专利名称：：丹酚酸b及其盐类在治疗帕金森病中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及丹酚酸B及其盐类在治疗帕金森病中的用途。技术背景丹参是我国传统医学中的常用药，临床主要用于治疗心、脑血管疾病和与之相关的各类疾病。丹酚酸B是丹参的主要有效成分，含量高、药效强，现有技术中对其应用进行了广泛的研究。己知丹酚酸B可能的医药用途包括1、心脑血管疾病，包括冠心病、心绞痛、心衰、心律失常、脑梗塞、脑缺血等。见中国专利99112300.X、02155004.2、200410026913.7、200410048799.8。2、抗肿瘤。见中国专利02136970.4、200510028311.X。3、抗纤维化疾病。见中国专利200410067903.8、200510115662.4。4、抗消化性溃疡。见中国专利02144771.3。5、抗病毒。见中国专利01110378.7。6、抗老年痴呆。见中国专利200610035481.5。在ZL0216077L0、ZL03151476.6号专利中，提供了从丹参中提取丹酚酸B的工艺方法。帕金森病是以进行性运动功能障碍为主要表现的中枢神经系统变性疾病，目前的治疗药物主要包括多巴胺类制剂、多巴胺受体激动剂或促进多巴胺释放、抑制其降解的药物。这些药物由于副作用或使用不方便，尚不能达到令人满意的治疗效果，寻找和开发新的治疗或预防帕金森病的药物具有重大的社会和经济效益。
发明内容本发明的目的在于提供丹酚酸B及其盐类在制备治疗帕金森病的药物中的新用途。本实验室经过对丹参各种单体的反复筛选，并通过细胞、动物水平的反复验证，证明丹酚酸B可以抑制神经毒剂6-羟基多巴胺导致的SH-SY5Y细胞活力丧失，并能抑制帕金森大鼠模型纹状体多巴胺含量的降低，从而完成了本发明。本发明中所述"丹酚酸B"包括丹酚酸B及丹酚酸B盐。丹酚酸B可以是植物中提取的单体化合物，也可以是化学合成的丹酚酸B，还可以是含丹酚酸B的提取物。丹酚酸B盐主要指水溶性盐，其阳离子可以为碱金属或碱土金属，如钠、钾、镁等，优选为镁离子。丹酚酸B可与药学上可接受的载体按本领域已知方法制备成各种药物组合物，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等；或和其他中药单体组合制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于帕金森病治疗。本发明具有以下优点-1、发现了丹酚酸B的新的医疗用途。2、丹酚酸B作为常用中药丹参的已知提取物，来源广，原料易得，安全性大，药用前景广阔。3、丹酚酸B对改善脑部血流量、保护神经细胞也有较强作用，这些特点有助于帕金森病的治疗，改善患者生存质量。图1丹酚酸B对SH-SY5Y细胞增值的影响图2丹酚酸B对神经毒剂6-羟基多巴胺导致的SH-SY5Y细胞活力丧失的保护作用具体实施方式以下通过以下实施例来阐述本发明所述药物丹酚酸B体外及体内神经保护作用进行评价，但并不限于以下途径。这些生物实验中主要包括1.化合物丹酚酸B细胞毒性检测；2.化合物丹酚酸B对6-羟基多巴胺(6-0HDA)导致的SH-SY5Y细胞活力丧失的影响；3.化合物丹酚酸B对帕金森大鼠模型纹状体多巴胺含量影响的检测。[实施例一]丹酚酸B细胞毒性检测材料与方法1.SH-SY5Y细胞培养SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素的函EM培养基中，于37'C、5%0)2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将SH-SY5Y细胞接种96孔板，2X105细胞/孔，37°C，5%C02孵育24小时，待长至8090%细胞汇合后，进行给药实验。2.丹酚酸B对SH-SY5Y细胞增值的影响SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培养基中，于37°C、5%C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将SH-SY5Y细胞接种96孔板，2X105细胞/孔，37°C，5呢C02孵育24小时，待长至80~90%细胞汇合后，将化合物丹酚酸B以终浓度0.1yM/L、luM/L、10uM/L、100uM/L分别给药，每浓度3孔，同时设无药物细胞对照和空白对照，37°C，5MC02培养，24小时后观察结果。每孔加入终浓度为500ng/ml的MTT,避光37°C，5%C02培养3小时，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac1420MultilabelCounter,TurKu，Finland)上测定570，处吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。3.丹酚酸B作用结果的处理与统计丹酚酸B对SH-SY5Y细胞增殖的影响以不同组别吸光度值相对无药物细胞对照组的百分比表示=(A570给药一A570空白)/(A570对照一一A570空白)*100结果用OriginPro7.5进行统计分析，与无药物对照组相比*，P〈0.05;**，P〈0.01。结果化合物丹酚酸B以2倍稀释为浓度梯度的6个浓度处理SH-SY5Y细胞过程中，每R在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有明显的变化。实验独立重复三次，MTT检测结果见图1。丹酚酸B在2.540mol对细胞均没有毒性。[实施例二]丹酚酸B对6-羟基多巴胺(6-OHDA)导致的SH-SY5Y细胞活力丧失的影响材料与方法1.SH-SY5Y细胞培养方法见实施例一2.