专利名称：肌肉再生的制作方法
月几肉再生发明领域本发明涉及通过活化卫星细胞来诱导肌肉再生的方法，其尤其用于但不局限于治疗肌肉减少症(sarcopenia )。
技术背景肌肉组织再生所涉及的常规机制最初包括卫星细胞的募集。肌肉卫星 细胞(satellite cell)是独特的成肌先祖谱系，其位于成熟肌纤维(myofiber) 的基膜和肌纤维膜之间(Bischoff， 1994; Grounds和Yablonka-Reuveni, 1993)。在再生周期中，卫星细胞被活化并从肌纤维迁移至再生位点，从而 产生成肌细胞(myoblast)。大多数增殖的成肌细胞分化成肌管。肌管成熟 并掺入肌纤维。剩下的成肌细胞返回肌纤维以更新卫星细胞群，因而能继 续进行再生周期(图l-示意图)。近来的研究也证明了巨噬细胞在骨骼肌再生的早期事件中的作用 (Merly等，1999)。移植模型显示，刺激巨噬细胞浸润会造成卫星细胞较早 活化，这证明了巨噬细胞的确在肌肉再生中起着直接作用(Lescaudron等， 1997; Lescaudron等，1993)。肌肉再生周期在个体整个生命周期中持续发生，以替换磨损的或损坏 的肌肉组织。可是，当肌体衰老时，肌肉再生周期变得较不有效了。肌肉 减少症(sarcopenia),其造成了肌肉质量和性能降低，其与正常衰老相关。 当骨骼肌仍旧能对本身进行再生时，似乎在衰老的肌肉中的环境较不能支 持肌肉卫星细胞活化、增殖和分化，这造成了肌肉组织的净损耗(Greenlund 和Nair， 2003)。在骨骼肌肉再生中指导巨噬细胞、卫星细胞和成肌细胞迁移的化学信 号的性质并未完全被理解清楚。一些生长因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)和机才成生长因子(Mechano Growth Factor) (MGF),显示能通过调节 卫星细胞活化来正向影响肌肉再生(Floss等，1997; Miller等，2000， Goldspink和Harridge， 2004)。可是目前，没有生长因子用于临床应用，而且肌肉减少 症的治疗限于体育运动、或补充生长激素(Greenlund和Nair， 2003)。这些疗 法仅达到有限的成功率。因此有需求要通过卫星细胞活化、增殖和分化来提供在肌肉减少症中 用于肌肉再生的有效临床治疗。本发明的目的是以某些方式满足该需求和/或至少提供有用的选择。发明简述令人惊讶地，生长因子——肌肉生长抑制素(myostatin)， TGF-J3家族 的生长因子成员，首次显示出涉及肌肉减少症的病因。抑制肌肉生长抑制 素活性被发现能在肌肉减少症的动物模型中显著增进卫星细胞的活化。因此，本发明提供了治疗肌肉减少症的方法，其包括向有需要的患者 施用有效量的至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。本发明可用于治疗 人和非人患者的肌肉减少症、以及与肌肉减少症相关的疾病，其特征在于 肌肉萎缩和卫星细胞活化能力的降低。肌肉生长抑制素拮抗剂可选自任意一种或多种已知的肌肉生长抑制素 抑制剂。例如，US 6096506和US 6468535 4皮露了抗肌肉生长抑制素抗体。 US 636920l和WO 01/05820教导了肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑 制素多聚体和肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉 生长抑制素活性。肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂在WO 02/085306中有公 开，其包括截短的II型激活蛋白(Activin)受体、肌肉生长抑制素前域、和知的，包括例如，从过量表达肌肉生长抑制素的细胞释放入培养物中的 肌肉生长抑制素抑制剂(WO 00/43781);显性阴性的肌肉生长抑制素(WO 01/53350),其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替换为酪氨 酸)和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第 335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。 US2004/0181033也教导了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合 并抑制肌肉生长抑制素。一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂优选包含 一 种或多种选自由肌肉生 长抑制素肽和Piedmontese等位基因组成的组的显性阴性产物，所述肌肉生
长抑制素肽在氨基酸第335、 350位上或氨基酸第335、 350位之间被C-末 端截短了。体，所述剪接变体包含SEQ ID NO: 8-14之任一项的多肽、或其功能片段 或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括与肌肉生长抑制素途径有 关的调节剂，所述调节剂包含多肽SEQIDNO: 16或SEQIDNO: 18、或 其功能片段或变体、或与其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70% 序列同一性的序列。肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括反义多核苷酸、干扰RNA分子(例如 RNAi或siRNA)、或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过抑制肌肉生长抑制 素的基因表达来抑制肌肉生长抑制素活性。当一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂包括抗体时，则抗体可以是源自 哺乳动物或非哺乳动物的抗体，例如源自鲨鱼的IgNAR抗体，或者抗体可 以是人源化抗体、或包含源自抗体的功能片段。本发明还提供一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂在制备用于治疗有需 要的患者的肌肉减少症的药物中的用途。一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂可以选自以上公开的肌肉生长抑制 素拮抗剂组。药物可配制成用于局部或全身施用，例如，药物可配制成直接注射入 肌肉，或可配制成口服施用，用于全身递送至肌肉。本发明进一步提供了组合物，其包含一种或多种肌肉生长抑制素拮抗 剂和药学上可接受的载体，用于治疗有需要的患者的肌肉减少症。本发明进一步提供了 一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂，其用于治疗 有需要的患者的肌肉减少症。现在，本发明将参考所附的附片来更详细地描述，其中附图简述
图1 显示了卫星细胞在肌肉再生中作用的示意性模型； 图2A显示了通过肌肉生长抑制素来抑制卫星细胞活化；
图2B显示了当从培养基中去除肌肉生长抑制素(拯救)时，肌肉生长抑制素对卫星细胞的活化抑制是可逆的；图2 C显示了肌肉生长抑制素对卫星细胞迁移的影响；图2D显示了带有BrdU阳性核的典型肌纤维(i)和带有DAPI染色核的相 同肌纤维(ii)的显樣i照片；图3A显示了在分离自1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的胫骨前肌的纤维上，每100个肌核(myonuclei)中的卫星细胞百分 比。通过对CD34免疫染色来显现卫星细胞，并通过DAPI复染显现总核。 纤维分离自每组的3只动物，每组有超过l， 000个核被计数(P〈 0.001);图3B显示了在分离自1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的胫骨前肌的纤维上，每100个肌核中活化的卫星细胞百分比。通过 体外BrdU结合呈现活化的卫星细胞，并通过DAPI复染来呈现总核。纤维 分离自每组的3只动物，每组有超过l， 000个核被计数(P〈 0.05);图3C显示了流式细胞术确定的BrdU阳性细胞的百分比。卫星细胞在 体内用BrdU标记并利用Percoll梯度离心分离自1个月和6个月大的野生 型和肌肉生长抑制素-缺失的后肢肌肉。每个样品组最少分析10, 000个细 胞一式三份(P〈 0.001)。空心柱代表1个月大的小鼠，实心柱代表6个月大 的小鼠。各种小写字母显示了数据间显著的差异；图4显示了分离的纤维上的PCNA阳性核的数量。分离的纤维与5吗 或10 pg 350 —起温育并用PCNA抗体免疫染色以确定每100个肌核中活化 的卫星细胞数。数据表示为平均值土s.e.m(^ = P< 0.001);图5A显示了苏木精和曙红染色的野生型和肌肉生长抑制素缺失的 小鼠的对照肌肉切片；图5B显示了虎蛇毒素注射后一天(D^)的低倍视野观察结果；图5C显示了与(B)相同的切片的较高倍视野观察结果，染色显示 了肌纤维嗜曙红的(e)细胞质以及细小的细胞内空泡化(v),细胞内空间增 加和显著的肌纤维断裂(箭头)；图5D显示了第2天(D2)的肌肉切片，其在肌肉生长抑制素缺失的小鼠的 肌肉中核数目增力口(箭头)。箭头朝向标明了沿着坏死的肌纤维边缘的肌核；图5E显示了第3天(D3)的肌肉切片，其在野生型和肌肉生长抑制素缺失 的肌肉中都有浸润的单核细胞，但在肌肉生长抑制素缺失的切片中数
