专利名称：：循环障碍改善剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医疗领域中用于改善生物体血液循环障碍的药剂。更具体而言，本发明涉及针对心功能低下、全身性的持续高血压、低血压、循环休克、以及局部充血、淤血、血量减少或缺血、梗塞、出血等血流下降引起的循环障碍，使血流增加、防止或者改善组织障碍的药剂。
背景技术：
：血液的循环障碍大致区分为中枢性和末梢性，末梢性血液循环障碍又分为全身性和局部性。中枢性血液循环障碍是心功能低下的最初原因，因此包括急性和慢性的左心功能不全和右心功能不全。全身性末梢血液循环障碍是血液循环系统整体的末梢循环障碍，不是心功能低下的最初原因，是引起持续高血压、低血压和循环性休克等的原因。局部性末梢血液循环障碍是伴随局部充血、淤血、血量减少或缺血、梗塞、出血等的障碍。对这些循环障碍的预防或治疗药中，已经使用血管扩张剂和血栓溶解剂等，作为其成因病状的治疗药、循环障碍的直接改善药，但是，在全身的血压降低和血栓溶解后，由于活性氧而产生再灌流组织障碍等，因此还没有开发出能够有效改善产生循环障碍的部位的血液循环，充分防止或者改善组织障碍的药物。另一方面，人们期待利用出血性休克的复苏液(红血球代用品)、向心肌梗塞等中的缺血部位的氧供给液、移植器官的灌流液或保存液、人工心肺等的体外循环回路的补充液、向再生组织的培养细胞的氧供给液、癌症治疗用增感剂等，正在进行各种人工输氧液的研究。作为人工输氧液的一个例子，研究了使卟啉金属络合物包合在白蛋白中而形成的化合物(例如，参照专利文献l)。专利文献l:日本特开2004-10495号公报
发明内容本发明的目的在于提供能够有效改善循环障碍产生部位的血液循环、并且能够充分防止或改善组织障碍的药物，作为对上述全部循环障碍的预防或治疗药。本发明人对于使卟啉金属络合物包合于白蛋白中的化合物进行了药效研究，结果发现，本化合物有效地改善循环障碍时的血流下降、并且充分地防止或改善组织障碍，最终完成了本发明。本发明人对于使卟啉铁络合物包合在白蛋白中而形成的化合物，使用多个血流下降模型或者缺血模型动物进行了研究，结果确认了对任何一种模型都显示充分的血流改善效果和组织障碍抑制效果。艮p，本发明涉及(1)一种循环障碍改善剂，其含有使卟啉金属络合物包合在白蛋白中而形成的化合物；(2)如上述(1)所述的循环障碍改善剂，其中卟啉金属络合物为铁络合物；(3)如上述(1)所述的循环障碍改善剂，其中铁处于2价状态；(4)如上述(1)所述的循环障碍改善剂，其中白蛋白是人血清白蛋白或者重组人血清白蛋白；(5)如上述(1)所述的循环障碍改善剂，其中白蛋白由聚合物进行修饰；以及(6)如上述(1)所述的循环障碍改善剂，其中聚合物为选自由聚乙二醇、葡聚糖和聚氨基酸构成的组中中的至少一种聚合物。本发明的循环障碍改善剂，在由于出血或血管狭窄以及闭塞而造成血流量下降时，具有使循环障碍产生部位的血流量增加的效果。另外，通过该血流量增加效果，而具有改善组织障碍的效果。图1是(1)5%rHSA给药、(2)rHSA-FecycP给药情况下对脱血大鼠下肢血流下降的作用进行比较的由激光多普勒式血流显像装置得到的图像。图2是(1)正常对照、(2)低速灌流引起的缺血对照、(3)缺血+5%rHSA给药、(4)缺血+rHSA-FecycP给药情况下对于大鼠摘出心脏中的缺血性心功能障碍的改善作用的比较图。具体实施例方式本发明中使用的卟啉金属络合物，是指中心金属配位到卟啉衍生物上的、具有2位侧链的四苯基卟啉金属络合物。卟啉是指四个吡咯环在a位与4个次甲基交替结合而成的大环化合物及其衍生物。作为本发明中使用的卟啉金属络合物，优选以下通式(1)表示的络合物。通式(1)(式中，&表示可以具有取代基的链状或脂环式烃基，R2表示下述通式(3)表示的取代基，M表示元素周期表第6至10族的过渡金属原子或金属离子，X-表示卤素离子，X—的个数表示金属离子的价数减去2所得的数)。