专利名称：1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷(莰烷、菠烷,樟烷)类似物及其衍生物在治疗氧化损伤神 ...的制作方法
1，7，7-三甲基二环[2.2.1]庚垸(莰烷、菠垸，樟烷)类似物及其衍生物在治疗氧化损伤神经性疾病中的新用途[技术领域]本发明涉及l,7,7-三甲基二环[2.2. l]庚烷(莰垸、菠烷，樟烷)衍生物及其类似物在治疗老年痴呆、帕金森病等氧化损伤神经性疾病中的新用途。[背景技术]近年来越来越多的证据显示，多种神经退行性病变与氧化应激密切相关，如缺血性脑 损伤、阿尔茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)、巾白金森病(Parkinson diease， PD)、 脊髓损伤(spinal cordinjury， SCI)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)等。PD是一种老年性进行性神经系统疾病，其主要的病理改变为中脑黑质多巴胺(dopamine， DA)能神经元变性坏死，造成纹状体DA含量下降，结果出现震颤、肌肉僵直、运动迟缓与 体位不稳等症状。黑质多巴胺能神经元丧失的病因和机制一直受关注，越来越多的研究发现 氧化应激、自由基损伤是多种因素所致的多巴胺能神经元死亡的共同通路，也被认为是PD患 者黑质神经元死亡的主要因素。脑缺血又称中风，是临床上常见病。其发病机制很复杂，涉及到酸中毒、钙超载、自由 基、兴奋性氨基酸毒性、炎性细胞因子损害等多个方面，其中自由基机制是目前研究较多的 一方面。脑缺血时氧供减少，ATP分解，脑组织供血不足，引起谷氨酸释放及Ca2 +通道开 放，细胞内Ca2+增加，其后果是产生自由基。产生的自由基作用于多价不饱和脂肪酸发生 氧化反应，诱导DNA 、 RNA 、蛋白质的交链和氧化反应，使多糖分子解聚，线粒体变性，细 胞凋亡或坏死。AD是最常见的神经系统退变性疾病，它是一种多因异质性疾病，其发病原因包括多种因 素。其发病中涉及细胞骨架蛋白异常修饰、A3沉积({3-myloid d印o sition)、神经炎毯 形成等病理过程，最终脑病理特征是大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle ，NFT)、 大量老年斑和脑皮质萎縮。AD伴有神经元丢失，近几年氧化应激在AD神经元丢失中倍受关 注，且有许多研究表明自由基参与了 AD的发病，而引起神经元丢失的自由基被认为是由A e产生的，自由基通过细胞膜的脂质过氧化破坏细胞，使神经元大量丢失，引起AD。MS是一种自身免疫性疾病， 一种中枢神经系统脱髓鞘疾病，自山基损伤与MS发病密切 相关。MS存在着自由基产生过多，氧化应激程度增强，髓鞘膜磷脂的脂质过氧化及由此引起 的髓鞘变性和破坏。自由基清除剂尿酸能维持血脑屏障的完整性，阻止炎症细胞浸入中枢神经系统，从而有效治疗MS。抗氧化剂也能明显减轻MS的严重程度。氧化应激在上述神经系统疾病的发生、发展中有着重要作用，因此抗氧化剂有着预防和 治疗这类疾病的作用。文献"华西药学杂志，1989 ，4(1) :23 - 25."报道了异龙脑能延长小鼠耐缺氧的时间， 还能显著延长戊巴比妥引起的小鼠睡眠时间，与戊巴比妥产生协同作用，异龙脑的这一作用尤 为显著；文献"华西药学杂志，1990 ，5(3) :190-191."异龙脑具有抗菌作用，异龙脑还能 显著抑制巴豆油所致的小鼠耳廓肿胀。其可能机制异龙脑具有拮抗PGE和抑制炎性介质释放 的作用。可见，异龙脑具有很强的抗氧化、抗炎作用，并有神经保护作用。至今为止，还没有发现任何关于1,7,7-三甲基二环[2.2. l]庚烷(莰烷、菠烷，樟烷)及 其衍生物即异龙脑在治疗帕金森病中的报道，对于其它氧化损伤神经系统疾病的治疗也缺乏 系统评价。本实验室通过细胞水平、动物水平的反复验证，从而完成了本发明。本发明目的就是提供一种治疗帕金森病的新药物。通过实验验证，1，7,7-三甲基二环 [2.2.1]庚烷-2-羟基即异龙脑可以抑制神经毒剂6-羟基多巴胺导致的SH-SY5Y细胞活力丧 失，并能抑制帕金森病大鼠模型纹状体多巴胺含量的降低。