,混匀；2# EP管中加入200 u L Opti-MEM禾Q 40 u g JN-2-GP5-DB混匀，
室温放置30min。将两个EP管混合编号3 # ，混匀后室温放置15min。取5 P L MVA 病毒液加入到5mL Opti-MEM中，混匀，取适量的病毒液到3 #EP管中使MOI为0.01 感染单位/细胞，在3弁EP管中添加0pti-MEM使总体积达到2mL。吸弃细胞板内液 体，每孔用lmLOpti-MEM润洗，将3#EP管内液体加到细胞培养6孔板中，加入的 量为lmL/孔，铺满细胞，在37。C孵育4h。每孔加入4mL生长液，置于37°C (302培 养箱培养2天。细胞病变后用细胞刮将贴壁细胞刮落，将2孔细胞悬液混合，转移到 离心管内，2500rpm5min4°C。弃上清，用400ii L维持液重悬细胞，反复冻融3次。 置冰上超声破碎30s，冰上静置lmin后再次破碎，于-80。C保存。实施例6.JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒的筛选1) JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒的筛选(1) JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒的蓝斑筛选 将CEF接种细胞培养6孔板，细胞接种量为0.6X1(^个/ L，置于37C C02培养箱培 养过夜。将JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒置于37"C水浴解冻，置冰上超声破碎30s， 取100wL病毒液于EP管中，将病毒作10-'、 IO'2、 l(T3、 l(T4、 l(T5、 10'6稀释。吸弃细 胞板内培养液，接种病毒液，每孔一个稀释度，置于37X:孵育2h。在病毒孵育过程中， 将2X低熔点琼脂糖和2XMEM于45"C水浴升温。病毒孵育完成后，将2%低熔点琼脂 糖和2XMEM各取10mL混匀，吸弃6孔板内液体，每孔加3mL混好的琼脂糖，4°C 10 15min， 37'C培养2天。将2^低熔点琼脂糖和2XMEM于45X:水浴升温后，各取6.5mL 混匀，加入65"LX-Gluc，每孔加入2mL琼脂糖，4°C 10 15min， 37。C培养24h。在最 高稀释倍数的空内挑选4 5个蓝色斑点，将枪头伸到琼脂糖层以下吸取染成蓝色的细 胞，在显微镜下观察确认。将吸取的细胞放入含400ixL维持液的EP管内，反复冻融3 次。重复筛选8 10轮，直到检测不到野生型的MVA病毒。之后再进行3轮克隆筛选。 (2 ) JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒的Westem-blot鉴定 将筛选得到的JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒进行SDS-PAGE检测，将其转印到硝 酸纤维素膜(NC)上，分别与一抗和二抗作用之后，在底物反应液中显色，结果显 示在23KD处有一条明显的条带。(3) JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒的PCR鉴定以引物GP1， GP2。以筛选得到的JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒为模板进行PCR 扩增，结果显示630bp处有一条清晰的条带。2) JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒的筛选(1) JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒的蓝斑筛选将CEF接种细胞培养6孔板，细胞接种量为0.6X10MV L，置于37'C <:02培养箱 培养过夜。将JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒置于37t:水浴解冻，置冰上超声破碎 30s，取100uL病毒液于EP管中，将病毒作10—1、 10—2、 IO'3、 10—4、 10—5、 10—6稀释。吸 弃细胞板内培养液，接种病毒液，每孔一个稀释度，置于37'C孵育2h。在病毒孵育过 程中，将2X低熔点琼脂糖和2XMEM于45t:水浴升温。病毒孵育完成后，将2%低熔 点琼脂糖和2XMEM各取10mL混匀，吸弃6孔板内液体，每孔加3mL混好的琼脂糖，4 °C 10 15min， 37。C培养2天。将2^低熔点琼脂糖和2XMEM于45t:水浴升温后，各 取6.5mL混匀，加入65 u L X-Gluc,每孔加入2mL琼脂糖，4°C 10 15min， 37。C培养24h。 在最高稀释倍数的空内挑选4 5个蓝色斑点，将枪头伸到琼脂糖层以下吸取染成蓝色 的细胞，在显微镜下观察确认。将吸取的细胞放入含400iiL维持液的EP管内，反复冻 融3次。