目更高。刻度条等于10pm;图5F显示了第5天的切片(D5),其在虎蛇毒素处理的肌肉生长抑制素缺 失的肌肉切片中核数目增加；图6A显示了在野生型(肌肉生长抑制素+/+)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉 生长抑制素,的再生肌肉中的MyoD阳性成肌前体细胞百分比；图6B显示了在野生型(肌肉生长抑制素+/+)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉 生长抑制素勺的再生M^肉中的Mac-l阳性细胞百分比；图6C显示了虎蛇毒素注射后最多28天时，MyoD和肌细胞生成素基因 在对照未受损的肌肉(C)和再生野生型(wt)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉生长 抑制素缺失)的肌肉中的表达图谱。G APDH用作为对照来显示所用的RN A等量；图7 显示了虎蛇毒素注射后2、 3、 7和10天，在用盐水处理和用肌肉 生长抑制素抑制剂350处理的小鼠中，在再生的肌肉中的Macl阳性细胞平均 数；图8 显示了在虎蛇毒素注射后第14(D14)、 21(D21)和28(D28)天，在得 自肌肉生长抑制素敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的组织切片上的免疫荧光。 野生型组织显示出较强的着色密度，即比敲除组织有更高的波形蛋白阳性 细胞浓度；图9 显示了肌肉生长抑制素对巨噬细胞迁移的化学抑制效应以及利 用肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350 位上C-末端截短了 )而得到的恢复；图10A 显示了肌肉生长抑制素对绵羊初级成纤维细胞(primary fibroblast)的化学吸引效应；图10B 显示了肌肉生长抑制素对绵羊初级成肌细胞(primary myoblast)的化学抑制效应以及利用肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌 肉生长抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)而得到的恢复；图11显示了第28天的(D28)野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉切片 的苏木精和曙红染色(H&E)以及Van Geisen(iii)染色的的低倍(i)和高倍(ii)显 微照片。在野生型肌肉切片(ii)中见到了厚的结締组织(箭头)；在野生型肌肉 切片(iii)中见到了胶原(箭头)，刻度条等于10 jim;在(iv)中显示了再生24 天后野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉的扫描电子显微图；刻度条等于
120图12显示了从虎蛇毒素注射中恢复的小鼠中肌肉生长抑制素拮抗剂 (显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)对肌肉 重量的影响；图13A-D显示了虎蛇毒素注射后第7天(A-用盐水处理；B-用肌肉生长抑 制素拮抗剂350处理)和第10天(C-用盐水处理；D-用肌肉生长抑制素拮抗剂 350处理)，得自再生肌肉的苏木精和曙红染色的肌肉切片。星号显示了坏死 区域；图14显示了图13月几肉切片的未再生的d和再生的,面积的百分比；图15显示了虎蛇毒素注射后第10和28天，在用盐水处理和用肌肉生长 抑制素抑制剂350处理的小鼠中，再生肌肉中的胶原形成的百分比；图16显示了虎蛇毒素注射后第28天在用盐水处理和用肌肉生长抑制 素抑制剂350处理的小鼠中，再生的肌纤维平均纤维面积；图17显示了施用虎蛇毒素后第1、 3、 7、 10和28天，在用盐水和350 处理的胫骨前肌中，基因Pax7 (A)和MyoD (B)蛋白质水平(通过蛋白质印迹 法一金测)；和图18显示了受损后第2和4天再生肌肉中的炎性应答增加，以及(在第21 天)再生肌肉中肌肉质量增加。定义在整个说明书和权利要求书中使用的"肌肉减少症"指由于年老而造成 的肌肉质量和性能的降低、以及与肌肉减少症相关的病况，其特征在于肌 肉萎缩和卫星细胞活化能力的降低。在整个说明书和权利要求书中使用的"肥大"指细胞大小的任何增加。 在整个说明书和权利要求书中使用的"增生"指细胞数量的任何增加。 在整个说明书和权利要求书中使用的"肌肉萎缩"指由于缺少使用而造 成的肌肉组织的任何损耗(wasting)或丧失。在整个说明书和权利要求书中使用的"抑制剂，，或"拮抗剂"指任何化合 物，其用于全部或部分降低蛋白质活性。它包括能结合并直接抑制蛋白质 活性的化合物，或可用于减少蛋白质的产生或增加其产量，由此影响存在
的蛋白质的量并由此降低其活性。在整个说明书和权利要求书中使用的"基因表达"指转录起始、将DNA片段转录成mRNA、并将mRNA翻译成多肽。在整个说明书和权利要求书中使用的"包含"指'至少部分由......组成，，也就是指当解释包括该术语的独立权利要求时，每个权利要求中从该术语 开始的特征都需要出现，但其他特征也可以出现。发明详述本发明首次显示了，肌肉生长抑制素参与肌肉减少症的病因。尤其， 肌肉生长抑制素显示出是卫星细胞活化、增殖、和分化、以及因此在肌肉少症和与肌肉减少症相关的疾病的特征在于骨骼肌萎缩和卫星细胞活化能 力降低。肌肉生长抑制素是已知参与调节肌肉生长的生长因子。尤其，肌肉生 长抑制素是TGF-(3家族的生长因子成员并是肌形成有效的负调节剂 (McPherron等，1997)。肌肉生长抑制素敲除的小鼠极大地增加了它们整个身体中的肌肉质 量。肌肉生长抑制素缺失的小鼠也比正常小鼠体重增加大约30%,并由于肌 纤维增生和肥大而显示出个体肌肉重量增加2-3倍。肌肉生长抑制素中的天 然突变被鉴定出是造成"肌肉倍增"表型的原因，"肌肉倍增"表型例如Bdgian Blue和Piedmontese牛品种(McPherron等1997b, Kambadur等.1997, Grobet 等1997)。近来研究暗示，肌肉生长抑制素通过调节肌形成的增殖和分化步骤而 是细胞周期进程和功能的有效调节剂(Langley等，2002; Thomas等，2000)。 几个研究证明了肌肉生长抑制素不仅在胚胎肌形成期间起作用，而且在出 生后的肌肉生长中也起作用。Wehling等(Wehling等，2000)和Carlson等 (Carlson等，1999)的研究表明，由于小鼠后肢吊起而造成的与萎缩相关的肌 肉丧失与M p/朋ton's中肌肉生长抑制素水平的增加有关。肌肉生长抑制素水 平增加也与HIV患者中所见的严重肌肉损耗有关(Gonzalez-Cadavid等， 1998)。对于在肌肉不被使用期间观察到的肌肉生长抑制素水平升高的一个 解释是，肌肉生长抑制素可用作卫星细胞活化的抑制剂。这当然为近来的 研究所支持，该研究显示了缺少肌肉生长抑制素会造成活化的卫星细胞在体内增加堆积并增强卫星细胞的自我更新(McCroskery等，2003)。至今已经暗示了肌肉生长抑制素的许多潜在应用，包括开发肌肉生长 抑制素抑制剂以帮助调节动物的整个体重，或用于治疗与 一般肌肉损耗相 关的病况。可是，当前没有临床或兽医应用的肌肉生长抑制素抑制剂。另 外，肌肉生长抑制素以前并没有与衰老中见到的肌肉质量和功能的天然下 降(肌肉减少症)有过关联。因此，本发明涉及治疗肌肉减少症的方法，其包括向有需要的患者施 用有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。患者优选是人患者，肌肉生长抑制素拮抗剂可选自 一种或多种分子，其能全部或部分抑制 肌肉生长抑制素活性。尤其，肌肉生长抑制素拮抗剂可选自任意 一 种或多种已知的肌肉生长 抑制素抑制剂。例如，US 6096506和US 6468535 4皮露了抗肌肉生长抑制 素抗体。US 6369201和WO 01/05820教导了肌肉生长抑制素肽免疫原、肌 肉生长抑制素多聚体和肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并 阻断肌肉生长抑制素活性。肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂在WO 02/085306中有公开，其包括截短的II型激活蛋白受体、肌肉生长抑制素前也是已知的，包括例如，从过量表达肌肉生长抑制素的细胞释放入培养 物中的肌肉生长抑制素抑制剂(WO 00/43781);显性阴性的肌肉生长抑制素 (WO 01/53350)，其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替换 为酪氨酸)和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨 基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。 US2004/0181033也教导了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且所述小肽 能结合并抑制肌肉生长抑制素。优选肌肉生长抑制素拮抗剂是显性阴性的肽。这些肽衍生自亲本蛋白 质，其发挥抑制亲本蛋白质的生物活性的作用。如上所述，肌肉生长抑制 素的显性阴性(dominant negative )的肽是已知的，包括成熟的肌肉生长抑 制素肽(其在氨基酸第335、 350位上或氨基酸第335、 350位之间C-末端 截短了 )和Piedmontese等位基因(其中第3位上的半胱氨酸替换成酪氨酸)。
最初产生的肌肉生长抑制素是375个氨基酸的前体分子，其N-末端上 具有分泌信号序列，切掉它后产生无活性的原(pro-)形式。通过弗林蛋白 内切蛋白酶在Arg 266裂解，释放出N-末端的前域(或与潜伏期相关的肽 (LAP)结构域)和成熟的肌肉生长抑制素结构域，由此活化了肌肉生长抑制 素。可是，裂解后，前域仍旧能与成熟的结构域结合成无活性的复合物(Lee 等2001)。所以，前域、或其片段也可在本发明中用作肌肉生长抑制素拮抗 剂来治疗M^肉减少症。肌肉生长抑制素的剪接变体已经被鉴定出来了 ，其也可用作肌肉生长 抑制素拮抗剂(PCT/NZ2005/000250)。肌肉生长抑制素剪接变体(MSV)由 额外的剪接事件产生，该事件去除了第三个外显子的大部分。产生的MSV 多肽，在绵羊(oMSV; SEQIDNo: 8)和牛MSV (bMSV; SEQIDNo: 11) 中与天然的肌肉生长抑制素前肽共有最开始的257个氨基酸，但具有独特 的64个氨基酸C-末端(绵羊oMSV65， SEQIDNo: 9和牛bMSV65， SEQ IDNo: 12)。 mRNA有195个核苷酸的差别，可是，MSV第257位上的缬 氨酸残基与常规的肌肉生长抑制素序列的相同。Belgian Blue牛的MSV (bMSVbb; SEQ ID No: 7)编码短了 7个氨基酸的314个氨基酸长的蛋白质 (SEQ ID No: 14),但是余下的蛋白质序列在两个检测的品种中显示出具有 完全的同源性。在bMSVbb中，独特的65个氨基酸的C-末端肽(SEQ ID No: 12)是保守的。也已经发现了对于包括了弗林蛋白内肽酶在内的前肽转变酶(PC1-7) 来说，(KERK)裂解位点存在于第271至274位上。在第274位上裂解释放 出有47个氨基酸的C-末端成熟的MSV片段(绵羊oMSV47, SEQIDNo: 10和牛bMSV47， SEQIDNo: 13)。65个氨基酸的MSV片段(SEQ ID NO: 12)显示出在体外可用作为肌 肉生长抑制素拮抗剂(PCT/NZ2005/000250),而且预计在体内，MSV将可用 于调节肌肉生长抑制素活性。