本发明的目的涉及1,7，7-三甲基 二环[2.2. l]庚烷(莰烷、菠烷，樟烷)类似物及其衍生物在治疗帕金森病中的新用途。根据本发明，本发明的药物可以按本领域已知方法配成，片剂、胶囊、粒剂、注射液等。根据本发明，本发明可以制成各种不同的剂型，或合其他化合物组合制成各种不同的剂型， 通过不同的给药途径用于氧化损伤神经系统疾病(如帕金森病)。本文中所用的术语"治疗"指治疗、治愈、缓和、减轻、改变、矫正、改善或预防氧化损 伤神经系统疾病(如帕金森病)。本发明的实施对严重危害人类健康的氧化损伤神经系统疾病(如帕金森病)的治疗具有重 要的社会效益和经济效益。 [
]结合图表
本发明的具体实施方法[发明内容]图1化合物异龙脑对SH-SY5Y细胞增值的影响图2化合物异龙脑对6-羟基多巴胺(6-0HDA)导致的SH-SY5Y细胞活力丧失的影响 请加入对R0S，膜电势影响数据。表1化合物异龙脑对帕金森病模型大鼠纹状体多巴胺含量影响的检测 [具体实施方式
]通过以下实施例来阐述本发明所述药物异龙脑体外及体内神经保护作用进行评价，但并不限 于以下途径。这些生物实验中主要包括1.化合物异龙脑对细胞毒性检测；2.化合物异龙 脑对6-羟基多巴胺(6-0HDA)导致的SH-SY5Y细胞活力丧失的影响；3.化合物异龙脑对帕金 森病大鼠模型纹状体多巴胺含量影响的检测。 [实施例一]化合物异龙脑细胞毒性检测 材料与方法1. SH-SY5Y细胞培养SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100 IU/ml青霉素、lOO^g/ml链霉素的DMEM 培养基中，于37'C、 5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后， 将SH-SY5Y细胞接种96孔板，2乂105细胞/孔，37°C， 5% 0)2孵育24小时，待长至80 90% 细胞汇合后，进行给药实验。2. 化合物异龙脑对SH-SY5Y细胞增值的影响SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100 IU/ml青霉素、100一1的DMEM培养 基中，于37°C 、5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将SH-SY5Y 细胞接种96孔板，2Xl()S细胞/孔，37°C， 5%(:02孵育24小时，待长至80~90%细胞汇合后， 将化合物异龙脑以终浓度2. 5uM/L、 5uM/L、 10uM/L、 20uM/L、 40uM/L、 80uM/L分别 给药，每浓度3孔，同时设无药物细胞对照和空白对照，37°C， 5% C02培养，24小时后观察 结果。每孔加入终浓度为500ug/ml的MTT，避光37。C， 5%0)2培养3小时，在多标记检酶联 免疫检测仪(VICTOR Wallac 1420 Multilabel Counter, TurKu, Finland)上测定570nm处 吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。3. 化合物异龙脑作用结果的处理与统计异龙脑对SH-SY5Y细胞增殖的影响以不同组别吸光度值相对无药物细胞对照组的百分 比表示=(A570给药一A570空白)/ (A570对照——A570空白)*100结果用Origin Pro 7.5进行统计分析。结果化合物异龙脑以2倍稀释为浓度梯度的6个浓度处理SH-SY5Y细胞过程中，每円在倒置 显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有明显的变化。实验独立重复 三次，MTT检测结果见图1。异龙脑在2.5 40nmol对细胞均没有毒性。 [实施例二]化合物异龙脑对6-羟基多巴胺(6-OHDA)导致的SH-SY5Y细胞活力丧失的影响 材料与方法1. SH-SY5Y细胞培养 方法见实施例一2. 