本发明的卟啉金属络合物中，优选上述通式(1)中R!为包含环己酰基的取代基的物质，例如，优选下述通式(2)表示的卟啉金属络合物。通式(2)(式中，R2表示下述通式(3)表示的取代基，M表示元素周期表第6至IO族的过渡金属原子或金属离子，X—表示卤素离子，X—的个数表示金属离子的价数减去2所得的数)。另外，上述通式(1)或(2)中，作为2位的取代基(R2)，可以列举下述通式(3)表示的取代基。通式(3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(式中，R3表示d至ds的垸基，或者表示下述通式(4)表示的基团)。通式(4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(式中，R4表示不阻碍其结合的咪唑向中心金属的配位的基团，Rs表示亚垸基)。所述通式(4)中，R4优选氢、或者甲基、乙基或丙基等低级烷基，R5优选Ci至C,。的亚烷基。本发明的所述通式(1)表示的四苯基卟啉金属络合物中，优选在中心金属(M)上配位了碱的络合物。另外，优选2位取代基自身作为轴碱配位到中心金属上的咪唑衍生物，例如，可以列举下述通式(5)表示的卟啉金属络合物。通式(5)(式中，R,表示可以具有取代基的链状或脂环式烃基，R4表示低级烷基，R5表示C,至Qo的亚烷基。M表示铁、钴或铬、或者它们的离子)。本发明的卟啉金属络合物中的中心金属(例如，上述通式(1)中的M)表示元素周期表第6至IO族的过渡金属原子，也可以是金属离子的形式。其中，优选铁、钴、铬等，进一步优选2价铁(铁(II))、3价铁(铁(III))或2价钴(钴(II))。更优选2价铁。这些卟啉金属络合物中，特别优选下述通式(6)表示的2-[8-(2-甲基-l-咪唑基)辛酰氧甲基]-5，10，15,20-四Ua,a,a,a-o-(l-甲基环己酰基)]苯基I卟啉合铁(II)络合物。通式(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>另外，作为本发明中使用的白蛋白和卟啉铁络合物，可以列举通过将上述通式(6)表示的2-[8-(2-甲基-l-咪唑基)辛酰氧甲基]-5,10,15，20-四([a,a,a,a-o-(l-甲基环己酰基)]苯基p卜啉合铁(II)络合物(FecycP)的合成过程縮短而在合成操作中省略有害物质的使用、提高收率而设计的化合物，即，下述通式(7)表示的5，10,15-H(a,a,a-o-环己酰胺苯基)-20-单[(5-o-6-(N-(2-甲基-l-咪唑基"己酰胺苯基]叶啉的中心上配位了铁的络合物(rHSA-Fecyc3P)。通式(7)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>本发明的卟啉金属络合物包合到白蛋白中而形成的化合物，是指在由白蛋白形成的内部疏水区域中包埋和固定(包合)卟啉金属络合物而得到的化合物。相对于白蛋白(例如，人血清白蛋白)1摩尔，卟啉金属络合物的结合数通常为约l至约8。l摩尔白蛋白中包合和结合的卟啉金属络合物的数目，例如，可以通过绘制Scatchardplot(参照C.J.Halfman，T.Nishida，Biochemistry,11巻，3493页(1972))进行确定。本发明中使用的白蛋白，为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白等，对其来源没有限制。考虑应用于人的情况下，优选人血清白蛋白或者通过基因重组技术制造的人血清白蛋白(以下，称为重组人血清白蛋白)，特别优选重组人血清白蛋白。