所以，本文公开的MSV多肽可用于抑制肌肉 生长抑制素，由此根据本发明而治疗肌肉减少症。通过导入干扰转录和/或翻译的多核苷酸，可改变肌肉生长抑制素基因表达。 例如，可导入反义多核苷酸，其包括反义表达载体、反义寡脱氧核糖核 酸、反义硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸、反义寡核糖核苷酸、反义硫代磷 酸酯寡核苷酸、或任何现有已知的其他形式，其包括应用化学修饰以增强 反义多核苷酸的功效。通过现有已知方法可产生肌肉生长抑制素的反义分子，如通过(Raybum等2005)所述的以及肌肉生长抑制素基因序列 (McPherron等1997)的知识来进行。将能理解，任何反义多肽不必100%互补于所讨论的多核苷酸，而需 要有足够的同一性以使反义多核苷酸结合于基因上，或结合于mRNA上来 破坏基因表达，而不实质性地破坏其他基因的表达。也可以理解，互补于 包括5 ，非翻译区域的基因的多核苷酸也可用于破坏肌肉生长抑制素蛋白的 翻译。同样，这些互补的多核苷酸不必100%互补，而要能足以结合mRNA 并破坏翻译，而不实质性地破坏其他基因的表达。基因表达的调节也可包括应用干扰RNA分子，其包括RNA干扰(RNAi) 或小干扰RNA(siRNA)，这将为技术人员通过学习已知技术所理解(Ren等 2006)。基因表达的调节也可通过使用催化性RNA分子或核酶来实现。现有已 知这类核酶可被设计成与特异性靶向的RNA分子配对。核酶结合并裂解靶 向的RNA (Nakamura等2005)。现有已知的任何其他调节基因表达和RNA加工的技术也可用于调节肌 肉生长抑制素基因表达。另一种肌肉生长抑制素拮抗剂是衍生自肌肉生长抑制素受体的肽。该野生型肌肉生长抑制素。肌肉生长抑制素受体是IIB型激活蛋白，其肽序列 在(Lee等2001)中有描述。熟练技术人员无需过多实验就可生产出该受体拮 抗剂。 '另 一种肌肉生长抑制素拮抗剂包括抗肌肉生长抑制素抗体。抗肌肉生 长抑制素的抗体是现有已知的，如上所述，产生该抗体的方法也是现有已 知的。抗体可以是哺乳动物或非哺乳动物的抗体，例如鲨鱼的IgNAR类抗 体；或衍生自能结合肌肉生长抑制素的任何这种蛋白质的片段或衍生物。称为"强效(mighty)"，其被公开于PCT/NZ2004/000308中，其用于促进 肌肉生长。通过肌肉生长抑制素可抑制"强效"表达，所以它涉及相同的信号传导途径。所以将可理解，不直接抑制肌肉生长抑制素，而使用对抗肌 肉生长抑制素信号传导作用的肽(例如"强效")可用于治疗肌肉减少症。能理解，编码"强效"基因的多核苷酸(绵羊SEQIDNo: 15和牛SEQ ID No: 17)可用于在肌肉上进行局部基因治疗，其能永久或瞬时表达"强效"， 或可选地可直接使用"强效"蛋白质(绵羊SEQ ID No.16和牛SEQ ID No.l8)。将可理解，由于遗传密码的冗余性，可产生与SEQ ID No: 15-18 中所公开的那些不完全一样、但具有基本相同活性的序列。另外，也可产 生在非关键结构域上有改变、但具有基本相同的功能的其它肽。改变可包 括插入、缺失、或将一个氨基酸残基变化为另一个。这类变化包含在本发 明的范围内。本发明基于以下发现，即肌肉生长抑制素拮抗剂能治疗肌肉减少症， 所以任何已知的或开发中的肌肉生长抑制素拮抗剂都适用于该方法中。这 包括了任何能结合肌肉生长抑制素的分子，例如，Eco/z'的IMM7免疫蛋白 质、或现有已知的任何其他种类的结合蛋白质。其他能结合并抑制肌肉生 长抑制素的肽是已知的，例如，含氨基酸WMCPP的肽(US2004/0181033)。药物中。用于本发明方法中的肌肉生长抑制素拮抗剂可在肌肉再生的动物模型 或体外模型中测试生物活性，所述肌肉再生包括下面所讨论的肌肉减少症，并适宜地将活性化合物配制成药物组合物。除了本文所述的一种或多种肌 肉生长抑制素拮抗剂，本发明的药物组合物可包括药学上可接受的赋形剂、 载体、緩冲液、稳定剂或其他现有公知的材料。该材料应是无毒的并应当 不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质将取决于药物组合物 所需的性质和施用途径，如口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、局部、鼻 腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用途径。口服施用的药物组合物可以是片剂、锭剂、胶嚢、粉剂、颗粒剂或液 体形式。片剂或其它固体口服剂型通常将包括固体载体，如明胶、淀粉、 甘露醇、结晶纤维素、或其它药物制备中常用的惰性材料。相似地，液体 药物组合物，如糖浆剂或乳剂， 一般将包括液体载体，如水、石油、动物 或才直物油、石,物油或合成油。对于静脉内、经皮、皮下、皮内或腹膜内注射，活性成分将是可接受
的非肠道水溶液的形式，其不含热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。对于鼻腔或肺部施用，活性成分将是适于吸入的微小粉末或溶液或悬 浮液的形式。可选地，活性成分可以是适于直接应用于鼻粘膜的形式，如 膏剂或乳剂、鼻腔喷雾剂、鼻腔滴剂或气雾剂。(2000)方法在老年鼠模型中被验证。在另一个具体实施方式
中，本发明预见到了一种或多种肌肉生长因子的用途，其与本发明的药物组合物联合施用以使治疗方案获得额外的或协 同的效果。该生长因子可选自由HGF、 FGF、 IGF、 MGF、生长激素等组成 的组。该物质可与本文所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序 或同时施用。施用本发明的药物组合物优选以"预防有效量"或"治疗有效量，，来进行， 其量足以对个体显示出有益效果。实际施用量、和施用速率和时程将取决 于要治疗的肌肉减少症的性质和严重性。开治疗处方，如决定剂量等，在 开业医生和其它内科医生的职责范围内，其典型地将考察要治疗的疾病、 病患个体状况、递送位点、施用方法和其它医师所知的因素。上述技术和 规程的例子可以在Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版,Oslo, A. (编)，l兆0中找到。本发明也涉及 一 种或多种肌肉生长抑制素抑制剂在制备用于治疗有需 要的患者的肌肉减少症的药物中的用途。 一 种或多种肌肉生长抑制素拮抗 剂可选自上述肌肉生长抑制素拮抗剂的组。药物可配制成用于局部或全身施用的配方，例如，药物可配制成用于 直接肌肉注射的配方，或可配制成口服施用的配方，以用于向肌肉全身递 送。药物可进一步包含一种或多种其他肌肉生长促进化合物以为治疗肌肉 减少症带来额外或协同效应，所述肌肉生长促进化合物选自由HGF、 FGF、 IGF、 MGF、生长激素等组成的组。药物可配制成一种或多种肌肉生长抑制 素拮抗剂和一种或多种肌肉生长促进化合物分开、顺序或同时施用的配方。不限于理论，可认为通过包括诱导卫星细胞活化、增殖和分化，肌肉 生长抑制素拮抗剂有效治疗肌肉减少症。例如，抑制肌肉生长抑制素活性，已经显示出对肌肉再生有直接效果。
尤其，当缺少肌肉生长抑制素(在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中)、或利用肌 肉生长抑制素拮抗剂抑制肌肉生长抑制素的时候，卫星细胞和成肌细胞迁 移增加了。另外，卫星细胞活化在衰老肌肉中首次显示出显著增加。另外，抑制肌肉生长抑制素活性首次显示出对巨噬细胞募集有直接效 果。尤其，当缺少肌肉生长抑制素(在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中)、或利向再生位点迁移的时间增加了 。如上所述，巨噬细胞被认为涉及卫星细胞 活化。因此显示出，抑制肌肉生长抑制素直接用于增加卫星细胞迁移和活化， 并通过巨噬细胞募集而间接作用于卫星细胞活化。肌肉生长抑制素缺失的小鼠中的结果间接显示了抑制肌肉生长抑制素 活性会造成卫星细胞活化、增殖和分化的增加。这提示了抑制肌肉生长抑 制素可用于在具有正常肌肉生长抑制素水平的动物中增加卫星细胞的活 化。可是，由于卫星细胞是胚胎来源的，而且肌肉生长抑制素缺失的小鼠 在胚胎阶段具有显著较多的卫星细胞群，因此肌肉生长抑制素缺失的表型 将不能在野生型动物动物中被复制。这不仅因为卫星细胞的实际数量不能 增加到肌肉生长抑制素缺失的基础水平，而且因为肌肉细胞再生周期本身 在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中更有效。另外，由于肌肉生长抑制素在除 了肌肉之外的组织中被找到，因此部分敲除肌肉生长抑制素活性可有不利 的副作用。因此，通过应用肌肉生长抑制素拮抗剂来抑制肌肉生长抑制素活性，其对出生后的老年的肌肉再生周期的效应难以预测。这为Goldspink 和Harridge， 2004所支持，其注意到了用于治疗肌肉减少症的建议疗法将 不是部分敲除肌肉生长抑制素，这是因为这会造成呼吸和心血管功能的损 害。可是令人惊奇地，本发明首次发现，肌肉生长抑制素拮抗剂可用于成 功治疗肌肉减少症，而不带来不利的副作用。本发明也可广义地被认为个别或整体地存在于本申请说明书参考或所 示的部分、元素和特征中，以及两个或更多所述部分、元素或特征的任意 或全部组合，而且本文提及了特定的完整事物，这些完整事物在本发明相 关的现有技术中具有已知的等同物，该已知的等同物被认为纳入本文了 ， 就好像个别描述过一样。本发明存 实施例实施例l肌肉生长抑制素调节卫星细胞活化 方法卫星细胞的体内BrdU标记通过体内5-溴-2，-脱氧-尿嘧啶核苷(BrdU)标记来研究卫星细胞活化。安 乐死前2小时，野生型和肌肉生长抑制素-缺失的小鼠用BrdU (Roche) (30 mg/kg)—次腹膜内注射。根据经改造的Yablonka-Reuveni和Nameroff (1987) 规程来分离卫星细胞。简而言之，用C02气体处死1个月和6个月大的野 生型和肌肉生长抑制素-缺失的小鼠(每组n: 10)，然后进行颈错位。切下 后肢肌肉，切碎并在含0.2% (w/v)lA型胶原酶(>260 CDU/mg， Sigma)的 Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM) (Invitrogen)中于37°C消化90分 钟。捣碎肌肉浆，然后通过70 nM过滤膜(BD Biosciences),之后上样于 700/o和40。/oPercoll梯度(Sigma)中，于25。C以2000 x g离心20分钟。收集 两个梯度溶液之间的界面，细胞重悬于PBS中。为了检测BrdU的掺入， 使用原位细胞增殖试剂盒——FLUOS (Roche)。在水上用70%乙醇固定细胞 30分钟，并用2N HCL + 0.5 % TritonX-100于室温(RT)处理30分钟，然 后用0.1 M四硼酸二钠緩冲液(pH 8.5)中和。在含0.5%Tween-20的PBS中 透化细胞，并于37。C与含单克隆抗BrdU-FLUOS抗体(l: 25, Roche)的温 育緩冲液(Roche)温育45分钟。用FACScan (Beckton-Dickinson)流式细胞仪 分析细月包。单个肌纤维的分离和培养根据前述的Rosenblatt等，(1995)来分离单个纤维。简而言之，用C02 气体对1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的小鼠进行安乐 死，随后进行颈错位。切下胫骨前肌，并在含0.2% (w/v)lA型胶原酶(>260 CDU/mg, Sigma)的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM) (Invitrogen) 中于37。C消化60分钟。将肌肉转入DMEM + 10%马血清(HS) + 0.5%鸡胚 提取物(CEE)，轻微研磨分离纤维。将分离的纤维转入用10%基质胶 (Becton Dickinson)包被的4孔腔载玻片(Becton Dickinson)上，并于37°C用