重复筛选8 10轮，直到检测不到野生型的MVA病毒。之后再进行3轮克隆筛 选。(2) JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒的Westem-blot鉴定将筛选得到的JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒进行SDS-PAGE检测，将其转印 到硝酸纤维素膜(NC)上，分别与一抗和二抗作用之后，在底物反应液中显色。 (3) JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒的PCR鉴定 设计引物GP3:5-TAAACCCACCATGCTG-3， GP4:5-CGCGCCTCACAGGCGGCCCCACG-3。以筛选得到的JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒为模板进行 PCR扩增，结果显示614bp处有一条清晰的条带。实施例7. JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒免疫BALB/c小鼠。分别将5 6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒， JN-2，JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒和PRRS弱毒疫苗四个免疫组,每组5只。以 每z口、 100ixg(100uL体积)的量经后腿肌肉注射免疫小鼠，共免疫2次，间隔2周。于 首免后第2、 4、 6周尾部负压采血分离血清。实施例8.免疫小鼠血清抗体的检测用ELISA方法检测血清中GP5及GP5-DB特异性ELISA抗体。其中以pGEX-4T-2 原核表达的GST-GP5和GST-GP5-DB融合蛋白作抗原包被酶标板，一抗为待检血清，二 抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。以PRRSV疫苗免疫的小鼠血清作为阳性对照，先用棋盘 滴定法确定最佳的抗原包被浓度和血清稀释倍数。然后用建立的标准ELISA方法检测 免疫组小鼠的ELISA抗体(结果见图十一、图十二)。用微量中和试验检测血清中针对PRRSV的中和抗体。其中将被检血清于56t:灭 活30min后,在96孔细胞培养板中将血清作连续2倍的倍比稀释,从1 : 2至l : 128 , 每孔50"L ; PRRSV病毒液为100TCID5Q,于37。C，5。/。CO2培养箱中作用lh,再于每孔 中滴加2X105个/mL的Marc-145细胞悬液100uL ,继续培养4-5d ,观察细胞病变情 况并记录中和效价,以能完全保护细胞不发生病变的血清最高稀释倍数为其中和效价 (结果见图十三、图十四)。实施例9.免疫小鼠的保护性实验分别将5 6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒， JN-2， JN-2-GP5-DB安卡拉牛痘重组病毒和PRRS弱毒疫苗四个免疫组、 一个阴性对 照组和一个空白对照组，每组IO只。免疫组以每只5X107PFU (100uL体积)的量 经后腿肌肉注射免疫小鼠,共免疫2次，间隔2周。阴性对照组和空白对照组以每只 100"L的量经腹腔注射PBS，共免疫2次，间隔2周。第2次免疫2周后，免疫组和 阴性对照组以每只10.5TCID5Q/mL的PRRS强毒攻击，空白组以每只100uL的量经 腹腔注射PBS。观察BALB/c小鼠的存活情况(结果见图十五)。 实施例IO.免疫猪的保护性实验(1) 低日龄乳猪的保护性实验分别将3日龄乳猪随机分成JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒，JN-2-GP5-DB安卡 拉牛痘重组病毒和PRRS弱毒疫苗三个免疫组、 一个阴性对照组和一个空白对照组， 每组5只。免疫组以每只5Xl()SpFU(lmL体积)的量经肌肉注射免疫乳猪,共免疫2 次,间隔2周。阴性对照组和空白对照组以每只lmL的量经肌肉注射PBS，共免疫2次, 间隔2周。第2次免疫2周后，免疫组和阴性对照组以每只105.8TCID5()/mL的PRRS 强毒攻击，空白组以每只lmL的量经肌肉注射PBS。观察乳猪的存活情况(结果见 图十六)。(2) 妊娠母猪的保护性实验分别将后备猪随机分成JN-2-GP5安卡拉牛痘重组病毒，JN-2-GP5-DB安卡拉牛 痘重组病毒，PPRS弱毒疫苗三个免疫组、 一个阴性对照组和一个空白对照组，每组5 只。免疫组以每只5Xl("PFU(lmL体积)的量经肌肉注射免疫妊娠母猪，共免疫2次， 间隔2周。阴性对照组和空白对照组以每只lmL的量经肌肉注射PBS，共免疫2次， 间隔2周。在妊娠85 d时，免疫组和阴性对照组以每只205.8TCID5o/mL的PRRS强 毒攻击，空白组以每只lmL的量经肌肉注射PBS。观察母猪产仔的存活情况(结果 见图十七)。