丹酚酸B对6-羟基多巴胺(6-0HDA)导致SH-SY5Y细胞活力丧失影响的检测SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培养基中，于37°C、5%C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将SH-SY5Y细胞接种96孔板，2X105细胞/孔，37。C，5MC02孵育24小时，待长至80~90%细胞汇合后，其中一组将化合物丹酚酸B以终浓度2.5pM/L、5hM/L、10yM/L分别给药，每浓度3孔，然后给予6-羟基多巴胺(终浓度为100mol/L);另外一组将化合物丹酚酸B以终浓度2.5yM/L、5pM/L、10pM/L分别给药，每浓度3孔，培养3个小时后，用无血清固EM培养基洗三次，然后给予6-羟基多巴胺(终浓度为100mol/L)，同时设无药物细胞对照和空白对照，37°C，5%C02培养，24小时后观察结果。每孔加入终浓度为500yg/ml的MTT，避光37°C，5%C02培养3小时，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac1420MultilabelCounter,TurKu，Finland)上测定570nm处吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。3.丹酚酸B作用结果的处理与统计丹酚酸B对6-羟基多巴胺导致SH-SY5Y细胞活力丧失的影响以不同组别吸光度值相对无药物细胞对照组的百分比表示=(A570给药一A570空白)/(A570对照一一A570空白)*100结果用OriginPro7.5进行统计分析，与无药物对照组相比+，P〈0.05;++，P〈0.01;与6-羟基多巴胺组相比*，P〈0.05;**，P〈0.01。结果实验独立重复三次，MTT检测结果见图2。丹酚酸B对6-羟基多巴胺导致SH-SY5Y细胞活力丧失呈剂量依赖的抑制作用。丹酚酸B的保护作用主要发生在胞内。[实施例三]丹酚酸B对帕金森病大鼠模型纹状体多巴胺含量影响的检测材料与方法1.SD大鼠培养选用健康成年SD雄性大鼠40只，体质量20(T300g之间，由军事医学科学院动物实验中心提供。大鼠饲养环境温度25X:。2.丹酚酸B对帕金森病大鼠模型纹状体多巴胺含量影响的检测帕金森大鼠模型制作定向注射微量6-0HDA法用3°/。(w)的戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,将大鼠头部固定于脑立体定位仪上,前后図相平,暴露颅骨,清洁骨面。参照Paxinos和Watson鼠脑立体定位图谱确定黑质致密带坐标为前図后5.3ram,矢状缝向右旁开2.0mm.，自脑膜下深度为7.6mm。牙科钻打孔,用10uL微量注射器注入4uL质量浓度为2yg/nL的6-0HDA和0.2mg/ml维生素C注射液，推注速度1yL/min,注射毕留针5min，缓慢退针,钻孔处填入明胶海绵止血，缝合皮肤。术后连续腹腔注射青霉素100万U/(kgy-1)3d以防治感染。假手术对照组则向黑质致密带内注入同等剂量(4uL)0.2mg/ml维生素C注射液。动物分组及处理治疗性用药实验于40只大鼠中选用8只为对照组(灌胃等体积生理盐水)。将其余32只造成帕金森病模型，均造模成功。随机分为4组，每组8只丹酚酸B高剂量治疗组(按100mg/kg剂量灌胃丹酚酸B溶液)，丹酚酸B中剂量治疗组(按30mg/kg剂量灌胃丹酚酸B溶液)，丹酚酸B低剂量治疗组(按10mg/kg剂量灌胃丹酚酸B溶液)，模型组(灌胃等体积生理盐水)。给药l次/天，连续14天。旋转行为观察指标旋转行为检测，腹腔注射阿朴吗啡0.5mg/kg(0.5g/L,Sigma)诱发大鼠产生向左旋转，记录阿朴吗啡注入后，30min内的旋转圈数。恒定向左转，转数》210r/30min定为成功的帕金森模型。纹状体多巴胺含量检测治疗性给药组于给药14天后将各组大鼠断头，迅速取出大脑，在冰盘上分离双侧纹状体，一70。C保存，分析天平称湿重，按IOO1/10mg加入0.32mol/L的蔗糖溶液，制成匀浆，加入等量0.4mol/L高氯酸溶液，振荡混匀后，以12000r/min离心4min，取上清液置于一5(TC冰箱24小时后取出真空抽干，加入双蒸水至适当浓度倍数，采用高压液相色谱仪紫外检测器测定多巴胺浓度。3.丹酚酸B作用结果的处理与统计对帕金森病大鼠治疗性给药后大鼠双侧纹状体多巴胺含量的影响。结果用0rignPro7.5进行统计分析。结果高压液相色谱仪紫外检测器测定多巴胺浓度结果见表1。丹酚酸B治疗性给药能够剂量依赖的抑制帕金森大鼠模型纹状体多巴胺含量的降低。表1丹酚酸B治疗性给药对帕金森病大鼠纹状体多巴胺含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.一种治疗帕金森病的药物组合物，含药用载体，特征为其活性成分为丹酚酸B及其盐。2.根据权利要求1的药物组合物，其特征为丹酚酸B盐中，阳离子选自碱金属或碱土金属。3.根据权利要求2的药物组合物，其特征为丹酚酸B盐中，阳离子选自钾离子、钠离子、钙离子或镁离子。4.根据权利要求3的药物组合物，其特征为丹酚酸B盐中，阳离子选自镁离子。5.权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物可被配制成片剂、胶囊剂、或注射剂。6.丹酚酸B及其盐在制备治疗帕金森病的药物中的应用。全文摘要本发明涉及丹酚酸B及其盐类在治疗帕金森病中新用途，丹酚酸B及其盐类的药物组合物，以及药物组合物或各单体与现有其它治疗帕金森病药物联用，在治疗帕金森病中的用途。文档编号A61P25/16GK101239057SQ200710003360公开日2008年8月13日申请日期2007年2月6日优先权日2007年2月6日发明者叶志华,喆周,王升启,田琳琳,贾高龙,赵海豹,邢雅玲申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所