近年来，随着基因重组技术的发展，开发了结构、组成及物理化学特征与人血清白蛋白完全相同的高纯度重组人血清白蛋白(参照K.Kobayashietal.，TherapeuticApheresis,2巻，257-262页(1998))，在该重组人血清白蛋白中包合取代的卟啉金属络合物而得到的卟啉金属络合物-重组人血清白蛋白包合化合物，由于可以作为全合成体系提供，因此以工业规模制造也比较容易。另外，白蛋白为血浆蛋白质，因此对于生物体的应用性优良。另外，本发明中使用的白蛋白，优选以聚合物进行修饰。作为聚合物，如果是可以用于医疗且能够修饰白蛋白的聚合物，则没有特别限制，可以列举例如聚乙二醇、葡聚糖和聚氨基酸等，优选聚乙二醇。作为聚乙二醇，例如自从1977年由Abuchowski等(参照A.Abuchowskietal"JournalofBiologicalChemistry,252巻，3578-3581页(1977)及JournalofBiologicalChemistry,252巻，3582-3586页(1977))使用以来，成为肽类医药品的分子修饰中广泛使用的高分子，许多文献报道了作为以生物体内半衰期延长和抗原性降低为目的的研究例(参照Y.Kawasakietal.，JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics,216巻，410-414页(1981),N.Katreetal.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,84巻,1487-1491页(1987)及MJ.Knaufetal.，JournalofBiologicalChemistry,263巻，15064-15070页(1988))。本发明的循环障碍治疗剂，是含有使卟啉金属络合物包合于白蛋白中而形成的化合物的药剂，进一步添加了稳定剂等的各种医药组合物也包含在本发明的范围内。本发明的循环障碍治疗剂的剂型可以是医疗用的各种剂型，优选注射剂。本发明作为注射剂制造时，添加适当的溶剂，并且根据需要添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、悬浮剂、增溶剂、载体等，通过常规方法制成注射剂。本发明的循环障碍治疗剂，用于伴随各种疾病/症状的循环障碍的治疗和预防。所述各种疾病/症状，可以列举高血压、高脂血症及糖尿病等疾病、伴随由血栓等造成的血管闭塞和急性出血或者慢性出血的缺血症状、缺血后的再灌流障碍等、以及器官移植。作为伴随这些疾病/症状的循环障碍的例子，可以列举例如缺血性脑疾病(脑梗塞、暂时性脑缺血发作、脑血栓、脑栓塞)、脑梗塞后遗症、脑血管痉挛、缺血性心脏病(心肌梗塞)、心绞痛、血栓闭塞性脉管炎(Buerger氏病)、闭塞性动脉硬化症、血栓性静脉炎、雷诺氏病(P^/—病)和雷诺氏综合症、手足发绀症、冻疮/冻伤、肢端感觉异常、间歇性跛行、特发性坏疽、梅尼埃氏病(^二工一》病)、梅尼埃氏综合症以及眩晕症、慢性动脉闭塞症、缺血性胰腺炎、缺血性视神经病、缺血性大肠炎等。本发明的循环障碍治疗剂，可以应用于例如脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、胰脏、脾脏、肠、骨骼肌、骨髓、神经、视网膜、血管等器官。本发明的循环障碍改善剂以注射剂形式给药情况下的给药方法，例如可以列举静脉内给药、动脉内给药、门静脉内给药、病灶内直接给药。本发明的循环障碍改善剂的给药量，根据患者的年龄、体重、性别、给药方法、症状而不同，通常成人每人每天非口服给药(例如，注射或者持续滴注)约1至约2500mL(例如，FecycP为4mg至llg)、优选约1至约1000mL(例如，FecycP为4mg至4g)的范围进行给药。以下列举实施例，更详细地说明本发明，但是本发明不限于这些实施例。