专利名称：3－[(4－｛(z)－[(2z)－4－氧代－2－(苯基亚氨基)－1,3－噻唑烷－5－亚基]甲基｝苯 ...的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸的用途，尤其涉及该化合物在葡萄球菌抑制剂及制药领域中的用途。
背景技术：
葡萄球菌与医院内感染相关，尤以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌最为密切。表皮葡萄球菌已成为移植手术中发生医源性感染的最主要因素，其所致感染与一些高分子医疗器材，如静脉导管、起搏器、脑脊液引流装置、人工器官等，在体内的留置有关。随着上述医疗材料的频繁使用以及抗生素的滥用，出现了对万古霉素耐药和多重耐药性的表皮葡萄球菌，导致此类医院内感染问题日益严峻，极易发展成为慢性感染，因此存在对新药进行研发的迫切需求。
与传统的药物发现途径相比，计算机辅助药物设计(computer-aideddrug design，CADD)——包括蛋白质空间结构的同源模建技术和基于结构的高通量虚拟筛选技术(SBVS)等——已经成为一种实用化的工具应用于先导化合物的发现，提高获得活性化合物的能力已经被广泛认可。该技术是在微生物全基因组测序的基础上，首先获得靶蛋白的基因序列和氨基酸序列；而后以同源性较高的蛋白质的晶体结构作为模板，对靶蛋白的空间结构进行同源模建；用模建结构进一步在各化合物库中筛选可能与之相互作用的小分子化合物。将该技术与生化实验和生物学实验相结合，能够大大提高药物研发的速度和效率，缩短研究周期。目前使用CADD设计的一些新药已经上市，例如罗氏(Roche)公司的Inviraser，默克(Merck)公司的Indinavi等。
目前已经有十余株葡萄球菌基因组已经测序并公开，为使用计算机辅助药物设计进行抗菌化合物的发现打下良好的基础。色氨酰-tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNA Synthetase，WRS)属于氨酰-tRNA合成酶I类家族，参与细菌基因翻译的全过程，是细菌维持生命活动所必须。其功能是催化色氨酸与tRNAtrp的CCA末端2’-OH之间的酰化反应，是色氨酸进入肽链所必需的过程，因此是整个肽链合成过程中不可缺少的环节；抑制了这一环节即可抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细菌的生长。该酶的氨基酸序列在葡萄球菌中高度保守，而在细菌和哺乳动物之间相似性很低，是理想的药物靶标。
为了解决葡萄球菌在医院内的感染问题，本发明人通过计算机辅助药物设计发现，具有下述结构式I的化合物--3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸在抑制葡萄球菌方面具有显著的效果
该化合物的分子式为C24H18N2O4S，淡黄色粉末状，分子量为430.477，易溶于二甲基亚砜(DMSO)。该化合物可从SPECS公司(荷兰)购买得到。
发明内容
本发明提供了3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸的新用途，即在制药中的新应用。
本发明的一个方面提供了3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸(下文可称为化合物FDDDC03)在制备抑制葡萄球菌的抑制剂中的应用。
在上述技术方案中，所述化合物FDDDC03通过抑制葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的活性而实现抑制葡萄球菌生长的目的。所述葡萄球菌可以为表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。
本发明的另一个方面提供了3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸在制备治疗由葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下文将通过生化实验和生物学实验对化合物FDDDC03抑制表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的活性或抗菌活性进行检测，并观察其对哺乳动物细胞有无毒性。
具体实施例方式
制备实施例1表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶原核表达质粒的构建表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶基因(NC_004461，locus tagSE0685)获取方法如下在正义链引物5′端设计Nco I酶切位点，反义链引物5′端设计NheI酶切位点sense5’-CCCCA TGGAAA CTT TAT TCT CAG GA-3’anti-sense5’-CG GCT AGC TTA TCT TTT TCG ACC TAA GCC C-3’其中加下滑线的序列是Nco I的酶切位点，斜体的序列是Nhe I的酶切位点。
用上述引物经PCR扩增出表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的编码基因。通过限制性内切酶(Nco I和Nhe I)的酶切反应和T4DNA连接酶的连接反应，将上述基因连入pET-28a(+)载体，转化BL21-DE3细菌，挑选卡那霉素抗性菌落，测序证实克隆构建成功。
制备实施例2色氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达和纯化宿主菌大肠杆菌BL21-DE31)挑单克隆菌落接种至5ml LB medium，37℃×250rpm至OD600＝1～2；2)接种10μl至5ml LBK medium，加1M IPTG至终浓度1mM，诱导表达4小时；
3)离心取菌体，用PBS重悬后超声破碎，于4℃以12000转/分钟的转速离心5分钟，取上清液；用Invitrogen公司ProBondTMPurificationSystem提纯蛋白；以12％SDS-PAGE蛋白电泳分析确定目的蛋白的分布。用Bradford法对蛋白质进行定量。
