技术领域
本发明涉及一种α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药，提供了制备该大分子前药、纳米尺度自组装大分子前药的方法及其用途，属生物医药技术领域。
背景技术：
顺式二氯二氨合铂(II)，简称顺铂(cis-platin)，为一种周期非特异性药物，能与DNA结合形成交叉键，从而破坏DNA的复制功能。临床实践证明顺铂具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用、且无交叉耐药等特点，为当前联合化疗中最常用的药物之一，是临床抗肿瘤药物的大品种，广泛用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、头颈部鳞癌、甲状腺癌等实体肿瘤的治疗。然而，顺铂低的水溶性，重度消化道反应、骨髓抑制、听神经毒性及易对肾脏造成不可逆损伤等限制了其治疗指数的提高。
吴自荣(Poly(γ，L-glutamicacid)-cisplatinconjugateeffectivelyinhibitshumanbreasttumorxenograftedinnudemice，Biomaterials，2006，27，5958-5965)；K.Kataoka(Novelcisplatin-Incorporatedpolymericmicellescaneradicatesolidtumorsinmice，CancerResearch，2003，63，8977-8983)等，分别将顺铂载于聚(γ，L-谷氨酸)，聚(乙二醇-α，L-谷氨酸)共聚物上，顺铂的水溶性和细胞毒性得到大大改善，将其分别用于裸鼠乳腺癌Bcap-37和实体瘤的治疗，效果良好。但是，上述研究未考虑顺铂与载体之间间隔基的结构，以及载体/顺铂大分子络合物的自组装结构对疗效的影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生物相容性好、水溶性好，具有特异性和缓释性能好的α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药。
本发明的又一目的在于提供α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药的制备方法。
本发明的再一目的在于提供α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药的用途。
本发明所述的α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药的通式为：
[(H3N)2Pt-R-]n-(ASP)
其中间隔基R为氨基一元羧酸(如甘氨酸、丙氨酸等)或氨基多元羧酸(如天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基丙二酸等)；ASP为α，β-聚(L-天冬酰胺)，分子量为10kD-100kD；n为10-60的整数。
本发明所述的α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药化学结构式如下：
为得到α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药，本发明采用的是通过α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物与顺铂通过氨基酸间隔基以配位键相结合而实现的，即间隔基的羧基取代顺铂的氯原子而得到类似卡铂结构的大分子铂配合物。
将顺铂与共聚物载体的二次蒸馏水溶液按不同比例混合，室温避光搅拌反应48小时，然后用二次蒸馏水透析至透析液不使酸化硝酸银溶液变浑浊为止得α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药。
共聚物载体包括α，β-聚(L-天冬氨酸)(PI)、α，β，L-天冬氨酸与[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]共聚物(PII)、[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丙二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIII)、[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丁二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIV)以及[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-戊二酸基)天冬酰胺]共聚物(PV)。各共聚物的合成如下：
(1)α，β-聚(L-天冬氨酸)(PI)的合成
第一步：α，β-聚[L-天冬酰亚胺](PA)的合成，将L-天冬氨酸粉末和磷酸混合于圆底烧瓶中，减压(真空度：0.1-13Pa)熔融反应3-8小时后，冷却，得α，β-聚(L-天冬酰亚胺)预聚物，将预聚物溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入N，N’-二环己基碳酰二亚胺室温缩合反应24h后，过滤，浓缩滤液，产物用蒸馏水沉淀出并干燥得PA。
第二步：将聚合物PA10℃-30℃下用0.1mol/L的氢氧化钠水解，用0.1mol/L的盐酸调溶液pH值至1-5，过滤、浓缩、透析，聚合物PI用乙醇/乙醚沉淀出。
(2)α，β，L-天冬氨酸与[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]共聚物(PII)的合成
第一步：α，β，L-天冬酰亚胺与[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]共聚物(PB)的合成，将乙醇胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴加到聚合物PA的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，10℃-30℃搅拌反应2-4小时。过滤浓缩反应混合物，聚合物PB用乙醇/乙醚混合溶剂沉淀出，用核磁测其开环率。