实施例1以下实施例中使用的2-[8-(2-甲基-l-咪唑基)辛酰氧甲基]-5，10，15,20-四Uoc,cx,a，a-o-(l-甲基环己酰氨基)]苯基》卟啉合铁(n)络合物，通过T.Komatsuetal.，BioconjugateChemistry,13巻，397-402页(2002)所述的方法制造。(制造例l)卟啉铁络合物的白蛋白包合物的制造在一氧化碳气氛下，向2-[8-(2-甲基-l-咪唑基)辛酰氧甲基]-5，10，15，20-四([a，a,ot，a-o-(l-甲基环己酰氨基)]苯基p卜啉合铁络合物1.07mmo1的乙醇溶液1.5L中，添加0.6M的L-抗坏血酸水溶液1.5L进行还原，将所得溶液添加到含有0.27mmo1重组人血清白蛋白(以下，简称为rHSA)的磷酸缓冲水溶液(pH7.4，1/30mM)6.5L中，并进行搅拌。向所得混合液中加入磷酸缓冲水溶液(pH7.4，1/30mM)60L，同时使用超滤装置(Millipore制造的超滤膜截留分子量30000)进行定容超滤透析，除去混合液中所含的乙醇。将该混合液浓縮至300mL后，使用磷酸缓冲水溶液(pH7.4,1/30mM)进行配制，使rHSA终浓度为0.75mM(5w/v%)，得到所需要的卟啉铁络合物-白蛋白包合化合物的分散液(以下，简称为rHSA-FecycP)。rHSA-FecycP在通入氧气(100%)的条件下使用500W囱素灯进行20分钟光照射，然后用于实验例1和2。另外，使用A^77株式会社制造的rHSA(25w/v。/。制剂)。(实验例1)对大鼠出血性血流下降模型的作用使用Wistar雄性大鼠(8周龄)，在七氟醚吸入麻醉下(导入2.0%，维持1.5%)进行脱血，使血流量降低。从右颈总动脉脱血2mL，从右股静脉反复9次给药2mL的5。/。rHSA，用5%rHSA交换总血量的约70%，10分钟后从右颈总动脉脱血总血量的30%。脱血结束后，迅速地将rHSA-FecycP或者作为对照的5%rHSA以总血量30%的量从右股静脉内给药。脱血和给药以lmL/分的速度进行。脱血前、脱血结束后即刻以及给药结束后25分钟，使用激光多普勒式血流显像装置((株)乇乂亍、>7亍厶制，MoorLDI-LKII)以非介入方式测定下肢的血流量。将得到的结果进行显像，如图1所示。大鼠的下肢血流量在脱血结束后下降，即使5。/。rHSA给药，也观察不到血流量的恢复，而是进一步下降。另一方面，rHSA-FecycP将因脱血而下降的血流量恢复到与脱血前大致相同的程度。因此，显然rHSA-FecycP对于出血性的血流量下降具有使血流量增加的改善效果。(实验例2)对大鼠缺血性脑血流下降模型的作用对于r-HAS-FecycP给药时两侧颈总动脉闭塞的大鼠的脑血流下降的改善作用进行了实验。使用Wistar雄性大鼠(IO周龄)，在戊巴比妥钠(50mg/kg，腹腔内给药)麻醉下将两侧颈总动脉结扎，使脑血流量下降。在将两侧颈总动脉结扎后10分钟将rHSA-FecycP以10mL/kg的量从尾静脉内给药。使用激光多普勒式血流显像装置((株)干y亍、乂义亍厶制，MoorLDI-LKII)以非介入方式测定两侧颈总动脉结扎前、结扎后即刻及rHSA-FecycP给药结束后5分钟的大脑皮质血流量。得到的结果进行图像量化，将结扎前的值设为100%，如表l所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>从表1的结果明显可以看出，大脑皮质血流量，与两侧颈总动脉结扎前(100%)相比，结扎后即刻降低至55.4%和73.7%，当静脉内给药10mL/kg的rHSA-FecycP时，其分别上升至63.7%和82.8%。因此，rHSA-FecycP对于缺血性脑血流量降低具有使血流量增加的改善效果。