含4%多聚曱醛的PBS固定10分钟或于37。C在5%C02中以1: 1000在 DMEM +10%HS+0.5%CEE+BrdU (Roche)中培养48小时。为了确定肌肉生长抑制素拮抗剂(肌肉生长抑制素的显性阴性肽，其在 氨基酸350位上C-末端截短了，下文称其为"350"或"350蛋白，，)对卫星细 胞活化的效应，6个月大的野生型小鼠胫骨前肌的单个肌纤维在存在5pg/ml 或10ii/m1 350的培养基中培养32小时，并用曱醇固定，用PBS洗涤。固 定的纤维与含0.35%角叉藻聚糖？i的1: 50稀释度的抗PCNA抗体温育过 夜。用山羊抗小鼠-alexa fluor546检测初级抗体。PCNA阳性的活化的卫星 细胞在显微镜下计数并表示成总肌核(myonuclei)的百分比。才艮据改良的Beauchamp等，(2000)方法，用CD34抗体^r测卫星细胞。 简而言之，用多聚曱醛固定纤维，用PBS洗涤，在含0.5% TritonX-lOO的 PBS中透化10分钟，并用含10%常规羊血清的PBS在室温封闭30分钟。 导入含l: 100的大鼠抗小鼠CD34单克隆抗体(克隆RAM34; PharMingen) 并含0.35。/。角叉藻聚糖X的(Sigma)的PBS过夜。用含l: 300的生物素化的 山羊抗大鼠IgG多克隆抗体(Amersham)并含0.35%角叉藻聚糖人的(Sigma) 的PBS在室温下温育2小时，然后在RT下用含1: 400的抗生物素蛋白链 菌素缀合的Alexa fluor488 (Molecular Probes)并含0.35%角叉藻聚糖入 (Sigma)的PBS温育1小时，由此检测初级抗体。用含1: 1000的DAPI的 PBS复染纤维5分钟，然后用荧光固定培养基(Dako)固定，并用Olympus BX50显微镜和SPOTRT照相机和软件检测。掺入BrdU的细胞的检测按照5-溴-2，-脱氧-尿嘧啶核苷标记与检测试剂 盒(Roche)规程进行。用含l: 1000的DAPI的PBS复染纤维5分钟，然后 用荧光固定培养基(Dako)固定并用Olympus BX50显微镜和SPOT RT照相机 和软件;险测。通过肌肉生长抑制素抑制卫星细胞活化。如上所述，从4周大的野生型小鼠(11=3)中分离出单个肌纤维。让纤维 粘附3分钟，然后加入500 pi纤维培养基(FM) [DMEM, 10% (v/v)马血清 (HS), 0.5% (v/v)鸡胚提取物(CEE),(青霉素/链霉素)]或其中增加了重组肌 肉生长抑制素的量的FM (Thomas等，2000)。从￡. co"中纯化重组肌肉生 长抑制素在别处(Thomas等，2000)有述。在37°C/5% C02，让细胞迁移出纤
维72小时。用倒置显微镜计数每个孔中的迁移的卫星细胞数量。重复至少30个单个纤维，用于进行统计分析。组间的差异通过正态线性化模型用 GenStat6 二项式分布来分析。/f舉J:活化的JZ^勿/《^体^ BWt/渗入；通过上述方法，从4周大的野生型小鼠(11=6)中分离出肌纤维，并使之 附着到10%基质胶包被的4孔Lab-Tek㊣腔栽玻片上。向孔中加入包含10 pMBrdU的FM培养基，其带有或不带有浓度逐渐提高的肌肉生长抑制素， 温育纤维48小时。在拯救实验中，分离的纤维在含1 pg/ml肌肉生长抑制 素的FM中培养24小时，然后轻轻洗去一半并替换为FM,同时将另一半 保留在含重组肌肉生长抑制素的培养基中再培养24小时。在-20。C用 Carnoys固定液固定纤维过夜。根据Roche (Roche国际诊断公司)细胞增殖 试剂盒1规程进行BrdU掺入和检测。利用DAPI染色来使所有肌核可见化。 计数纤维(!1=30)上的BrdU阳性核，并计算每100个DAPI阳性核中BrdU 阳性核的数目。组间的差异通过正态线性化模型用GenStat6泊松分布来分 析。结果肌肉生长抑制素抑制卫星细胞的活化为了证明肌肉生长抑制素对卫星细胞活化的直接效应，我们在肌肉生 长抑制素处理后评估卫星细胞的增殖。对分离自野生型小鼠的各个肌纤维 进行培养以使卫星细胞活化，和进行如通过BrdU结合所指示的增殖(Conboy 和Rando， 2002; Rosenblatt等，1995)。在缺少重组肌肉生长抑制素的情况 下，有卫星细胞增殖，导致被计数的核中6%掺入了 BrdU。可是，当以增 加的浓度向培养基中加入重组肌肉生长抑制素时，较少卫星细胞增殖了 。 在肌肉生长抑制素浓度为5|ig/ml时，少于1%的^^皮计数核掺入BrdU (尸O.OOl)。为了证明肌肉生长抑制素对卫星细胞的增殖效应是可逆的，去 除添加的重组肌肉生长抑制素；去除重组肌肉生长抑制素后，有显著更大 量的卫星细胞增殖了 (尸〈atW，图2A和B)。这些结果显示，肌肉生长抑制素直接抑制了不活动的卫星细胞进入细 胞周期。为了进一步研究肌肉生长抑制素对卫星细胞增殖的效应，使卫星
细胞与纤维分离从而迁移并接着增殖。图2C证明了当不向培养基中加入重组肌肉生长抑制素时，平均检测到了 30个成肌细胞。可是，随着肌肉生长 抑制素浓度增加，迁移的成肌细胞数目减少了。这些结果清楚地证明了， 肌肉生长抑制素直接抑制卫星细胞的活化。肌肉生长抑制素对衰老时的卫星细胞数量和活化的影响。在卫星细胞中表达肌肉生长抑制素，利用年轻肌肉生长抑制素缺失的 小鼠的研究显示，肌肉生长抑制素的缺少导致了每单位纤维长度有较多的肌肉生长抑制素和衰老对卫星细胞行为的影响，对1个月和24个月大的野 生型和肌肉生长抑制素缺失的小鼠的卫星细胞总数和它们活化的能力进行 定量。为了分析每单位纤维长度的卫星细胞数，利用细胞表面标记CD34对附 着于单个纤维的卫星细胞计数(图3A),所述单个纤维分离自1个月和24 个月大的野生型和肌肉生长抑制素缺失的胫骨前肌。结果显示，每纤维100 个肌核的卫星细胞平均数从1个月大的野生型纤维中观察到的5显著增加 到了 1个月大的肌肉生长抑制素缺失的纤维中的11 (图3A)。衰老显示对卫 星细胞数几乎没有影响，在1个月和24个月大的野生型或肌肉生长抑制素 缺失的纤维之间没有观察到卫星细胞数目的显著改变(图3A)。由于不但卫星细胞数目而且卫星细胞活性与肌肉再生的能力相关，用 体外和体内BrdU标记研究卫星细胞的活化。附着于分离的纤维上的BrdU 体外标记的卫星细胞显示，在1个月大的野生型胫骨前肌中每纤维中活化 的卫星细胞平均百分比为6.5%,而相应地，在1个月大的肌肉生长抑制素 缺失的胫骨前肌中为10%(图3B)。可是，在衰老过程中，在野生型和肌肉 生长抑制素缺失的24个月大的小鼠中，卫星细胞活化都降低了 (图3B)。 值得注意的是，在24个月时，与野生型纤维相比，在肌肉生长抑制素缺失 的肌纤维中每纤维有两倍的活化卫星细胞数目。最终，还利用体内BrdU掺 入测量卫星细胞活化的倾向性。BrdU标记的卫星细胞的FACS分析显示了 体外标记的卫星细胞的相似倾向。来自1个月大的野生型肌肉的活化的卫 星细胞百分比为8.5% ,而相应地1个月大的肌肉生长抑制素缺失的肌肉中 的为14.8%。随着年龄增加，野生型和肌肉生长抑制素缺失的六个月大的肌
肉中的活化的卫星细胞百分比分别显著下降了 2%和5%(图3C)。值得注意的是，与对照相比，在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中有两倍的可活化的卫 星细胞数目。350能活化卫星细胞因为缺失的小鼠中卫星细胞生理性质(包括每肌纤维的数量和活化程 度)可能是由于胚胎发育期介导的效应造成的，而不是由于出生后缺少与 肌肉生长抑制素的接触而造成的，因此我们测试了肌肉生长抑制素拮抗剂 对野生型小鼠卫星细胞活化的影响。当包含卫星细胞的野生型小鼠的单肌 纤维与增加浓度的350 —起温育时，观察到了增加的卫星细胞活化数目。 该结果确认了， 350是野生型肌肉中卫星细胞的有效活化剂。它也显示了， 肌肉生长抑制素缺失的小鼠中观察到增加的卫星细胞活化可能是由于出生 后持续不与肌肉生长抑制素接触造成的，而并非来源于胚胎不接触肌肉生长抑制素的效应。350能活化不活动的野生型卫星细胞的发现，结合观察到 了肌肉生长抑制素缺失的小鼠在老年时增加了活化的卫星细胞水平，这显 示了施用350或其他肌肉生长抑制素拮抗剂预计能防止诸如老年人中肌肉 减少症的病况的发生。另外，在活化的卫星细胞比例已经有起色的情况下， 预期其能降低病况的严重性(图4)。