化合物异龙脑对6-羟基多巴胺(6-0HDA)导致SH-SY5Y细胞活力丧失影响的检测SH-SY5Y细胞在含1(^胎牛血清(Gibco)及100 IU/ml青霉素、100^ig/ml的DMEM培养基中， 于37'C、 5%0)2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将SH-SY5Y细 胞接种96孔板，2Xl()5细胞/孔，37°C， 5%0)2孵育24小时，待长至80 90%细胞汇合后，其中 一组将化合物异龙脑以终浓度2.5uM/L、 5uM/L、 10uM/L分别给药，每浓度3 L，然后给予 6-羟基多巴胺(终浓度为10(Vnol/L);另外一组将化合物异龙脑以终浓度2.5uM/L、5uM/L、 10wM/L分别给药，每浓度3孔，培养3个小时后，用无血清DMEM培养基洗三次，然后给予6-羟基多巴胺(终浓度为100网ol/L)，同时设无药物细胞对照和空白对照，37°C， 5y。C0溜养， 24小时后观察结果。每孔加入终浓度为500ug/ml的MTT，避光37。C， 5% 0)2培养3小时，在多 标记检酶联免疫检测仪(VICTOR Wallac 1420 Multilabel Counter, TurKu， Finland)上测 定570nm处吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。3. 化合物异龙脑作用结果的处理与统计异龙脑对6-羟基多巴胺导致SH-SY5Y细胞活力丧失的影响以不同组别吸光度值相对无 药物细胞对照组的百分比表示=(A570给药一A570空白)/ (A570对照_—A570站)*100结果用Origin Pro 7.5进行统计分析。结果实验独立重复三次，MTT检测结果见图2。异龙脑对6-羟基多巴胺导致SH-SY5Y细 胞活力丧失呈剂量依赖的抑制作用。异龙脑的保护作用主要发生在胞内。[实施例三]化合物异龙脑对帕金森病模型大鼠纹状体多巴胺含量影响的检测材料与方法1. SD大鼠培养选用健康成年SD雄性大鼠40只，体重200~300g之间，由军事医学科学院动物实验中心 提供。大鼠饲养环境温度25'C 。2. 化合物异龙脑对帕金森病模型大鼠纹状体多巴胺含量影响的检测帕金森大鼠模型制作定向注射微量6-OHDA法用3。/。(co)的戊巴比妥钠(30mg/kg)腹 腔注射麻醉大鼠，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上,前后囟相平，暴露颅骨,清洁骨面。参照 Paxinos和Watson鼠脑立体定位图谱确定黑质致密带坐标为前囟后5. 3 mm,矢状缝向右旁丌 2.0mm.,自脑膜下深度为7.6mm。牙科钻打孔，用10 u L微量注射器注入4 u L质量浓度为2 u g/ U L的6-OHDA和0. 2 mg/ml维生素C注射液,推注速度l y L /min，注射毕留针5min,缓慢退针,钻 孔处填入明胶海绵止血,缝合皮肤。术后连续腹腔注射青霉素100万U / ( kg d- 1 ) 3 d以防 治感染。假手术对照组则向黑质致密带内注入同等剂量(4 u L) 0. 2 mg/ml维生素C注射液。 动物分组及处理治疗性用药实验于40只大鼠中选用8只为对照组(灌胃等体积生理盐水)。 将其余32只造成帕金森病模型，均造模成功。随机分为4组，每组8只异龙脑高剂量治疗组 (按100mg/kg剂量灌胃异龙脑溶液)，异龙脑中剂量治疗组(按30mg/kg剂量灌胃异龙脑溶液)， 异龙脑低剂量治疗组(按10mg/kg剂量灌胃异龙脑溶液)，模型组(灌胃等体积生理盐水)。 给药l次/天，连续14天。旋转行为观察指标旋转行为检测，腹腔注射阿朴吗啡0.5mg/kg(0.5g/L,Sigma)诱发大鼠 产生向左旋转，记录阿朴吗啡注入后,30min内的旋转圈数。恒定向左转，转数》210r/30min 定为成功的帕金森模型。纹状体多巴胺含量检测治疗性给药组于给药14天后将各组大鼠断头，迅速取出大脑， 在冰盘上分离双侧纹状体，一70'C保存，分析天平称湿重，按100nl/10mg加入0.32mol/L的蔗 糖溶液，制成匀浆，加入等量0.4mol/L高氯酸溶液，振荡混匀后，以12 000r/min离心4min， 取上清液置于一5(TC冰箱24小时后取出真空抽干，加入双蒸水至适当浓度倍数，采用高压液 相色谱仪紫外检测器测定多巴胺浓度。