(实验例3)对由脑血流下降导致的缺血性脑功能障碍的作用对于r-HAS-FecycP给药时两侧颈总动脉闭塞的大鼠由脑血流下降导致缺血性脑功能障碍的改善作用进行了实验。使用Wistar雄性大鼠(8周龄)，在乙醚轻度麻醉下将两侧颈总动脉结扎进行闭塞，引起脑缺血。两侧颈总动脉闭塞后即刻将rHSA-FecycP以1以及3mL/kg、或者将作为对照的5%rHSA以3mL/kg从尾静脉内给药，观察清醒状态下至闭塞结束后3.5小时有无缺血性发作(发作性跳跃和痉挛)表现以及至24小时后的生死。以缺血性发作的表现率(表现例数/使用例数X100(%))和死亡率(死亡例数/使用例数XIOO(%))为指标对药物的效果进行了考察。所得结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>缺血性发作的表现率，5%rHSA以3mL/kg给药时为80%，而rHSA-FecycP以1或者3mL/kg给药时均为33%，表现率下降。另外，死亡率，rHSA以3mL/kg给药时为100%，而rHSA-FecycP以1或者3mL/kg给药时分别为87%或者67%，死亡率下降。因此，显然rHSA-FecycP对于缺血性脑功能障碍具有改善作用。(实验例4)对于低速灌流导致的缺血性心功能障碍的改善作用在戊巴比妥钠的麻醉下，将Wistar雄性大鼠(8至10周龄)的心脏摘出，根据Langendorff的方法将插管插入大动脉内，用营养液进行灌流。为了测定收縮力作为心功能，向左心室内插入注入了生理盐水的气囊，分析所得到的压力波形，测量左心室内压的舒张末期压力和最大上升速度。营养液使用在通入95%02-5%(302气体、37"C下保温的Krebs-Henseleit液(NaCl118mM，KC14.7mM，KH2P041.2mM，MgS041.2mM，CaCl22.5mM，NaHC0325mM，葡萄糖llmM，pH7.4)，以20mL/分的流量灌流20分钟使其稳定。将流量降至1/10(2mL/分)，通过60分钟低速灌流而引起心肌缺血。对于5%rHSA组(缺血+5%rHSA组，n=7)和rHSA-FecycP组(缺血+rHSA-FecycP组，n=7)，切换为低速流量的同时，将5%rHSA和rHSA-FecycP分别从插入大动脉内的插管的侧管以0.2mL/分的速度持续应用于灌流液中60分钟。对于缺血对照组(n=7)，没有从侧管应用药液。低速灌注结束后，将流量再度恢复到20mL/分，继续灌流60分钟。心脏使用电刺激装置进行起搏(心搏率330拍/分)。对于各实验组，从低速灌流开始时至经过120分钟为止的各时间点，测定左心室内压的舒张末期压力和左心室内最大上升速度。为了比较，对于在实验期间始终以20mL/分进行灌流的正常对照组(n=7)，同样也测定了左心室内压的舒张末期压力和左心室内最大上升速度。将低速灌流开始时的左心室内压的最大上升速度设为100%。另外，各组的左心室内压的舒张末期压力和左心室内的最大上升速度以平均值±标准误差表示，显著差异检验分别进行Dunnett检验和Sted检验(显著性水平均为5%)。所得结果如图2的曲线所示。左心室内压的舒张末期压力，随心脏收縮力的下降而上升，但是在正常对照组中，实验中显示大致恒定的值(7.0至11.9mmHg)。缺血对照组在低速灌流缺血开始后缓缓上升，缺血后60分钟回到缺血前的流量时，观察到更显著的上升，导致缺血再灌流障碍。5。/。rHSA组显示了与缺血对照组大致相同的变化。另一方面，rHSA-FecycP组在低速流量缺血期间，与缺血对照组相比维持低值，虽然回到缺血前的流量时稍有上升，但是与缺血对照组相比显著下降。左心室内压的最大上升速度，随心脏收縮力的下降而下降，但是在正常对照组中随时间经过缓慢下降，最大停留在约30%的下降。缺血对照组中低速灌流缺血开始后显著下降，虽然缺血后60分钟回到缺血前的流量时上升，但是仅恢复至约60%。