实施例1化合物FDDDC03对表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的活性以及人色氨酰-tRNA合成酶的活性的影响(使用两种方法检测)1)检测底物ATP的减少量——Kinase-GloTMLuminescent KinaseAssay Kit(美国Promega公司)将重组表达、纯化的2μg表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶和3μg人色氨酰-tRNA合成酶分别与梯度稀释的化合物FDDDC03在25℃作用20分钟，然后加入100μMATP(反应总体积50μL)，在25℃作用20分钟后，将反应混合物加入96孔酶标板，每孔50μL，加入Kinase-GloTMReagent每孔50μL室温静置10分钟，读取化学发光值表示反应剩余的ATP的量，实验设不加化合物组为对照组。最后计算化合物FDDDC03对目的蛋白活性的抑制率 2)检测产物焦磷酸的生成量——Pyrophosphate Reagent(美国Sigma-Aldrich公司)将重组表达、纯化的2μg表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶和3μg人色氨酰-tRNA合成酶分别与梯度稀释的小分子化合物混合，加入96孔酶标板，然后加入100μL PyrophosphateReagent，用水补足总体积200μL，在37℃作用30分钟，连续读取OD340，实验设不加化合物组为对照组。最后计算化合物FDDDC03对目的蛋白活性的抑制率。
采用Logit法对两种方法检测的抑制率分别计算半数抑制浓度IC50，其结果示于下表1中。
表1化合物FDDDC03对色氨酰-tRNA合成酶活性的影响
注IC50值即半数抑制浓度，代表化合物抑制反应体系中色氨酰-tRNA合成酶半数催化活性时的浓度。
由上表1中的结果可见，化合物FDDDC03能够较强地抑制表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的活性，而对人色氨酰-tRNA合成酶的活性影响不大。
实施例2表面等离子共振(SPR)技术检测化合物FDDDC03与表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的亲合力将重组表达、纯化的表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶偶联在能量共振生物传感芯片(Biacore CM5型芯片)上，将化合物FDDDC03按两倍梯度稀释，通过Biacore仪器观察化合物FDDDC03与蛋白结合的情况，计算出解离衡常数KD，示于下表2中。
表2化合物FDDDC03与表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的亲合力
注KD值为解离常数，代表化合物与表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶的结合力，其值越小表示结合力越强。
由上表2中的结果可见，化合物FDDDC03与表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶有较强的结合能力。
实施例3化合物FDDDC03对细菌生长的抑制实验(使用美国CLSI推荐的标准试管稀释法)1.将细菌接种于新鲜的MH液体培养基，37℃培养过夜；2.将菌液用新鲜的MH液体培养基将菌液浓度校正至0.5麦氏比浊标准，再用MH液体培养基按1∶200稀释，向每只试管中加入1mL，加入1mL不同浓度梯度的化合物FDDDC03(溶剂DMSO终浓度保持1％)，37℃培养18小时。因化合物FDDDC03溶解于DMSO中，以1％DMSO+细菌作为对照，以无菌培养基为空白对照；3.取出与空白对照比较，细菌不生长的浓度最低的一管即为化合物FDDDC03的最小抑菌浓度，其结果示于下表3中。
表3化合物FDDDC03对表皮葡萄球菌生长的抑制作用
由上表3中的结果可见，化合物FDDDC03对几种表皮葡萄球菌的生长有明显的抑制作用。
实施例4MTT法检测化合物FDDDC03的细胞毒性1.将新鲜培养的Vero细胞接种于96孔板，每孔100μL细胞(约5×104细胞)，37℃，5％CO2条件下培养24小时，使细胞长成单层；2.弃去培养基，加入100μL/每孔新鲜的MEM培养基，其中含有不同浓度的化合物FDDDC03(溶剂DMSO终浓度保持1％)，每个样品采用6复孔上样，37℃，5％CO2条件下继续培养24小时。因化合物FDDDC03溶解于DMSO中，因此设1％DMSO+细胞为对照；3.每孔加入10μLMTT标记物，37℃、5％CO2条件下培养4小时；4.每孔加入100μL溶解液，37℃、5％CO2条件下培养过夜；5.将96孔板取出读取OD570值，每个样品读数取6复孔的均值，计算不同浓度的化合物FDDDC03对Vero细胞生长的抑制率
半数抑制量CC50值采用Logit法计算。
未观察到化合物FDDDC03对Vero细胞具有毒性，结果示于下表4中。
表4化合物FDDDC03对Vero细胞的毒性作用
上述实施例1～4的结果显示，本发明中所述的化合物FDDDC03与目的蛋白表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶有很强的结合力，且能够明显抑制该酶的活性，而对人色氨酰-tRNA合成酶的活性影响很小。FDDDC03能够显著抑制表皮葡萄球菌的生长，其在最小抑菌浓度时对哺乳动物细胞基本无毒性。
权利要求
1.3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸在制备抑制葡萄球菌的抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述葡萄球菌为表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。
3.3-[(4-{(Z)-[(2Z)-4-氧代-2-(苯基亚氨基)-1，3-噻唑烷-5-亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸在制备治疗由葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述葡萄球菌为表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，具体涉及3－[(4－{(Z)－[(2Z)－4－氧代－2－(苯基亚氨基)－1，3－噻唑烷－5－亚基]甲基}苯氧基)甲基]苯甲酸的用途，尤其涉及该化合物在葡萄球菌抑制剂及制药领域中的用途。该化合物与目的蛋白表皮葡萄球菌色氨酰－tRNA合成酶有很强的结合力，且能够明显抑制该酶的活性，而对人色氨酰－tRNA合成酶的活性影响很小。该化合物能够显著抑制表皮葡萄球菌的生长，其在最小抑菌浓度时对哺乳动物细胞基本无毒性。
文档编号A61P31/00GK101091710SQ20071004341
公开日2007年12月26日 申请日期2007年7月4日 优先权日2007年7月4日
发明者于坤千, 蒋华良, 吴旸, 瞿涤, 沈旭 申请人:中国科学院上海药物研究所, 复旦大学