3. 化合物异龙脑作用结果的处理与统计对帕金森病大鼠治疗性给药后大鼠双侧纹状体多巴胺含量的影响。结果用Origin Pro 7. 5进行统计分析。结果高压液相色谱仪紫外检测器测定多巴胺浓度结果见表1。异龙脑治疗性给药能够剂量依赖的 抑制帕金森大鼠模型纹状体多巴胺含量的降低。组别 剂量(mg/kg) 健侧 患侧对照组 0 13. 12±1.03 12.78±0.95模型组 0 13. 10±0.86 2. 31±0.5L++异龙脑低剂量治疗组 10 13.07±0.95 6.53±0.63**异龙脑中剂量治疗组 30 13.17±1.11 9.57±0.51**异龙脑高剂量治疗组 100 13.20±0.78 12.28土1.01林表l异龙脑治疗性给药对帕金森病大鼠纹状体多巴胺含量的影响(x±S,n=8, ug/g)
权利要求
1. 下式的1，7，7-三甲基二环[2.2.1]庚烷(莰烷、菠烷，樟烷)类似物及其衍生物在治疗氧化损伤神经性疾病中的新用途。id="icf0001" file="A2007100033590002C1.gif" wi="33" he="32" top= "45" left = "28" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R1和R2可以相同或不同，分别为氢、氧(羰基)、氮(如肟、缩氨基脲结构)、羟基、氨基、C1-6烷基、C1-6羧酸基。
2.根据权利要求1的用途，1，7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷类似物及其衍生物可为下式的1,7，7-二甲基.—环 [2.2.1]庚垸-2-羟基(2-羟基莰烷，冰片)。<formula>formula see original document page 2</formula>其中母核1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷-2-羟基可为下面立体异构体或光学异构体的任何一个或两个，其中 以(+)-Isoborneo1或(-)-Isoborneol优先；<formula>formula see original document page 2</formula>R可为氢、糖基(五碳糖或/和六碳糖；糖基个数《3)、 Cl6院基、C,—6酰基，3(4)-羟基苯甲酰基、3, 4 -二羟基苯甲酰基、肉桂酰基、咖啡酰基、绿原酰基、奎宁酰基。
3. —种用于治疗氧化损伤神经性疾病的药物组合物，其包括作为活性成份的权力要求i的1，7,7-:-:甲基二环[2.2.1]庚烷(莰烷，菠烷，樟烷)类似物及其衍生物和权力要求2所要求的1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷 -2-羟基(2-羟基莰烷，冰片)的衍生物,及药用赋性体或载体。
4. 权力要求3的药物组合物或各单体与其它治疗氧化损伤神经性疾病药物联用，在治疗氧化损伤神经性疾 病中的用途。
5. 权力要求3的药物组合物，其中所述药物组合物或各单体可被配制成片剂、胶囊、注射液或其它剂型。
全文摘要
本发明涉及1，7，7-三甲基二环[2.2.1]庚烷(莰烷、菠烷，樟烷)类似物及其衍生物在用于治疗氧化损伤神经性疾病中的新用途。1，7，7-三甲基二环[2.2.1]庚烷(莰烷，菠烷，樟烷)类似物及其衍生物和1，7，7-三甲基二环[2.2.1]庚烷-2-羟基(2-羟基莰烷，冰片)的衍生物，及药用赋性体或载体的药物组合物，以及药物组合或各单体与现有其它治疗氧化损伤神经性疾病药物联用，在治疗氧化损伤神经性疾病(如帕金森病)中的用途。
文档编号A61K9/20GK101239053SQ200710003359
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者喆 周, 王升启, 王学军, 田琳琳, 程畅河, 贾高龙 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所