5%rHSA组与缺血对照组显示大致相同的变化。另一方面，rHSA-FecycP组在低速灌流缺血期间与缺血对照组显示大致相同的变化，但是回到缺血前的流量时，5分钟后恢复到与正常对照组大致相同的值。低速灌流结束后5分钟、20分钟和30分钟时，与缺血对照组相比显示显著的高值。因此，显然rHSA-FecycP抑制了由心脏的缺血以及缺血再灌流引起的心功能障碍。以上，rHSA-FecycP使在各种组织中由于出血、血管闭塞或者血管狭窄等而下降的血流量增加，并且改善功能障碍，因此显然本药剂作为循环障碍改善剂是有用的。本申请发明的包合化合物可以作为循环障碍治疗剂用于各种医疗用途，可以应用于伴随各种疾病/症状的循环障碍。权利要求1.一种循环障碍改善剂，其含有使卟啉金属络合物包合在白蛋白中而形成的化合物。2.如权利要求l所述的循环障碍改善剂，其中卟啉金属络合物为铁络合物。3.如权利要求l所述的循环障碍改善剂，其中铁处于2价状态。4.如权利要求l所述的循环障碍改善剂，其中白蛋白为人血清白蛋白或者重组人血清白蛋白。5.如权利要求1所述的循环障碍改善剂，其中白蛋白由聚合物进行修饰。6.如权利要求l所述的循环障碍改善剂，其中聚合物为选自由聚乙二醇、葡聚糖和聚氨基酸构成的组中的至少一种聚合物。7.如权利要求l所述的循环障碍改善剂，其中吓啉金属络合物为通式(1)表示的化合物，通式(1)式中，R4表示可以具有取代基的链状或脂环式烃基，R2表示下述通式(3)表示的取代基，M表示元素周期表第6至10族的过渡金属原子或金属离子，X—表示卤素离子，X—的个数表示金属离子的价数减去2所得的数，通式(3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式中，R3表示d至ds的垸基，或者表示通式(4)表示的基团，通式(4)式中，R4表示低级烷基，R5表示Q至do的亚烷基。8.如权利要求1所述的循环障碍改善剂，其中，卟啉金属络合物为通式(2)表示的化合物，式中，R2表示下述通式(3)表示的基团，M表示元素周期表第6至IO族的过渡金属原子或金属离子，X—表示卤素离子，X—的个数表示金属离子的价数减去2所得的数，通式(3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中，R3表示Q至d8的烷基，或者表示通式(4)表示的基团，通式(4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中，R4表示低级垸基，R5表示C,至d。的亚烷基。9.如权利要求l所述的循环障碍改善剂，其中，卟啉金属络合物为通式(5)表示的化合物，通式(5)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中，&表示可以具有取代基的链状或脂环式烃基，R4表示低级烷基，Rs表示Q至Cu)的亚烷基；M表示铁、钴或铬、或者它们的离子。10.如权利要求7或8任一项所述的循环障碍改善剂，其中，所述金属原子或者金属离子为铁、钴或铬、或者它们的离子。全文摘要本发明提供一种药物，其作为上述全部循环障碍的预防或者治疗药，能够有效改善循环障碍产生部分的血流循环，充分防止或者改善组织障碍。关于使卟啉金属络合物包合在白蛋白中而形成的化合物，进行了药效研究，结果发现本化合物有效改善循环障碍时的血流下降，充分防止或者改善组织障碍，最终完成了本发明。即，本发明为一种循环障碍改善剂，其包含使卟啉金属络合物包合在白蛋白中而形成的化合物。文档编号A61K31/409GK101175490SQ200680016310公开日2008年5月7日申请日期2006年4月27日优先权日2005年5月12日发明者佐藤诚,大川裕纪,弘津一郎,桑田有纪子,野迫正则,铃木佐绪里申请人:尼普洛株式会社