实施例2: 肌肉生长抑制素拮抗剂增加炎性应答和卫星细胞的趋化性肌肉减少症是与老龄相关的肌肉损耗形式。随着变老，伴随肌纤维萎 缩而来的是肌肉质量减少了。这些事件不仅影响肌纤维而且影响卫星细胞， 造成肌肉再生能力的下降。这主要归因于卫星细胞丧失对损伤响应的活化 的倾向，和对常规补充肌纤维的需求。另外，再生的另一主要步骤，对肌 肉损伤的炎性反应，也在老年时降低了并造成了肌肉减少症部分症状。肌 肉生长抑制素——肌形成过程有效的负调节剂，在衰老时会显示出在循环 中增加了。我们在本文中提供了数据，确认了增加的肌肉生长抑制素水平 抑制卫星细胞的活化和炎性细胞的趋化性。我们也提供了证据，即强肌肉 生长抑制素拮抗剂能逆转并拯救肌肉生长抑制素介导的对卫星细胞活化和 炎性细胞趋化性的抑制。这些令人惊讶的发现显示了肌肉生长抑制素抑制 剂可用于对月几肉减少症的治疗。 材料和方法对应于牛肌肉生长抑制素267-350位氨基酸的cDNA(下文中被称为350 或350蛋白)被PCR扩增出并克隆进pET16-B载体中。350蛋白的表达和 纯化按照制造商(Qiagen)的规程在天然条件下进行。用25%芬太尼(Hypnorm )(柠檬酸芬太尼0.315 mg/ml和氟茴哌丁酮10 mg/ml)和10%速眠安(Hypnovel )(咪唑安定5 mg/ml)的混合物以0.1 ml/10g 体重的量来麻醉6至8周大的雄性C57BL/10和肌肉生长抑制素^小鼠(每 组n二27)。右腿的胫骨肌前肌用100pl注射器(SGE,澳大利亚)肌肉注射IO pl 10吗/ml的虎蛇毒素。在第0天(对照)和第1、 2、 3、 5、 7、 10、 14或28天(每天11=3)，从安乐死的小鼠中切下胫骨前肌。胫骨前肌在组织 Tec液中固定，并在用液氮冷冻的异戊烷中冷冻。对于350在年老的肌肉上 进行的试验，如上所述，用虎蛇毒素注射1岁大的野生型小鼠的左胫骨前 (TA)肌肉。在第1、 3、 5、和7天，用肌肉生长抑制素拮抗剂(350 )以6 pg 每克体重皮下注射注射过虎蛇毒素的小鼠，或注射等量盐水(对照小鼠)。为 了评估350对肌肉康复的效应，在注射虎蛇毒素后第1、 3、 7、 10和28天 使小鼠安乐死，切下胫骨前肌，进行蛋白质分离或组织切片。冷冻的肌肉 样品储存于-80。C。7)am的横向切片(『3)在3个水平进行切割，相隔100 pm。 然后用苏木精和曙红或Van Geisen对切片染色。然后用装有DAGE-MTI DC-330彩色照相机(DAGE-MTI Inc.)的Olympus BX50显微镜(Olympus Optical Co.，德国)检测切片并拍照。^瘦遂织^夢用2%多聚曱醛后固定(postfix)冷冻的肌肉切片(7pm厚)，然后用含 0.3% (v/v) Triton X-100的PBS透化，然后用10°/。 (v/v)正常羊血清-Tris緩冲 盐水(NGS-TBS)于室温封闭1小时。切片与用5% NGS-TBS稀释的抗体一 起于4。C温育过夜。所用的抗体是小鼠抗MyoD， 1: 25稀释度(554130; PharMingen),它是活化的成肌细胞的特异性标记物(Cooper等，I999; Koishi 等，1995);山羊抗Mac-l, 1: 400稀释度(整联蛋白M-19; Santa Cruz)， 它是特异于浸润的外周巨噬细胞的抗体(Springer等，1979); 1: 300稀释 度的小鼠抗波形蛋白抗体，它是成纤维细胞的标记物。用PBS洗切片3次， 然后与1: 400稀释度的驴抗小鼠Cy3缀合物(715-165-150; Jackson ImmunoResearch, West Grove， PA，美国)或l: 400稀释度的生物素化的 驴抗绵羊/山羊IgG抗体(RPN 1025; Amersham)—起温育。二级抗体温育后， 与荧光素缀合的抗生物素蛋白链菌素(S-869; Molecular Probes)—起于室温 温育30分钟，所述抗生物素蛋白链菌素稀释度为l:400，其用5%NGS-TBS 稀释。用PBS漂洗切片3次，用DAPI复染并用Dako 萸光固定介质固定。 用落射荧光显微镜检测胫骨前肌切片。用装有DAGE-MTI DC-330彩色照 相机(DAGE-MTI Inc. , IN,美国)的Olympus BX50显微镜(Olympus Optical Co.，德国)拍下典型的显^L晤片。用Scion成像程序(NIH)对5个随 机挑选的肌肉切片测量出平均肌肉面积，所述肌肉切片是前面来自于对肌 肉生长抑制素〃-和野生型小鼠进行免疫组织化学而用的切片。趟化&试验根据公开的规程(Allen等，1997; Partridge, 1997)，培养来自于4至 6周大的小鼠的后肢肌肉的初级成肌细胞。简而言之，切碎肌肉并在0.2% 1A 型胶原酶中消化卯分钟。通过预先在未包被的平板上铺板3小时来富集培 养物中的成肌细胞。成肌细胞培养物在10%基质胶包被的平板上于 37。C/5% C02培养于补加20。/。胎牛血清(FCS)、 10% HS和1% CEE的生长 培养基(GM)中。48小时后，通过流式细胞术分析培养物中MyoD的表达来 评估培养物纯度程度。用胰蛋白酶收集细胞，以106个细胞/200 pl的浓度 重悬并用5ml70。/。乙醇于-20。C固定过夜。用1: 200的兔多克隆抗MyoD (Santa Cruz)于室温进行染色30分钟，然后用1: 500的Alexa fluor488抗兔 缀合物染色(MolecularProbes)。分析一式两份进行，每个试验中收集104个 细胞事件。通过对前向和侧向散射图谱进行射门来排除碎片。通过FACscan (Becton Dickinson)来分析细胞。通过腹膜灌洗技术来分离巨噬细胞。根据公 开的规程(Colditz和Movat, 1984)制备酵母聚糖活化的小鼠血清(ZAMS)。
在带有7 mm直径的孔的Boyden型单盲孔腔室(Neuro Probe, MD美国)中 进行趋化性实验。彻底洗涤带有8pm洞的聚碳酸酯过滤膜(Neuroprobe;洞 =6%的表面积)，而对于成肌细胞试验，用含1%基质力交的DMEM处理过 滤膜30分钟。然后干燥过滤膜并置于顶层和底层腔室之间。对于成肌细胞的趋化性试验，含5。/。鸡胚提取物(CEE)和透析緩冲液的 DMEM用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(2.5和5pg/ml肌肉生长 抑制素)和350蛋白质(5倍肌肉生长抑制素浓度，即，12.5吗/ml和25吗/ml) 加入阳性对照培养基中。纯DMEM用作阴性对照。在24孔板上，用测试 或对照培养基注满底层孔。将七万五千个细胞加入到顶层孔中。于37。C、 5%0)2温育平板7小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁 移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在 每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。对于巨噬细胞的趋化性试验，含33%酵母聚糖活化的小鼠血清 (ZAMS))的DMEM和透析缓沖液用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制 素(5吗/ml肌肉生长抑制素)和350蛋白质(2和5倍肌肉生长抑制素浓度， 即，10(ig/ml和25pg/ml)加入阳性对照培养基或纯DMEM中。在24孔板 上，用测试或对照培养基注满底层孔。将七万五千个细胞加入到带有聚对 苯二曱酸乙二醇酯(PET)0.8iam膜的顶层孔中。于37。C、 5%(302温育平板4 小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁移的细胞。然后固 定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在每个膜的4个代表 区域上计数迁移的细胞并得出平均数。从羊羔皮肤外植体上获取初级成纤维细胞。含10pg/ml重组TGF-(3的 DMEM用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(5吗/ml肌肉生长抑制素) 加入到阳性对照培养基中。在24孔板上，用测试或对照培养基注满底层孔。 将八万八千个细胞加入到带有聚对苯二曱酸乙二醇酯(PET) 0.8|im膜的顶层 孔中。于37。C、 5。/。C02温育平板4小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层 表面以去除未迁移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在 载玻片之上。在每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。^《这的才艮据厂商规程用Trizol (Invitrogen)分离总RNA。用Superscript预扩增试剂盒(Invitrogen)进行反逆转录反应。用1 pl反转录反应液进行PCR,即 94。C30秒，55。C30秒，和72°C 30秒。对于每个基因，利用不同的循环来 确定指数扩增所需的循环数。在琼脂糖凝胶上分离扩增子并转移至尼龙膜 上。通过DNA印迹杂交来检测PCR产物。用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) mRNA的丰度来校正每个数据点。结果肌肉生长抑制素影响成肌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的趋化性。 再生周期中还涉及炎性应答，例如对破坏的或破损的肌肉细胞的应答。 免疫应答的特征在于存在嗜曙红细胞，而在野生型和肌肉生长抑制素—A 肌肉中，在虎蛇毒素注射后24小时内都见得到成肌细胞迁移(图5C)。到第 2天，野生型和肌肉生长抑制素一应答在炎性应答和卫星细胞迁移上的差 异明显，其中肌肉生长抑制素 一肌肉切片中再生位点上的核增长显著提高 (图5D，箭头)。观察到的核数目的增加是由于巨噬细胞和成肌细胞数目增 加而造成的。沿着坏死的肌纤维边缘可见到最高密度的核(图5D,箭头)， 尤其在肌肉生长抑制素；切片中。到第3天，再生的野生型肌肉切片也显 示出核数目增加了 ，然而仍旧远小于从肌肉生长抑制素 一小鼠中收集的对 应组织(图5E)。在野生型和肌肉生长抑制素^肌肉切片中，虎蛇毒素注射 后单核细胞增加的顶点都出现在第5天(图5F)。所示的主要效应是巨噬细 胞和成肌细胞加速迁移到肌肉生长抑制素一肌肉切片中的再生位点上。在肌肉再生期间，炎性细胞和卫星细胞迁移到再生位点上(Watt等， 1994)。为了确定缺少肌肉生长抑制素是否能增强活化的卫星细胞或炎性细 胞的迁移，定量再生位点上的炎性细胞和成肌细胞的比例。用免疫组织化 学来检测MyoD(成肌细胞的特异性标记物)(Beauchamp等，2000)和Mac-l (用于浸润的外周巨噬细胞)(Kawakami等，1995)。发现未处理的对照肌 肉切片对MyoD免疫染色阴性。用DAPI染色肌肉切片从而计数出核的总数。 定量结果证明了与野生型切片相比，在肌肉生长抑制素；再生的肌肉中在 第二天，再生位点上出现了两倍数量的成肌细胞(MyoD阳性)(图6A)和巨噬 细胞(Mac-1阳性)(图6B)。从注射后第2天到第5天，肌肉生长抑制素 一肌肉切片上有多于野生型肌肉的成肌细胞(图6A)。像MyoD阳性细胞一样， 在肌肉生长抑制素^肌肉应答虎蛇毒素损伤中的更早期(第2天)，可见到巨噬细胞向再生位点增加浸润(图6B)。另外，肌肉生长抑制素一肌肉中 更迅速减少的炎性细胞数表明，肌肉生长抑制素 一小鼠中整个炎性细胞应答过程都加速了 (图6B)。Grounds等(Grounds等，1992)证明了 MyoD和肌细胞生成素的 基因表达可用作在肌肉再生期间非常早期检测迁移的成肌细胞的标记物。 