第二步：将聚合物PB10℃-30℃下用0.1mol/L的氢氧化钠水解，然用0.1mol/L的盐酸调溶液pH值至1-5，过滤、浓缩、透析，共聚物PII用乙醇/乙醚沉淀出。
(3)[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丙二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIII)的合成
将聚合物PB继续用2-胺基丙二酸二苄酯的N，N-二甲基甲酰胺溶液完全开环，苄基用氢溴酸脱去，透析纯化而得共聚物PIII。
(4)[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丁二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIV)，[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-戊二酸基)天冬酰胺]共聚物(PV)的合成
按PIII的方法，改用L-天冬氨酸二苄酯或L-谷氨酸二苄酯开环聚合物PB，则得[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丁二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIV)，[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-戊二酸基)天冬酰胺]共聚物(PV)。
本发明提供一种α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药纳米尺度自组装的新方法，即将顺铂药物通过化学方式载于生物相容性好、水溶性好的高分子载体上，通过离子诱导自组装成纳米凝胶结构。
本发明还提供了α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药在制备治疗实体肿瘤药物中的应用。尤其是α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药在制备治疗卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、头颈部鳞癌或者甲状腺癌药物中的应用。
α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药对宫颈癌Hela细胞的细胞毒性评价。将顺铂及α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药溶于未加小牛血清的RPMI1640培养液中，过滤灭菌。加上述灭菌溶液及培养液共200μL于96孔细胞培养板中(每孔含细胞1*104个)，使呈一定浓度剃度。将上述细胞于二氧化碳培养箱中培养60小时后，每孔加入20μL浓度为5μg/mL的噻唑蓝(MTT)磷酸缓冲溶液，再培养5小时。吸出细胞培养板孔中的上清夜，在每孔中加入200μL二甲亚砜，待固体溶解后于酶标仪上测其550nm处的吸光值。
α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药对肿瘤的抑制作用。将荷瘤(乳腺癌Bcap-37)裸鼠随机分3组，每组6只。第一组尾静脉注射磷酸缓冲溶液，第二组、第三组分别注射5mg/kg，15mg/kg(折合为顺铂浓度)的α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药，记录裸鼠肿瘤体积变化情况。
本发明克服已有技术的缺陷提供一种制备大分子顺铂前药及其纳米尺度自组装的新方法，即将顺铂药物通过化学方式载于生物相容性好、水溶性好的高分子载体上，通过离子诱导自组装成纳米凝胶结构。利用肿瘤组织与正常组织毛细血管壁通透性的差异可以将顺铂前药靶向性输送到肿瘤组织，然后将类顺铂药物缓慢释放出来，从而达到靶向性的治疗效果，降低药物的毒副作用。
附图说明
图1：(a)α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药的红外谱图；(b)α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物的红外谱图(横轴代表波数)
图2：α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物-顺铂大分子前药的细胞毒性(横轴代表载体中铂(II)的浓度，折合为顺铂质量浓度μg/mL，纵轴表示细胞的存活率；曲线：(A)顺铂，CP；(B)PI-顺铂结合物，CPI；(C)PII-顺铂结合物，CPII；(D)PIV-顺铂结合物，CPIV；(E)PV-顺铂结合物，CPV；(F)PIII-顺铂结合物，CPIII)
图3：PIII-顺铂大分子前药(CPIII)对乳腺肿瘤的抑制作用(横轴代表第-次注射后的天数，纵轴为肿瘤体积，mm3，曲线1：CPIII，浓度：15mg/kg；曲线2：CPIII，浓度：5mg/kg；曲线3：PBS)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述：
实施例1：α，β-聚[L-天冬酰亚胺](PA)的合成
在500ml园底烧瓶中加入25克(0.19mol)L-天冬氨酸粉末和12.5克85％的磷酸，混合均匀，于旋转蒸发仪上185℃减压反应3小时至不再有水蒸汽产生为止。加入100mLN，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解固体物，然后在搅拌下将得到的溶液缓慢滴加到盛有500mL水的烧杯中，得白色沉淀，静置，倾去上清液，过滤，将固体用水洗至中性，于60℃真空干燥24小时，得粉状固体α，β-聚[L-天冬酰亚胺]预聚物17克。将预聚物溶于150mLN，N-二甲基甲酰胺中，加入0.2gN，N-二环己基碳酰二亚胺室温缩合反应24h后，过滤，浓缩滤液，产物用蒸馏水沉淀出并60℃真空干燥24小时得PA，产率85％。
实施例2：α，β，L-天冬酰亚胺与[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]共聚物(PB)的合成