结果本发明从PRRSV中PCR扩增得到GP5基因(图l);委托GenScriptCorp公司合成优 化的GP5A(图2);利用PCR将优化GP5基因中的表位A替换为猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因的表位B ，得到GP5-DB序列(如图7)并克隆至ljpUC57载体中；成功构建了 重组质粒JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB 。方阵滴定确定的最佳抗原包被浓度为0.1yg/ml，血清稀释倍数为l: 200， ELISA 结果表明改造的重组DNA疫苗JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB的免疫组诱导的ELISA抗体 要明显高于PRRS弱毒疫苗免疫组(P < 0.05) ， JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB抗体水平相差 不大，空载体对照免疫组没有检测到抗体，表明GP5和GP5-DB具有更好的免疫原性。 (见图十一、图十二)。微量中和试验表明在二免后2周各组鼠血清在Marc—145细胞上检测中和抗体效 价(结果见图十三和图十三四)。PRRS弱毒疫苗免疫组可剌激小鼠产生中和抗体(平 均值为l : 19.2 )，JN-2-GP5免疫可将中和抗体效价提高到l : 32与PRRS弱毒疫苗免疫 组差异显著(PO.05); JN-2-GP5-DB免疫组可刺激小鼠产生中和抗体(平均值为l : 10.6 )， JN-2-GP5-DB免疫不仅可将中和抗体效价提高到l : 16与PRRS弱毒疫苗免疫 组差异显著(PO.05),空载体对照组血清l :2稀释时没有检测到中和抗体。以下为本发明涉及的核苷酸序列的序列表，表中序列l为用猪偏爱密码子替换了 原有天然密码子的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的核苷酸序列；序列2为利用PCR 方法将优化的GP5A基因中的表位A替换为猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因表位B的 核苷酸序列。 序列表〈110〉国营武昌造船厂〈120>猪繁殖与呼吸综合征一安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗〈130〉 1<160> 2〈170〉 Patentln version 3.3〈210〉 1〈211> 636<212> DNA 〈213〉人工序列<400> 1 gtttaaacccaccatgctgggcaagtgcctgaccgccggctgctgctcccggctgctgtc60cctgtggtgcatcgtgcccttctacctggccgtgctggtgaacgccagcaacaacagctc120ctcccacatccagctgatctacaacctgaccctgtgcgagctgaacggcaccgactggct180ggccaagaacttcaaccgcgccgtgg卿ccttcgtgatcttccccgtgctgacccacat240cgtgagctacggcgccctgaccacctcccacttcctggacaccgtgggcctggtgaccgt300gagcaccgccggctactaccaccgccgctacgtgctgtcctccatctacgccgtgtgcgc360cctggccgccctgatctgcttcgtgatccgcctggccaagaactgcatgtcctggcgcta420ctcctgcacccgctacaccaacttcctgctggacaccaagggcaagctgtaccggtggcg480ctcccccgtgatcgtggagaagggcggcaaggtgg gtggagggccacctgatcgacct540gaagcgcgtggtgctggacggcagcgtggccacccccctgacccgcgtgtccgccgagca600gtggggccgcctgtgaaaaaaaaaaaaaggcgcgcc636〈210〉 2 〈211〉 645 〈212〉 <213>人工序列〈400〉 2 gtttaaacccaccatgctgggcaagtgcctgaccgccggctgctgctcccggctgctgtc60cctgtggtgcatcgtgcccttctacctgtctcatattcagttgatttataacgccagcaa120caacagctcctcccacatccagctgatctacaacctgaccctgtgcgagctgaacggcac180cgactggctggccaagaacttcaaccgcgccgtgg