专利名称：毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱的应用，尤其涉及毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆，减少APPmRNA和APP蛋白表达的药物中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年期痴呆的主要病因。在AD的发病机制中，淀粉样蛋白(Aβ)的沉积是各种病因的共同通路。实验证实Aβ来源于淀粉样前体蛋白(APP)，如果抑制APP过量表达，能减少Aβ在脑内生成和沉积，因此成为治疗AD的重要靶点。
海风藤(caulis piperis kadsurae)是胡椒科胡椒属植物风藤[Piperkadsura(choisy)Ohwi]的干燥藤茎。中医临床主要用于哮喘、风湿病和关节痛等疾病的治疗，但少见有用于老年性痴呆治疗的报道。
近年，申请人采用Northern blot方法证实了海风藤能选择性抑制APP基因表达，同时采用RT-PCR和免疫组化的方法首次发现了毕拨明宁碱(piperlonguminine)和二氢毕拨明宁碱(dihydropiperlonguminine)能够抑制SK-N-SH细胞淀粉样前体蛋白(APP)mRNA和APP蛋白的表达。这一研究经检索查新，目前国内外尚未见报道。
发明内容
针对现有技术对不足，本发明要解决的问题是提供一种毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆，减少APPmRNA和APP蛋白表达的药物中的应用。
本发明的主要技术路线是1.由福建海风藤提取与分离毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱。
2.自上海中科院细胞所购买人神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)，建立稳定的传代细胞系。
3.海风藤抑制淀粉样前体蛋白(APP)基因表达实验(APP mRNA)建立细胞RNA提取和RT-PCR反应体系。
4.海风藤抑制淀粉样前体蛋白(APP)实验建立细胞总蛋白提取和Western blot反应体系。
本发明所述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆药物中的应用。
其中所述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱能够从细胞水平抑制APPmRNA和APP蛋白的表达。
其中所述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱由福建海风藤分离、提取，毕拨明宁碱与二氢毕拨明宁碱的质量比例为1∶0.8。
上述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱具体由下述方法制得1.海风藤有效成分的萃取1)福建产海风藤购自安徽省亳州中药材市场，经山东大学药学院生药学教研所鉴定为瓦氏胡椒(Piper wallichii)。
2)海风藤药材(18kg)用水提取后，提取液浓缩得到浸膏1788.06g。浸膏加水溶解后，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取相4.577g，乙酸乙酯萃取相37.95g和正丁醇萃取相198.25g。
2.萃取相细胞毒性测定将萃取相的作用浓度均换算成相当生药浓度，以便各萃取相与生药间具有可比性。
使各萃取相的溶液作用浓度在50g/l(相当于生药)以下时，以人神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)进行MTT法检测。
结果显示无明显细胞毒作用。
3.萃取相活性部位的确定1)利用RNA提取和RT-PCR反应体系，分别运用海风藤的三个萃取相合适的浓度(低于50g/l)作用于细胞，观察其抑制作用。
通过实验，最终将海风藤抑制APP基因表达的活性部位确定在乙酸乙酯萃取相。
2)应用蛋白质提取和Western blot的反应体系，再次证实了活性部位为乙酸乙酯萃取相。
4.海风藤的有效成分的确定(1)单体成分的分离与鉴定1)乙酸乙酯萃取相(37.95g)用95％乙醇溶解后，加硅胶拌样，经硅胶(100-200目，1.52kg，10cm×1m)柱色谱，氯仿-丙酮梯度洗脱，收集洗脱流份，500ml/流份，共收集流份151份。其中氯仿-丙酮(9∶1)洗脱流份Fr.31用石油醚-丙酮反复结晶后，得到化合物1(命名为HFT-1)20mg。
2)HFT-1分析根据氢谱、碳谱的数据，并与文献对照，确定HFT-1结晶由化合物A毕拨明宁碱(piperlonguminine，A)和B二氢毕拨明宁碱(dihydropiperlonguminine，B)组成，由其氢谱积分确定在此结晶中A与B的质量比例为1∶0.8。
化合物A、B分子式如下A毕拨明宁碱(piperlonguminine，A) B二氢毕拨明宁碱(dihydropiperlonguminine，B) 为了更好地理解本发明的实质及本发明所述化合物的作用效果，下面结合毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱的药理实验及结果，来进一步阐述其在制备治疗老年性痴呆药物中的应用。
1.单体成分的溶解及施药浓度将海风藤单体成分HFT-1用DMSO溶解使其终浓度为105mg/ml。
加药前用DMSO倍比稀释成1∶16(6.56mg/ml)，1∶32(3.28mg/ml)。
按1ulDMSO药液加入1ml培养基的比例加药，使DMSO浓度为1‰，HFT-1的最终浓度分别为6.56ug/ml和3.28ug/ml。
2.单体成分细胞毒性测定以人神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)进行MTT法检测，结果显示HFT-1两个试验浓度均无明显细胞毒作用(MTT法)。