将8g(82.5mmol)聚[L-天冬酰亚胺]溶于20mLN，N-二甲基甲酰胺，搅拌下滴加2.5mL(41.3mmol)乙醇胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应2小时，将反应混合物浓缩至10mL，产物用40mL乙醇/乙醚(体积比1∶1)混合溶剂沉淀出后真空干燥，得白色聚合物(PB)8g，用核磁测得开环率为30％(D2O为溶剂)。
实施例3：α，β，聚(L-天冬氨酸)(PI)的合成
将4.5g聚合物PA加入500mL0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，于室温搅拌反应1小时，用0.1mol/L的盐酸调溶液pH值至5，过滤、浓缩至5mL、用二次蒸馏水透析24小时，聚合物用30mL乙醇/乙醚(体积比为1∶1)沉淀出，真空干燥，得聚聚(L-天冬氨酸)(PI)3g.。
实施例4：α，β，L-天冬氨酸与[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]共聚物(PII)的合成
将5g聚合物PB加入500mL0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，于室温搅拌反应1小时，用0.1mol/L的盐酸调溶液pH值至5，过滤、浓缩至5mL、用二次蒸馏水透析24小时，聚合物用30mL乙醇/乙醚(体积比为1∶1)沉淀出，真空干燥，得α，β，L-天冬氨酸与[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]共聚物(PII)3.5g。
实施例5：[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丙二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIII)的合成
将4g聚合物PB得30mLN，N-二甲基甲酰胺溶液滴加入大过量得2-胺基丙二酸二苄酯的150mLN，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应12小时，升温至50℃继续反应12小时，减压浓缩至40mL，产物用60mL乙醇/乙醚(体积比为1∶1)沉淀出，真空干燥得α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丙二酰苄酯)天冬酰胺]共聚物。
将上述共聚物2g，于50℃溶于20mL二氯乙酸中，再加入10mL33％HBr的醋酸溶液，50℃搅拌反应2小时，室温静置过夜。产物用300mL乙醚沉淀出，过滤，真空干燥，得[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丙二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIII)1.2g。
按PIII的方法，改用L-天冬氨酸二苄酯或L-谷氨酸二苄酯开环聚合物PB，则得[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-丁二酸基)天冬酰胺]共聚物(PIV)，[α，β，L-(N-羟乙基)天冬酰胺]与[α，β，L-(N-戊二酸基)天冬酰胺]共聚物(PV)。
实施例6：顺铂与α，β-聚(L-天冬氨酸)的比例对α，β-聚(L-天冬氨酸)-顺铂大分子前药粒径的影响
将顺铂与α，β-聚(L-天冬氨酸)的二次蒸馏水溶液按不同比例混合，于pH7.0(用0.01mol/L的NaOH或盐酸调节)室温避光搅拌反应48小时，然后用二次蒸馏水透析至透析液不使酸化硝酸银溶液变浑浊为止(约36小时)，得α，β-聚(L-天冬氨酸)-顺铂大分子前药，用动态光散射测定大分子前药溶液的粒径、粒径分布，用电感耦合等离子体光谱法测定铂的含量，得出顺铂与α，β-聚(L-天冬氨酸)的比例对α，β-聚(L-天冬氨酸)-顺铂大分子前药粒径的影响图。
实施例7α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药对宫颈癌Hela细胞的细胞毒性评价及数据处理
将顺铂及α，β-聚(L-天冬酰胺)衍生物-顺铂大分子前药(CPI，CPII，CPIII，CPIV，CPV)溶于未加小牛血清的RPMI1640培养液中，过滤灭菌。加上述灭菌溶液及培养液共200μL于96孔细胞培养板中(每孔含细胞1*104个)，使呈一定浓度剃度。将上述细胞于二氧化碳培养箱中培养60小时后，每孔加入20μL浓度为5μg/mL的MTT磷酸缓冲溶液，再培养5小时。吸出细胞培养板孔中的上清夜，在每孔中加入200μL二甲亚砜，待固体溶解后于酶标仪上测其550nm处的吸光值。
每个浓度的5个孔的吸光值以对照组吸光值的均值为标准计算出平均值后(作为细胞存活率Viability)对药物浓度作图。
从图2可看出：Hela细胞的存活率(Viability)均随高分子载体-顺铂结合物(CPI，CPII，CPIII，CPIV，CPV)的浓度增大而减小，但均大于相同浓度顺铂作用于细胞的存活率，即顺铂与高分子结合后，毒性确有所降低。CPI，CPII，CPIII，CPIV，CPV与顺铂比较，其毒性随浓度增大而缓慢增大，说明，顺铂与高分子结合后，能达到缓慢释放的效果。
CPI，CPII，CPIII，CPIV，CPV之间比较，CPIII的毒性最低，可能原因在于：PIII聚合物与顺铂形成的是较为稳定的六圆环结构络合物，而PI，PII，PIV，PV与顺铂形成的是较不稳定的多圆环(大于六圆环)结构络合物，导致CPI，CPII，CPIV和CPV比CPIII的毒性要大。
实施例8PIII-顺铂大分子前药(CPIII)对肿瘤的抑制作用
将荷瘤(乳腺癌Bcap-37)裸鼠随机分3组，每组6只。第一组尾静脉注射磷酸缓冲溶液(PBS)，第二组、第三组分别注射5mg/kg，15mg/kg(折合为顺铂浓度)的PIII-顺铂大分子前药(CpIII)，记录裸鼠肿瘤体积变化情况。
从图3可看出：CPIII对裸鼠乳腺癌Bcap-37有明显的抑制作用，且呈一定的浓度依赖关系，当CPIII以15mg/kg给药时，20天时间内肿瘤生长缓慢(曲线1)；当CPIII以5mg/kg给药时，10天时间内肿瘤生长缓慢，10天以后，肿瘤生长较快(曲线2)；磷酸缓冲溶液没有抑制肿瘤生长的效果。
本项目所得纳米颗粒的粒径用MARLVEN公司ZetasizerNano-ZS型动态光散射(DLS)测试，测试温度为25℃，入射激光波长为633nm。
上述实施例仅用以说明本发明但并不局限于此，应该理解在不脱离本发明的精神范围内还可有多种变通或替换方案。