因此在再生的组织中确定MyoD和肌细胞生成素的表达。定量RT-PCR 结果确证了肌肉调节因子myoD和肌细胞生成素的表达，与野生型肌肉 相比，在肌肉生长抑制素〃-肌肉中是在较早时表达的。在肌肉生长抑制 素一肌肉中，在虎蛇毒素注射后12小时内检测到了高水平的MyoDmRNA。 可是在野生型肌肉中，直到虎蛇毒素注射后第1天才检测到MyoD表达(图 6C)。相似地，在再生的肌肉生长抑制素一 肌肉中，在虎蛇毒素注射后12 小时内的非常早期阶段也检测到更高水平的肌细胞生成素mRNA。可是， 在野生型再生的肌肉中，直到由虎蛇毒素注射造成的肌肉损伤后1天才检 测到肌细胞生成素mRNA(图6C)。因此，免疫组织化学和基因表达分析的 结果同时表明，肌肉生长抑制素 一月几肉中成肌细胞向再生位点的迁移增加 并力口速了 。年老时，在骨骼肌肉中可见到卫星细胞活化和炎性应答的减少。基于 本文提供的数据，我们认为年老肌肉中所见到的增加水平的肌肉生长抑制 素在应答损伤并在必要时防止肌肉堆积时，造成了倾向于丧失要活化的卫 星细胞。为了逆转这些肌肉减少症中所见的情况，我们用肌肉生长抑制素 拮抗剂治疗小鼠。为了证明3 5 0抑制肌肉生长抑制素活性而带来增强炎性应答的有益效 果，虎蛇毒素注射后进行肌肉再生的小鼠用350蛋白处理，并确定炎性应答。 第2天在用350处理过了的受损的肌肉中发现更高百分比的MaclP曰性巨噬细 月包(图7)。到第3天，350处理的肌肉中的百分比掉落到盐水处理的第3天的肌 肉之下，并在第7和10天的肌肉中持续更低。该结果显示到第2天在350处理 的肌肉中有早期或更深层次的巨噬细胞募集，然后到第7和10天募集降低 了。这些结果显示350处理加速肌肉炎性过程。诸如350的肌肉生长抑制素 拮抗剂通过抑制肌肉生长抑制素效应而增强巨噬细胞应答的能力显示出， 施用肌肉生长抑制素抑制剂或拮抗剂对患有肌肉减少症的人会带来有益效 果，其通过在衰老期间恢复维持肌肉完整性所需的炎性应答来实现。 除了成肌细胞，成纤维细胞也会迁移至再生位点并在其上扩增。研究 肌肉再生时肌肉生长抑制素对成纤维细胞迁移动力学的影响。如用波形蛋 白抗体(成纤维细胞的特异性标记)染色的图8所示，与野生型肌肉相比，在 肌肉生长抑制素一小鼠胫骨前肌中的再生位点上成纤维细胞的增加实质 上较小。该结果以及以下成纤维细胞迁移试验的数据，清楚证明了肌肉生 长抑制素是用作为成纤维细胞的化学引诱物的。肌肉生长抑制素对成肌细胞和巨噬细胞趋化性的抑制并通过350对其拯救已经证明了 24小时后，由虎蛇毒素损伤的肌肉组织中的肌肉生长抑制 素出现了显著倍数的增加(Kirk等2000)。以上提供的结果显示，肌肉生长抑制素一肌肉中巨噬细胞浸润增加并 加速，和成肌细胞向再生区域迁移增加并加速。由于这两种细胞类型已知 都受趋化性因子影响而指导它们的运动(Bischoff， 1997; Jones， 2000),研 究肌肉生长抑制素对卫星细胞衍生的成肌细胞和巨噬细胞的迁移能力的影 响。为了测试肌肉生长抑制素是否干扰趋化性信号，使用盲孔(blind-well) 趋化性腔室。通过过滤膜来评估分离的成肌细胞或巨噬细胞针对化学引诱 物(针对成肌细胞是CEE，而针对巨噬细胞是ZAMS活化的血清)的迁移能力。 如流式细胞术所测得的，发现分离的成肌细胞90。/。是成肌性(MyoD阳性) 的。如图9所示，将5pg/ml肌肉生长抑制素加入到ZAMS培养基中能完全消 除巨噬细胞迁移。当向含5吗/ml肌肉生长抑制素的培养基中加入350蛋白 时，观察到了肌肉生长抑制素对巨噬细胞的化学抑制效应的显著拯救(增加 了 20倍)。该结杲确认了施用诸如350的肌肉生长抑制素抑制剂能通过降低肌 肉生长抑制素对巨噬细胞迁移的抑制而加速肌肉再生进程。除了对巨噬细胞迁移的影响，我们在本文中还证明了诸如350的肌肉生 长抑制素拮抗剂也能降低肌肉生长抑制素对成肌细胞趋化性移动的负效 应。向阳性对照培养基中加入2.5和5(^g/ml重组肌肉生长抑制素会分别造成 成肌细胞迁移被抑制了 66和82%。当向含重组肌肉生长抑制素的培养基中加 入350蛋白质时，肌肉生长抑制素对成肌细胞的化学抑制效应被拯救至近似 于阳性对照中所观察到的水平，因此证明了诸如350的肌肉生长抑制素拮抗 剂能通过增强成肌细胞迁移而有效地加速肌肉再生(图10B)。诸如350的肌
肉生长抑制素拮抗剂通过降低肌肉生长抑制素抑制效应而增强成肌细胞迁 移的能力显示了施用肌肉生长抑制素抑制剂对患有肌肉减少症的人会带来 有益效果，其通过在衰老期间恢复维持肌肉完整性所需的炎性应答来实现。肌肉生长抑制素用作针对成纤维细胞的化学引诱物与巨噬细胞和成肌细胞相反，肌肉生长抑制素可用作成纤维细胞迁移 的化学引诱剂。在肌肉生长抑制素缺失的肌肉中观察到成纤维细胞向再生 位点迁移的减少支持了这个结果(图IOA)。为了直接证明肌肉生长抑制素 对成纤维细胞的趋化性效应，利用重组肌肉生长抑制素在体外进行迁移试验。如图IOA所示，与緩冲液对照相比，肌肉生长抑制素的加入增加了成纤维细胞的趋化性移动。实施例3:对肌肉生长抑制素进行拮抗使得纤维变性减少并增强肌肉 再生。方法切割创伤模型在每只小鼠(野生型和肌肉生长抑制素缺失)的左胫骨前肌(TA)切开 3mm的横向切口。在损伤后第0、 3、 5、和7天，野生型胫骨前肌在损伤 位点上以2lig/g体重注射350蛋白(总量为85(ig/小鼠)或盐水(注射入胫骨前 肌肉)。未受损的右胫骨前肌用作为对照。在切割后第2、 4、 7、 10和21 天收集受损的和对照月几肉，并确定它们的重量。还通过Van Geisen染色来 测定胶原沉积在再生位置和再生的肌肉组织上的程度。扫描电子显纟效术剔除肌肉样品的脂肪和肌腱，并用含2.5% (v/v)戊二醛的10 ml 0.1 M 磷酸盐緩沖液(pH 7.4)固定48小时，期间轻轻摇动。用PBS洗去戊二酪， 洗1小时，然后转移到50ml2MNaOH中，并于25。C恒温温育5天。然后 用PBS洗样品并移入50ml无菌蒸馏水中。再于25。C恒温保存肌肉4天。 在前36小时，每隔12小时换水，然后每隔24小时换。然后将肌肉转移入 1%丹宁酸，放置2小时，然后用PBS洗3次。用1Q/。Os04处理肌肉2小时，
然后用递增梯度的乙醇(50% - 100%)用浸入法脱水3次，每次15分钟。用 二氧化碳干燥肌肉样品并用金包被。检测标本并用带有10kV加速电压的扫 描电子显微镜(HITACHI4100，日本)拍照。如实施例2所述用VanGeisen在第21天评估野生型相对于缺失型的割 伤胫骨前肌中的胶原积聚。结果缺 沟^长#*#錄增强,沟存^并减,^^^r^ 肌肉减少症的一个重要指标是由于纤维变性增加而造成的肌肉力量的 丧失。骨骼肌肉在出生后衰老过程中重复退化和再生周期，这造成纤维变 性组织的积聚。为了评估肌肉生长抑制素在纤维变性中的作用，虎蛇毒素 注射之后比较这两种肌肉基因型的組织学(参见实施例2中的方法一节)。在第28天，在苏木精和曙红染色的来自于受损的野生型肌肉的切片中观察到 痣痕组织，而在肌肉生长抑制素一肌肉切片中只观察到非常少的疤痕组织(图 IIA)。 Van Geisen氏染色进一步确认了结締组织的存在(图IIA)。在第28 天，野生型肌肉切片上有较大的胶原面积，所以与肌肉生长抑制素一肌肉相 比，切割过的野生型组织中可见到更多疤痕组织。为了进一步确认该结果， 用扫描电子显微镜分析再生的肌肉。第0天(对照)和第24天再生的肌肉的 扫描电子显微照片，显示了结締组织框架包围原来由肌纤维占据的空间(图 IIA)。在对照(未受损)的样品中，野生型和肌肉生长抑制素一肌肉在纤维 腔周围都没有变厚的结締组织。可是，到了肌肉再生的第24天，在野生型 肌肉中观察到了密集的结締组织束(图IIA)，但在肌肉生长抑制素一肌肉中 没有观察到。相似地，在割伤肌肉模型中比较肌肉生长抑制素缺失的与野 生型小鼠，在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中，第28天再生肌肉位点上胶原 积累的程度显著减少(数据未提供)。这些结果确认了缺少肌肉生长抑制素会 导致肌肉再生后减少疤痕组织。预期这能帮助在衰老的肌肉中减少疤痕组 织，因而减少肌肉减轻症的症状。350处理能增强,沟存^;^摩-瓶^^f'/i为了研究诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂在增强肌肉再生中的功效， 用虎蛇毒素使1岁大的野生型小鼠(C57 Black)受损伤并注射350 (参见实
施例2中的方法)。典型地，在虎蛇毒素损伤后，肌肉重量起初由于产生的 水肺而增加，然后由于受损的肌纤维坏死而降低，所述受损肌纤维从受损 位点处被清除。这以后，肌肉重量由于新纤维的生长而开始增加。试验结果显示在第7和10天，350处理的肌肉的重量丧失不如注射对照盐水的肌 肉的多(图12)。这可能是由于较快修复受损的肌肉而造成的。提供的分子 数据(图7)确实支持以下假说即在350治疗的小鼠中，受损的肌肉较快 地再生是由于巨噬细胞迁移的加速和增强以及4交早讨论的其它加速肌肉再 生的过程的组合而造成的，所述其它加速肌肉再生的过程与肌肉生长抑制 素拮抗剂用于治疗肌肉减少症的用途有关。组织学分析证实了盐水和350处理的肌肉之间的差异。苏木精和曙红 染色显示了与盐水处理的肌肉相比，在用350处理的肌肉中初生肌纤维较 早的形成了，而且相关地坏死区域较早的减少了 (图13)。该结果证实了在 350处理的小鼠中肌肉再生加速并增强了。分析图9所示的组织学数据以定 量整个肌肉横切面视野区域上的再生的和未再生的面积。肌肉切片始终取 自每片肌肉中间饱满部分。图14中所示的分析显示，与350治疗的小鼠相 比，在第7天在盐水治疗的对照小鼠中未再生的面积增加了。结果，与350 处理的小鼠相比，在第7天在对照中有相对较少的再生的肌肉。在第10天 也见到了相同的效果。这些结果确认了，与盐水处理的对照相比，在350 处理的肌肉中未再生面积减少了 ，而再生面积增加了 。另外，检测胶原的Van Geisen染色显示在施用虎蛇毒素后第10和28 天，与盐水处理的肌肉相比，胶原沉积的水平在350处理的肌肉中下降了， 这显示在肌肉再生过程中，350处理能减少纤维变性(图15)。该结果证明 了，诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂在肌肉再生期间减少了疤痕组织(纤 维变性)的形成。这显示了，预计施用诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂能 帮助在衰老月几肉中减少疤痕组织，由此减轻肌肉减少症的症状。利用VanGeisen染色成像，施用虎蛇毒素后第28天测量随机挑选的再 生的纤维区域以评估纤维大小(图16)。得自该分析的结果显示，来自350 处理的肌肉的再生纤维显著大于盐水处理的肌肉。