ccttcgtgatcttccccgtgct240gacccacatcgtgagctacggcgccctgaccacctcccacttcctggscaccgtgggcct300ggtgaccgtgagcaccgccggctactaccaccgccgctacgtgCtgtCCtccatctacgc360 cgtgtgcgcc ctggccgccc tgatctgctt cgtgatccgc ctggccaaga actgcatgtc 420ctggcgctac tcctgcaccc gctacaccaa cttcctgctg gacaccaagg gcaagctgta 480ccggtggcgc tcccccgtga tcgtggagaa gggcggcaag gtggaggtgg agggccacct 540gatcgacctg aagcgcgtgg tgctggacgg cagcgtggcc acccccctga cccgcgtgtc 600cgccgagcag tggggccgcc tgtgaaaaaa aaaaaaaggc gcgcc 64权利要求
1. 猪繁殖与呼吸综合征-安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗，其特征在于，它是含有用猪偏爱密码子替换了原有天然密码子的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的安卡拉牛痘病毒。
2. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征一安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗， 其特征在于所述的用猪偏爱密码子替换了原有天然密码子的猪繁殖与呼吸综合征病 毒GP5基因具有序列表中序列1所述的核苷酸序列。
3. 猪繁殖与呼吸综合征一安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗，其特征在于，它是含 有序列表中序列2所述的核苷酸序列的安卡拉牛痘病毒。
4. 一种猪繁殖与呼吸综合征一安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗的制备方法，包括 以下步骤(1) 从天然猪繁殖与呼吸综合征病毒中PCR扩增GP5基因；(2) 用猪的偏爱密码子替代天然GP5基因中的密码子，使天然猪繁殖与呼吸综 合征病毒GP5基因核苷酸序列得到优化，优化的GP5基因序列称为GP5A，合成该优 化的序列GP5A;(3) 将优化的GP5基因克隆到真核表达载体JN-2中；(4) 将构建的JN-2-GP5质粒与安卡拉牛痘病毒重组；(5) 筛选得到猪繁殖与呼吸综合征GP5基因安卡拉牛痘重组病毒。
5. —种猪繁殖与呼吸综合征一安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗的制备方法，包括 以下步骤(1) 从天然猪繁殖与呼吸综合征病毒中PCR扩增GP5基因；(2) 用猪的偏爱密码子替代天然GP5基因中的密码子，使天然猪繁殖与呼吸综 合征病毒GP5基因核苷酸序列得到优化，优化的GP5基因序列称为GP5A;合成该优 化的序列GP5A;(3) 利用PCR将优化的GP5A基因中的表位A替换为猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因的表位B，新合成的基因称为GP5-DB基因；(4) 将GP5-DB基因克隆到真核表达载体JN-2中；(5) 将构建的JN-2-GP5-DB质粒与安卡拉牛痘病毒重组；(6) 筛选得到猪繁殖与呼吸综合征GP5-DB基因安卡拉牛痘重组病毒。
全文摘要
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征-安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗，其制备方法是1.从天然猪繁殖与呼吸综合征病毒中PCR扩增GP5基因；2.用猪的偏爱密码子替代天然GP5基因中的密码子，使GP5基因优化，合成该优化的序列GP5A；3.将优化的GP5A基因中的表位A替换为GP5基因的表位B，得GP5-DB基因；4.将GP5和GP5-DB基因分别克隆到表达载体JN-2中；5.将构建的JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB质粒与安卡拉牛痘病毒重组，得到猪繁殖与呼吸综合征GP5和GP5-DB基因安卡拉牛痘病毒重组疫苗。实验证实其在BALB/c小鼠和猪体内其具有优良的免疫保护性。
文档编号A61K48/00GK101209351SQ200610166610
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月31日 优先权日2006年12月31日
发明者俊 严, 娟 吴, 孙永林, 封江南, 超 李, 王忠德, 王迁迁, 胡勤勤, 佳 魏 申请人:国营武昌造船厂