3.单体成分活性测定1)利用已建立的人神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)，RNA提取和RT-PCR的反应体系试验，结果显示HFT-1能选择性的抑制APP基因表达(mRNA)。(见图1)2)用Western blot的方法从蛋白质水平证实HFT-1能明显的抑制淀粉样前体蛋白(APP)的表达。(见图2)通过上述实验及其结果，可以得出如下结论海风藤抑制APP表达的活性部位是海风藤成分经化学分离的乙酸乙酯萃取相，海风藤的有效成份是毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱，通过RT-PCR和Western Blot证实毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱是海风藤抑制APP表达的有效成分，其较佳的药物浓度为3.28ug/ml～6.56ug/ml，预示毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆的新药开发和应用中，有较为诱人的发展前景。
图1HFT-1选择性的抑制APP基因表达其中左图为APP；右图为18s(参照基因)。
1.正常对照。2.DMSO对照(1‰)。3.HFT-1(3.28ug/ml)。
图中所示，HFT-1(即毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱)在浓度为3.28ug/ml能够抑制SK-N-SH细胞APP mRNA的表达。
图2HFT-1抑制淀粉样前体蛋白(APP)的表达其中上图为APP；下图为β-Actin(参照蛋白)。
1.正常对照。2.阳性对照(生药浓度35g/l)。3.DMSO对照(1‰)。4.HFT-1(3.28ug/ml)。5.HFT-1(6.56ug/ml)。
图中所示，浓度为6.56ug/ml的HFT-1(即毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱)能够抑制SK-N-SH细胞APP蛋白的表达。
具体实施例方式
实施例1 海风藤的有效成分的化学分离提取。
海风藤药材(18kg)用水提取后，提取液浓缩得到浸膏1788.06g。浸膏加水溶解后，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取相4.577g，乙酸乙酯萃取相37.95g和正丁醇萃取相198.25g。乙酸乙酯萃取相(37.95g)用95％乙醇溶解后，加硅胶拌样，经硅胶(100-200目，1.52kg，10cm×1m)柱色谱，氯仿-丙酮梯度洗脱，收集洗脱流份，500ml/流份，共收集流份151份。其中氯仿-丙酮(9∶1)洗脱流份Fr.31用石油醚-丙酮反复结晶后，得到化合物1(命名为HFT-1)20mg。
HFT-1根据氢谱、碳谱的数据，确定该结晶由化合物毕拨明宁碱(piperlonguminine，A)和二氢毕拨明宁碱(dihydropiperlonguminine，B)组成，在此结晶中A与B的质量比例为1∶0.8。
实施例2 毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱对SK-N-SH细胞APPmRNA和APP蛋白表达的影响。
将海风藤单体成分HFT-1(毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱)用少量DMSO溶解(终浓度为105mg/ml)。
加药前用DMSO倍比稀释成1∶16(6.56mg/ml)。
按1ulDMSO药液加入1mlMEM培养基的比例加药，使DMSO浓度为1‰，HFT-1的最终浓度分别为6.56ug/ml。
加入SK-N-SH细胞培养24-48小时，常规提取RNA和进行RT-PCR反应，发现HFT-1能抑制APP mRNA的表达。(见图1)提取SK-N-SH细胞蛋白质，用Western blot方法发现了HFT-1能抑制淀粉样前体蛋白的表达。(见图2)
权利要求
1.毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是所述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱能够从细胞水平抑制APPmRNA和APP蛋白的表达。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是所述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱由海风藤分离、提取，毕拨明宁碱与二氢毕拨明宁碱的质量比例为1∶0.8。
全文摘要
本发明公开了一种毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆药物中的应用，其中所述毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱由福建海风藤分离、提取，毕拨明宁碱与二氢毕拨明宁碱的质量比例为1∶0.8。本发明通过RT－PCR和Western Blot证实毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱是海风藤抑制APP表达的有效成分，其较佳的药物浓度为3.28ug/ml～6.56ug/ml，预示毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱在制备治疗老年性痴呆的新药开发和应用中，有较为诱人的发展前景。
文档编号A61P25/00GK101036639SQ20071001433
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月18日 优先权日2007年4月18日
发明者韩恩吉 申请人:山东大学齐鲁医院