经修复的肌纤维大小增为了进一步确认350处理的小鼠中肌肉再生增加部分是由于卫星细胞 活化增加而造成的，我们对Pax7和MyoD蛋白的表达进行了分子分析。Pax7蛋白是卫星细胞的标记物，而MyoD的表达表示卫星细胞的活化。蛋 白质分析确认卫星细胞活化和水平增加(图17)。用350治疗的Pax7水平 (图17A)在第3、 7、 10、和28天较高，这显示与盐水处理的肌肉相比，卫 星细胞活化增加了。另外，在350处理的肌肉中，Pax7水平在第7和10 天之间增加了，而相反，在盐水处理的肌肉中观察到了下降。这显示了， 在350处理的肌肉中，在第IO天左右卫星细胞活化增加了。用350治疗的 MyoD水平(图17B)在第3、 7、和10天也较高，这显示与盐水处理的肌肉 相比，增加了肌形成。综合考虑，在350处理的组织中较高的Pax7和MyoD 水平支持了卫星细胞活化的观察结果，因此继而肌形成增加了。该结果确 认了用350处理能加速并增强肌肉再生，而且会减轻肌肉减少症的症状。^牵座^_550谬爭,々存^:眢强为了评估在肌肉再生位点直接应用350对增强肌肉再生的有效性，将 350蛋白质应用到通过上述切割而造成损伤后再生的胫骨前肌上。未受损的 右胫骨前肌用作为对照。在受损后第2、 4、 7、 10和21天收集受损的和对 照肌肉并确定它们的重量。在切割后第2和4天，在注射350和注射盐水 的胫骨前肌中都观察到了由于炎性浸润造成的最初的肌肉重量增力口(图18)。 在损伤肌肉后第7至10天，注射350和注射盐水的胫骨前肌都恢复到它们 的正常重量。可是，在损伤后第21天，与盐水处理的肌肉相比，注射350 的胫骨前肌显示出通过肌肉重量反映出的肌肉大小显著增加。讨论肌肉减少症是与年龄相关的肌肉质量和力量的丧失。减少的肌肉质量的部分原因是在衰老时的卫星细胞活化以及之后肌肉受损后再生和随时间 维持正常肌肉补充过程的能力下降而造成的。炎性应答的速度较慢和成肌 细胞数量下降是在老年时对降低肌肉再生起主要作用的因素。近来，在老 年男人和女人中显示有效的肌肉生长负调节剂(肌肉生长抑制素)的水平 较高。本文记录的数据清楚证明了，肌肉生长抑制素抑制卫星细胞活化和供的数据也证明了缺少肌肉生长抑制素或通过350抑制肌肉生长抑制素活 性在肌肉损耗期间能使卫星细胞活化和炎性应答增加。因为350能深层次
活化卫星细胞，所以在衰老时施用350可通过卫星细胞活化驱动的过程使 炎性应答活化并使肌肉组织再生和补充。这将进一步导致巨噬细胞和成肌 细胞对再生区域的趋化性增加。由于缺少肌肉生长抑制素也会使成肌细胞 的增殖增加，所以这进一步导致在衰老时期肌形成增加、肌肉损伤被成功 修复以及肌肉补充增加。本文提供的体内试验数据的确清楚证明了，施用350能增强肌肉再生，由此确认了 350和其它肌肉生长抑制素拮抗剂将是有 价值的治疗肌肉减少症的治疗选择。由于肌肉受损和再生的重复周期，出现的肌肉纤维变性的增加导致了 肌肉强度的减少。在肌肉再生期间，浸润的成纤维细胞造成了纤维变性。 我们在本文中清楚地显示了 ，肌肉生长抑制素作用为成纤维细胞迁移的化 学引诱剂。相反，缺少肌肉生长抑制素造成了成纤维细胞的减少。在肌肉 再生期间施用350时，我们观察到了纤维变性的下降。因此，可认为在肌 肉减少症期间施用350也会帮助減轻肌肉中在衰老时发生的纤维变性并将 增加老年肌肉的肌肉强度。结论在老年肌肉中，肌肉生长抑制素拮抗剂能成功地通过增加肌肉再生和 减少纤维变性而增进肌肉质量。所以，肌肉生长抑制素拮抗剂将提供用于 治疗和/或预防肌肉减少症的有价值的治疗选择。参考文献Allen, R. E.， Temm画Grove, C. J.， Sheehan, S. M,和Rice， G. (1997). Skeletal muscle satellite cell cultures. Methods Cel Biol 52， 155-76.Beauchamp, J. R., Heslop, L.， Yu， D. S.， Tajbakhsh， S., Kelly, R. G., Wemig, A., Buckingham, M. E.， Partridge, T. A.和Zammit, P. S. (2000). Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cel Biol 151, 1221-34.Bischoff, R. (1994). Myology,巻1 (A. G. Engel和C. Franzini-Armstrong 编)，pp. 97-118: McGraw-Hill Professional.Carlson, C. J" Booth, F. W.和Gordon, S. E. (1999). Skeletal muscle myostatin mRNA expression is fiber-type specific and increases during hindlimbunloading. Am J Physiol 277， R601-6.Colditz, I, G.和Movat, H. Z. (1984》Kinetics of neutrophil accumulation in acute inflammatory lesions induced by chemotaxins and chemotaxinigens. J Immunol 133,2169-73.Conboy, I. M.和Rando, T. A. (2002). The regulation of notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis. Dev Cel 3, 397-409.Cooper, R. N., Tajbakhsh， S.， Mouly, V., Cossu, G., Buckingham, M.和 Butler-Browne, G. S. (1999). In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle. J Cel Sci 112 ( Pt 17), 2895-901.Floss, T.， Arnold, H. H.和Braun， T. (1997). A role for FGF-6 in skeletal muscle regeneration. Genes Dev 11, 2040-51.Gonzalez-Cadavid， N. F., Taylor, W. E., Yarasheski, K.， Sinha匿Hikim, I.， Ma， K., Ezzat, S., Shen， R., Lalani, R.， Asa， S., Mamita, M.等(1998). Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci U S A 95， 14938-43.Greenlund, US, Nair KS (2003) Sarcopenia - consequences, mechanisms and potential therapies. Mechanisms & Ageing and Development. 124: 287-299.Grobet L， Martin LJ， Poncelet D,等(1997) A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17:71-74.Grounds, M. D., Garrett， K. L.牙口Beilharz, M. W. (1992). The transcription of MyoDl and myogenin genes in thymic cells in vivo. Exp Cel Res 198， 357-61.Grounds, M. D. 和Yablonka-Reuveni， Z. (1993). Molecular and cell biology of skeletal muscle regeneration. Mol Cel Biol Hum Dis Ser 3， 210-56.Jones, G. E. (2000). Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. J Leukoc Biol 68, 593-602.Kambadur， R., Sha丽，M.， Smith, T.P.和Bass, J.J. (1997) Mutations in myostatin (GDF-8) in double muscled Belgian Blue and Piedmontese Cattle.
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权利要求
1. 治疗肌肉减少症的方法，其包括向有需要的人或非人患者施用有效 量的至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。
2. 如权利要求l所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选自 由下列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制素免疫缀合物；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的II型激活蛋白受体、肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且所述小肽能结合并抑制肌肉 生长抑制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核香酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
3. 如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是显 性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
4. 如权利要求3所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是成 熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或 350位上具有C-末端截短。
5. 如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌 肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQIDNO: 8-14、或其 功能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一 性的序列。
6. 如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌 肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"强效，，肽SEQ ID NO: 16或 SEQIDNO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、卯％、 85%、 80% 、 75%或70%序列同 一性的序列。
7. 如权利要求l-6之任一项所述的方法，其用于在再生的肌肉中增加卫 星细胞的活性、和成肌细胞和巨噬细胞的迁移。
8. 如权利要求l-7之任一项所述的方法，其中选自由HGF、 FGF、 IGF、 MGF和生长激素组成的组的 一种或多种其他的生长促进化合物与至少 一种 肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时联合施用以进一步增进肌肉再生。
9. 如权利要求l-7之任一项所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素 拮抗剂配制成用于局部或全身施用。
10. 如权利要求9所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配 制成用于口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜 内施用。
11. 至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂在制备用于治疗有需要的人或非 人患者的肉减少症的药物中的用途。
12. 如权利要求ll所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选 自由下列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的II型激活蛋白受体、 肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
13. 如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
14. 如权利要求13所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或 350位上具有C-末端截短。
15. 如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQIDNO: 8-14、或 其功能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同 一性的序列。
16. 如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"强效"肽SEQ ID NO: 16 或SEQIDNO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、卯％、 85%、 80%、 75%或70%序列同 一性的序列。
17. 如权利要求11-17之任一项所述的用途，其中药物进一步包含选自 由HGF、 FGF、 IGF、 MGF和生长激素组成的组的一种或多种其他的肌肉生 长促进化合物，并且其中该药物配制成用于分开、顺序或同时施用至少一 种肌肉生长抑制素拮抗剂和其他化合物。
18. 如权利要求11-16之任一项所述的用途，其中将该药物配制成用于 局部或全身施用。
19. 如权利要求18所述的用途，其中该药物配制成用于口服、静脉内、 经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。
20. 药物化合物，其包含至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂和药学上可接 受的载体，所述药物化合物用于治疗有需要的人或非人患者的肌肉减少症 的方法中。
21. 如权利要求20所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂选自由下列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的II型激活蛋白受体、 肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养基中的肌肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑 制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
22. 如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
23. 如权利要求22所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸 第335或350位上具有C-末端截短。
24. 如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQ ID NO: 8-14、或其功能片段或变体、或与其具有95%、卯％、 85%、 80%、 75%或 70%序列同一性的序列。
25. 如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"强效，，肽SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
26. 如权利要求20-25之任一项所述的药物化合物，其进一步包含选自 由HGF、 FGF、 IGF、 MGF和生长激素组成的组的一种或多种其他的^l肉生 长促进化合物，其中组合物配制成与至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、 顺序或同时施用。
27. 如权利要求20-25之任一项所述的药物化合物，其配制成用于局部 或全身施用。
28. 如权利要求27所述的药物化合物，其配制成用于口服、静脉内、经 皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。
29. 至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其用于治疗有需要的人或非人患 者的肌肉减少症的方法中。
30. 如权利要求29所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其选自由下 列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的II型激活蛋白受体、 肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑 制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苦酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过 抑制肌肉生长抑制素的基因表达来抑制肌肉生长抑制素活性。
31. 如权利要求30所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含显性 阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自Piedmontese 等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨 基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
32. 如权利要求31所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含成熟 的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或350 位上具有C-末端截短。
33. 如权利要求30所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含肌肉 生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQIDNO: 8-14、或其功 能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性 的序列。
34. 如权利要求30所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含肌肉 生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"巨大的"肽SEQ ID NO: 16或 SEQIDNO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
35. 如权利要求29-34之任一项所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗 剂，其与选自由HGF、 FGF、 IGF、 MGF和生长激素组成的组的一种或多种 其他的肌肉生长促进化合物组合在 一起，用于与至少一种肌肉生长抑制素 拮抗剂分开、顺序或同时施用以进一步增进肌肉再生。
36. 如权利要求29-34之任一项所述的至少 一种肌肉生长抑制素拮抗 剂，其配制成用于局部或全身施用。
37. 如权利要求32所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配制成用于 口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。
全文摘要
本发明涉及通过利用一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂抑制肌肉生长抑制素活性而来治疗人或动物患者的肌肉减少症的方法。
文档编号A61K38/18GK101146546SQ200680009234
公开日2008年3月19日 申请日期2006年2月7日 优先权日2005年2月7日
发明者亚历克斯·亨内布里, 姆里杜拉·沙玛, 拉维·坎巴德, 莫妮卡·森纳塞勒诺德莫拉 申请人:奥里科有限公司